Name: לדמיין את הלב הפועם תסיסנית /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-28T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למד טכניקות לדימוי הלב הפועם בדרוזופילה בשלבי הזחל והבוגר. השיטות כוללות ניתוח ושימוש בדבק היסטואקרילי לקביעה, המאפשרות מחקר פיזיולוגיה לבבית ופיתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ק.א. נתמך על ידי מענק מטעם איגוד הלב האמריקני.

לפני שתתחיל למבוגרים לבבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין hemolymph מלאכותי (א.ה.) תמיסה המכילה 108mM Na +, 5mm K +, 2mm Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1mm לאא 2 PO 4, 4 מ&quot;מ NaHCO 3, סוכרוז 10mm, trehalose 5mm, HEPES 5mm (pH 7.1, כל ריאגנטים מ סיגמא כימיקלים). סוכרוז ו trehalose יש להוסיף AH מפתרונות מניות בקירור רק לפני השימוש כדי למנוע זיהום חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מביאים לטמפרטורת החדר AH פתרון חמצן על ידי מבעבע האוויר דקות לפחות 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימים מצוין מספר (למשל זכוכית נימים, 100ul, VWR) נדרש להסרת שומן. </li></ol> הזחל לבבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sylgard מצופה coverslips: באמצעות העברה, קיסם על 50-70μl של פתרון Sylgard על coverslip 22x22mm. תן להקשיח Sylgard ב 65 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Broadie ו חיץ של בייט (135mm NaCl, KCl 5 מ&quot;מ, 4 מ&quot;מ MgCl 2, 2mm CaCl 2, TES 5mm, סוכרוז 36mM;. PH 7.15 ראה Broadie ו בייט, 1993). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את הכלים הדרושים כדי ליישם את הדבק histoacryl. ראשית, למשוך כמה נימים קנס (למשל מוצרים המדע GB100T8P). חבר קצה פיפטה 1.5ml עם צינורות פלסטיק קטנה (Tygon, 1 / 32 &quot;) על ידי הוספת את הקצה הקטן יותר לתוך הצינור. הכנס נימי עם פתח רחב שלה לקצה השני. טען את נימי עם דבק Histoacryl על ידי טבילה נימי לתוך טיפת דבק שאיבה עדינה לתוך קצה הפלסטיק. כאשר עובדים עם דבק אחד צריך כוס שנייה נימי בהישג יד כדי להסיר דבק יתר מקצה הדבק נימי. הוא דבק נוזלי עד שהוא בא במגע עם מי מלח שנאגרו בו יהיה להקשיח בתוך כמה שניות. עם זאת, בדרך כלל נשאר פלסטיק מספיק זמן כדי להסיר את הדבק קצה נימי או תוך יישום זה הדגימה. </li></ol> חצי שלם תסיסנית הלב מן טוס למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למבוגרים זבובי תסיסנית מורדמים עם שנאפ Fly (קרוליינה ביולוגית אספקת ושות) במשך 2-5 דקות. יש להקפיד לא לצאת זבובים שנאפ Fly עבור חשיפות ארוכות יותר. חשיפה לטווח קצר לקור יכול לשמש גם כדי להרדים זבובים אבל CO 2 אינה מומלצת שכן יש כבר השפעה מתמשכת על קצב הלב ואת המקצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זבובים הרדים ממוקמות, צד הגב למטה, לתוך צלחת פטרי מצופה בשכבה דקה של וזלין. לציפורן הידרופובי את הכנפיים והגוף הפיך &quot;לתקוע&quot; את ג&#39;לי אבל לעוף ניתן למקמו מחדש במידת הצורך. זה הופך להיות חשוב במיוחד במהלך מניפולציות הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך הראשונית נעשית באמצעות זוג מספריים המעוגל של האביב (Roboz # 5611). להבי מספריים מושמים תחת הרגליים בזווית לעבר השטח הגבי של החזה ליד הצוואר. ראש, כבל עצב הגחון, והרגליים יוסרו עם חתך אחד. הכנה הוא שקוע אז hemolymph, מחומצן פתרון מלאכותי (AH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים האביב בקצה האחורי של הבטן (המורכב מקטעי בטן 7 ו - 8) מוסר עם חתך אחד. זה מספק גישה לביצוע קיצוץ רוחבי לאורך שני הקצוות של הבטן משמש כדי לנתק את הקשר בין המעי האחורי ואת לציפורן הבטן. דש משוחררים של לציפורן בטן הגחון מוסר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלבים 3 ו 4 חיבורי הקדמי ואת האחורי של הבטן, נותקו כל כך את אברי הבטן מוחזקים כעת רק על ידי tracheols במקום. הבטן ואת אברי הבטן האחרים בדרך כלל ניתן להסיר כגוש אחד באמצעות מלקחיים של צורף (Roboz, # 55) ועדין מושכת. הסרת איברים פנימיים חושף את הצינור הלב הפועם עדיין מחוברת לציפורן הגב מוקף גופים שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגופים שומן הן אטומות למדי מיקרוסקופ האור וכתוצאה מכך הוא לעתים קרובות יש צורך להסיר חלק זה של שומן על מנת לראות את צינור לב בבירור. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בטכניקה של שאיבת שומן נמשך דק זכוכית הנימים. נימים מתבצעות בעזרת פיפטה תקן חולץ (למשל סאטר P-97 פיפטה פולר) ו מוכנסים מכן לתוך צינורות פלסטיק (Tygon, 1 / 16 &quot;), מחוברת למקור ואקום. מערכת זו משמשת כדי יניקה את עודפי השומן מן סביב הצינור לב. כוח יניקה הוא יחסי בקוטר טיפ כך pipettes עם טיפים גדול יותר בקוטר 40 מיקרון לא אמור לשמש. זהירות קיצוניים צריך לנקוט כדי להימנע מלגעת בלב עצמו, כי את החלק האחורי של הלב היא שברירית מאוד באזור יש להימנע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור הלב המבוגר תסיסנית נחשפת עכשיו צריך להכות. אם יש צורך בלב לציפורן בצירוף ניתן למקמו מחדש על ידי הסרת לציפורן בעדינות מתוך ג&#39;לי נפט בזהירות בטישה אותו בחזרה למטה, שוב להימנע מכל מגע עם הרקמה בלב. ב tהנקודה שלו הפתרון רחצה והכנת יש להחליף אהל טריים. הכנה זו יש לאפשר לאזן עבור 20-30 דקות עם חמצון לפני כל המניפולציות. אם ההכנה היא להישמר במשך יותר מ -60 דקות הוא צריך להיות עם perfused אהל טריים. </li></ol> משתק תסיסנית הזחלים הקלטה אופטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפת דבק Histoacryl קרוב לפינה כל אחד coverslips Sylgard. הוסף 50μl של חיץ B &amp; B של טיפות דבק אשר להקשיח מייד. למלא את החלל בין נקודות מודבק עם B &amp; B - דבק ימשיך החיץ בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו הזחל נודד L3 ולמקם אותו על פיסת נייר רטובה על קרח דק &#39;2. זה יהיה להאט את תנועתה. ואז להעביר את זחל לתוך המאגר ואת לכוון אותו עם הצד הגבי מעלה (זה הצד של הזחל כי חסרה את חגורות denticle). להחיל במהירות קצת דבק בין אזור הראש ואת Sylgard. דבק להקשיח יהיה מהר מאוד למנוע את ראשו של הזחל לנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ובזהירות לתפוס את החיה על ידי spiracles האחורי ובעדינות למתוח אותו. לתקן את הזחל בתפקיד זה על ידי יישום דבק לאורך שני הצדדים של הזחל במחצית האחורי. כדי לצמצם תנועה נוספת של לציפורן על ידי השרירים בגוף הקיר, להוסיף דבק יותר את צלעותיה של הבהמה. הזחל הוא קבוע עכשיו במצב הזה. Coverslip ניתן להציב לתוך צלחת פטרי קטן מלא אהל או PBS. פעימות הלב יכול עכשיו להיות מוקלט ללא הפרעה מן הקיר תנועות הגוף. </li></ol> נציג תוצאות: בלב חצי שלם תסיסנית הבוגרת תנצח בקצב שעות לאחר הניתוח, כאשר נשמר, AH טרי מחומצן (ראה נתונים משלימה, Ocorr, et al. 2007). למשל נציג מוצג סרט 1. לבבות של הזחל 3 rd instar וזבובים צעירים (1 - 3 שבועות eclosion פוסט) בדרך כלל התערוכה פעימות לב קבוע בשיעורים שבין 1 ל - 3 הרץ. זבובים מעל גיל 3 שבועות, בדרך כלל הם arrhythmic יותר, ובכל זאת הלב אלה עדיין מסוגל לנצח באופן ספונטני במשך שעות אהל מחומצן. לבבות של זבובים בוגרים, כי הם ניזוק כתוצאה של ההליך לנתיחה בדרך כלל מראים אזורים נקודתיים של מועקה קיצוניים לא מצליחים להירגע. שיעורי Heartbeat איטי יותר מאשר הרץ 1 הם נצפו לעתים נדירות זבובים צעירים יותר בגיל 3 שבועות, וכתוצאה מכך הכנות כאלה נחשבים פגום מבוטלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1425/MOVIE1.avi">לחץ כאן כדי להוריד סרט 1.</a> - אחד מבוגר בן שבוע wildtype לטוס (זן w מעבדה 1118) מראה את צינור חשוף בלב הבטן (קדמי משמאל). הערה רגילה, התכווצויות קצובות. אזורים אטום בפינה הימנית העליונה הם הגופים הנותרים שומן בבטן, תאים עגולים בכל צד של הלב הם התאים קרום הלב.

<ol><li>Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ+potassium+channel+mutations+cause+cardiac+arrhythmias+in+Drosophila+that+mimic+the+effects+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).</li>
<li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> J Neurosci. 13, 144-166 (1993).</li>
</ol>

המודל תסיסנית הוכיחה להיות כלי רב עוצמה גנטי, שבו נעשה שימוש כדי לענות על מגוון שאלות מדעיות החל ההתפתחות העוברית על למידה וזיכרון. לאחרונה אורגניזם מודל זה צדדי נעשה שימוש כדי לחקור את הגנטיקה של תפקוד הלב לטוס. מספר נסיונות לכמת הפיזיולוגיה הלב המבוגר תסיסנית הסתמכו על תצפיות שנעשו באמצעות זבובים שלם לציפורן הבטן. רוב הגישות הללו יש לסמוך על תצפית ויזואלית או הקלטות של שינויים משדר עוצמת האור דרך הבטן לכמת פרמטר אחד, קצב הלב. שיטות אלה יש מספר מגבלות: בדרך כלל רק את הקצה הקדמי ש...

<table><tbody><tr><td>מספרי קפיץ למיקרו-דיסקציה (מעוקלים)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5611</td><td>מתאימים לחיתוכים גסים (שלב 3)</td></tr><tr><td>מספרי קפיץ למיקרו-דיסקציה (ישרים)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית, 100ul</td><td>VWR international</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית, עדינים</td><td>Science Products</td><td>GB100T8P</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למתיחת פיפטות (Pipette Puller)</td><td>Sutter Equipment</td><td>P-97</td><td>שני סוגי המתיחה, האופקית והאנכית, יעבדו</td></tr><tr><td>צינורית פלסטיק</td><td>Tygon</td><td>קוטר פנימי 1/16&amp;#8221;</td><td>עבור נימים של 100&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>צינורית פלסטיק</td><td>Tygon</td><td>קוטר פנימי 1/32&amp;#8221;</td><td>עבור נימים קטנים</td></tr><tr><td>דבק לרקמות Histoacryl&amp;#174;</td><td>B. Braun Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית</em

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

<em&gt; תסיסנית</emלב&gt; התפתחה לאחרונה לבדיקת המנגנונים הגנטיים, הסלולר, ו המולקולריים שבבסיס לתפקד לבבות myogenic כמערכת מודל טוב. צעד מרכזי לבחינת תפקוד הלב של הזבוב הוא למצוא דרך לגשת לב באופן שמשמר פונקציה myogenic שלה תוך מתן איבר הלב הפועם כדי לצפות והקליט. שתי שיטות שונות לצפייה והקלטה הלב הפועם של הזחל וגם למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; מתוארים כאן. הכנה למחצה שלם שלנו באמצעות זבובים בוגרים מאפשר ראיה ברורה של הלב בטן ללא הפרעה מן לציפורן פיגמנט ואת המכסה גופים שומן. כדי להקליט הזחל פעימות הלב יש צורך לשתק את הזחל, אשר ממזער קיר תנועות הגוף ובכך להפחית את התנועות לב כי אינם קשורים התכווצויות שריר הלב. המתודולוגיות שלנו לייצר מבוגר יציבה ההכנות לב הזחל כי אפשר לנצח במשך שעות בשיעורים של 1-3 הרץ.

טכניקה נדרש לדמיין את הלב הפועם של הזחל והמבוגר<em&gt; תסיסנית</em&gt; מוצגים. כל שלב בחיים דורש מתודולוגיה שונה.

לב ה-Drosophila הפך לאחרונה למערכת מודל טובה לבחינת המנגנונים הגנטיים, התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס התפקוד ב...

שתי טכניקות יוצגו כאן לצורך הדמיה של לב פועם ב-Drosophila עבור דיסקציה של לב בוגר. ראשית, הראש והחזה מוסרים באמצעות חיתוך בודד לאורך הקו המסומן. לאחר מכן, איברי המין מוסרים וחלל הבטן נפתח באמצעות פינצטה; המעי, ובמקרה של זבוב נקבה, השחלות מוסרות.גוף השומן הבטני במקטעים הבטניים שלושה וארבעה נשאב בזהירות כדי לחשוף את לב הבוגר לצורך קיבוע של לב הזחל. זחל בודד המונח בתמיסת בופר מקובע על ידי מריחת דבק histo acral תחילה מסביב לאזור ראש הזחל. הזחל נמתח בעדינות ודבק נוסף נמרח בקצה האחורי, ולאחר מכן בדפנות של דופן גוף הזחל.שלום, אני GI Fler. שלום, אני Karen er. שנינו חברים בתוכנית לפיתוח והזדקנות במכון ברנהם למחקר רפואי (Burnham Institute for Medical Research).היום נדגים את הפרוטוקולים שפיתחנו להדמיה של לב פועם של זבובי פירות (*Drosophila*) בשלבי הפופה (larval) והבגרות. אנו משתמשים בשתי ההכנות הללו כדרך להדמיות, לבחינה ולכימות של פרמטרים של קצב הלב בזבוב הפירות, *Drosophila*. לפני שנתחיל, נכין תחילה תמיסת המולימפה מלאכותית.תמיסה זו מכילה סוכרוז, helo, שיש להוסיף לתריף הדם (hemolymph) המלאכותי ממלאי תמיסות מקור קרירות רגע לפני השימוש. על מנת למנוע זיהום חיידקי, יש להביא את התריף המלאכותי לטמפרטורת החדר ולהעשיר את התמיסה בחמצן באמצעות בועית אוויר למשך 15 דקות לפחות. לאחר מכן, יש למשוך מספר קפילריות דקות באמצעות שובך פיפטות סטנדרטי, שיידרשו לצורך הסרת גופי שומן בזבוב.לאחר שכל ההכנות הושלמו, יש להרדימ את הזבובים הבוגרים. ניתן לעשות זאת באמצעות חשיפה קצרה ל-fly nap למשך שתיים עד חמש דקות, אך יש להיזהר שלא להשאיר את הזבובים ב-fly nap למשך יותר מחמש דקות. ניתן להשתמש גם בחשיפה קצרת מועד לקור כדי להרדימ את הזבובים, אך שימוש בפחמן דו-חמצני אינו מומלץ מכיוון שיש לו השפעות ממושכות יותר על קצב הלב והתנועתיות.בשלב הבא, הזבובים המורדמים מונחים כשצדם הגבי (dorsal) פונה כלפי מטה לתוך צלחת פטרי המצופה בשכבה דקה של וזלין. הקוטיקולה ההידרופובית בכנפיים ובגוף אמורה להיצמד באופן הפיך לוזלין, אך ניתן למקם מחדש את הזבוב במידת הצורך. חתך ראשוני מבוצע באמצעות מספרי קפיץ קמורים.פעולה זו מתבצעת על ידי הנחת להבי המספריים מתחת לרגלי הזבוב ובזווית כלפי מטה לכיוון השטח הגבי (dorsal) סמוך לצוואר. לאחר החיתוך, הראש, שרשרת העצבים הגחונית (ventral nerve cord) והרגליים מוסרים בחיתוך אחד. לאחר מכן, הדגימה טובעת בתוך תמיסת המולימפה המלאכותית המועשרת בחמצן באמצעות מספרי קפיץ.את הקצה האחורי של הבטן, המורכב ממקטעים בטניים שבעה ושמונה, מסירים בחיתוך אחד. פעולה זו מאפשרת גישה לביצוע חיתוכים לצדיים לאורך שני קצות הבטן ומשמשת לניתוק הקשר בין המעי האחורי לבין הקוטיקולה של הבטן. יש להחדיר את להבי המספריים לתוך הפתח הקטן בקצה הבטן ולחתוך את הקוטיקולה לצדדים.פעולה זו משחררת קצה אחד של הקוטיקולה הוונטרלית (הבטנית). תפסו את השלוף בעזרת פינצטה ובצעו חיתוך דומה לאורך הקצה הלטרלי (הצדי) הנגדי של הבטן. כעת ניתן להסיר את השלוף המשוחרר של הקוטיקולה הוונטרלית של הבטן.ניתן להסיר בדרך כלל את המעי ואיברים בטניים אחרים כמסה אחת באמצעות פינצטת תכשיט ומשיכה עדינה. הסרת האיברים הפנימיים חושפת את צינור הלב הפועם, שעדיין מחובר לקוטיקולה הגב באמצעות שרירים אווריריים קטנים ומוקף בגופי שומן. את הנימיים שנמשכו מכניסים לתוך צינורית פלסטית בקוטר 1/16 אינץ' המחוברת למקור ואקום.כוח השאיבה פרופורציונלי לקוטר הטיפ, לכן אין להשתמש בפיפטות עם טיפים שקוטרם גדול מ-40 microns לאחר ההגדרה. מערכת שאיבה זו משמשת לשאיבת עודפי שומן מסביב לצינור הלב. ניתן להשתמש בה גם להסרת בועות אוויר שהצטברו סביב הקוטיקולה וכן להסרת שאריות.יש לנקוט זהירות רבה כדי להימנע ממגע בלב עצמו, ומכיוון שהחלק האחורי של הלב שברירי מאוד, יש להימנע ממגע גם באזור זה. צינור הלב של ה-drosophila הבוגרת חשוף כעת ואמור לפעום במידת הצורך. ניתן למקם מחדש את הקוטיקולה ואת הלב המחובר אליה על ידי הרמה עדינה של הקוטיקולה מו-וזלין והחזרתה בזהירות למקומה.יש להימנע מכל מגע עם רקמת הלב. בשלב זה, יש להחליף את התמיסה שבה טבולה הדגימה בהמולימפה מלאכותית טרייה. יש לאפשר לדגימה להגיע לשיווי משקל במשך 20 עד 30 דקות עם חממצון לפני ביצוע מניפולציות כלשהן.אם יש לתחזק את התכשיר למשך יותר מ-60 דקות, יש לבצע לו פרפוזיה חוזרת עם המולימף מלאכותי טרי. תכשיר זה מוכן כעת לשימוש להקלטה אופטית, וניתן להשתמש בו גם להקלטה אלקטרופיזיולוגית או למניפולציות היסטולוגיות. לצורך ויזואליזציה של דפיקות הלב בתוך הzלרוות נדרשת טכניקה שונה.ראשית, הכינו את לביבות הכיסוי יום לפני הפרוצדורה. הדבר נעשה על ידי שימוש בקיסם העברה כדי להעביר כ-50 עד 70 µL של תמיסת Sylgard על לביבת כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר. הניחו ל-Sylgard להתקשח בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה.בשלב הבא, הכינו את בופר Brody and Bates; ברגע שהבופר מוכן, ניתן לאחסן מנות (aliquots) בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס ולהפשירן בעת הצורך. לבסוף, הכינו את הכלים הדרושים למריחת דבק histo acral. ראשית, משכו מספר קפילריים דקים.בשלב הבא, חברו טיפ של פיפט בנפח 1.5 מיליליטר לצינורית פלסטיק קטנה שקוטרה כ-1/32 אינץ'. הכניסו את הקצה הצר של צינורית קפילרית אל תוך הצינור, כך שפתחה הרחב פונה לצד השני. לאחר ההכנה, טענו את הקפילרית בדבק היסטולוגי (histo glue) על ידי טבילת הקפילרית בטיפת דבק ויניקה עדינה אל תוך טיפ הפלסטיק.בעת עבודה עם הדבק, יש להחזיק בהישג יד קפילרית זכוכית שנייה כדי להסיר עודפי דבק מקצה קפילרית הדבק. הדבק נשאר נוזלי עד למגעו עם תמיסת סלין מנוטרלת (buffered saline), שבה הוא יתקשה תוך מספר שניות. עם זאת, הוא בדרך כלל נשאר פלסטי למשך זמן מספיק כדי שניתן יהיה להסירו מקצה קפילרית הדבק או בזמן יישומו על הדגימה.כעת, כדי להתחיל בקיבוע של הזחלים, הניחו טיפה של דבק histo acral קרוב לכל פינה של ה-syl guard. הוסיפו 50 microliters של בופר B and B לטיפות הדבק, אשר יתקשו באופן מיידי, ומלאו את החלל שבין נקודות ההדבקה ב-b and b. הדבק ישמור את הבופר על העששית.קחו זחל בשלב L3 בשלב נדידה והניחו אותו על פיסת נייר סופג רטוב על קרח למשך שתי דקות. פעולה זו תאט את תנועתו. לאחר מכן, העבירו את הזחל לתוך הבאפר והכווינו אותו כך שהצד הגבי יהיה כלפי מעלה.זהו צדו של הזחל שבו חסרות החגורות הזהות. מרחו במהירות מעט דבק בין אזור הראש לבין מגן הסף. הדבק יתקשה במהירות רבה וימנע את תנועת ראשו של הזחל.בעזרת פינצטה, תפסו בזהירות את החיה בסימנים האחוריים ומתוחו אותה בעדינות. קבעו את הזחלים במצב זה על ידי מריחת דבק לאורך שני צדי הזחלים בחצי האחורי. כדי להפחית תנועה נוספת של הקוטיקולה על ידי שרירי דופן הגוף, הוסיפו דבק נוסף לצדדי החיה.הזחל מקובע כעת בתנוחה זו. ניתן להניח את זכוכית הכיסוי בתוך צלחת פטרי קטנה מלאה בהמולימפה מלאכותית או ב-PBS, וכעת ניתן להקליט את פעימות הלב ללא הפרעה מתנועות דפנות הגוף. לב של זבוב דרוזופילה בוגר, חצי-שלם, יפעם באופן קצבי במשך שעות לאחר הניתוח, כאשר הוא נשמר בהמולימפה מלאכותית רעננה ומחומצנת.דוגמה מייצגת מוצגת כאן ובסרטון ההשלמה הראשון; לבבות מzশ্রেণীর זחלים בשלב השלישי המוצגים כאן, ובזבובים צעירים בגיל שבוע עד שלושה שבועות לאחר הבקיעה, מראים בדרך כלל פעימות לב סדירות בקצב שבין 1 Hz ל-3 Hz; זבובים בני יותר משלושה שבועות הם בדרך כלל לא רסמיים יותר. עם זאת, לבבות אלה עדיין מסוגלים לפעום באופן ספונטני במשך שעות בתוך המולימף מלאכותי מחומצן; לבבות של זבובים בוגרים שנפגעו כתוצאה מהליך הניתוח מראים בדרך כלל אזורים מקומיים של התכווצות קיצונית שאינם מסוגלים להירפות ולעתים קרובות פועמים ללא שליטה. קצבי פעימות לב נמוכים מ-1 Hz נצפים לעיתים נדירות בזבובים בני פחות משלושה שבועות.כתוצאה מכך, תכשירי בידוד כאלה נחשבים לפגומים ונזרקים. הדגמנו כעת כיצד להכין לבבות של זבוב פירות בוגר ובשלב התפתחותי לצורך דימוי אופטי. זכרו, בעת הכנת התכשיר החלקי, לעולם אין לגעת בלב עצמו.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

visualizing-the-beating-heart-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי תיוג הניאון של אלמנטים שונים של צינורות הלב של הזחל...

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

פיתחנו חצי אוטומטיות Heartbeat אופטי ניתוח בשיטה (סוהא) לניתוח הקלטות מהירות גבוהה אופטי...

חצי אוטומטיות Heartbeat ניתוח אופטי של לבבות קטנים

אנו מציגים דרכים שונות כדי לפקח על תפקוד הלב של...

ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

אנו מתארים את הליך להכין...

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

סרטון זה מתאר את ליבו הבוגר של הזבוב, או נקרא אחרת הכלי הגבי דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים הליך דיסקציה לתכשירי לב חי.

הכנת לב דרוזופילה: טכניקה לחקר פיזיולוגיה של הלב בזבוב הבוגר

כאן, מתוארים פרוטוקולי הניסוי להכנת דרוזופילה בשלבי התפתחות שונים וביצוע הדמיה אופטית אורכית של פעימות הלב של דרוזופילה באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קוהרנטית אופטית מותאמת אישית (OCM). ניתן לאפיין את השינויים המורפולוגיים והדינמיים הלבביים באופן כמותי על ידי ניתוח הפרמטרים המבניים והתפקודיים של הלב מתמונות OCM.

הכנת תסיסנית והדמיה אורכית תפקוד הלב in vivo באמצעות מיקרוסקופית קוהרנטיות אופטית (OCM)

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של Drosophila melanogaster המבטא eNpHR2.0 או ReaChR opsins בלב עבור הדמיית OCT וקצב לב אופטוגנטי. מדווחות הוראות מפורטות להדמיית Drosophila OCT ואפנון פעימות לב, כולל סימולציה של דום לב בר-שחזור, ברדיקרדיה וטכיקרדיה בבעלי חיים חיים בשלבי התפתחות שונים.

פיתוח מודלים דרוזופילה מלנוגסטר להדמיה ובקרה אופטוגנטית של תפקוד הלב

פרוטוקול חתך הלב וההדמיה הקרינה של דרוזופילה מפשט את חקר מבנה הלב והפתולוגיות. גישה זו כוללת חתך, צביעה והדמיה פשוטים, תוך עקיפת המומחיות הטכנית הדרושה לנתיחה מסורתית. זה משפר את הנגישות, מה שהופך את הדרוזופילה למודל שמיש יותר למחקר הקשור ללב בקרב הקהילה המדעית הרחבה יותר.

שיטה חדשנית ויעילה לצביעה פלואורסצנטית של לב דרוזופילה עם הקפאה

למד טכניקות לדימוי הלב הפועם בדרוזופילה בשלבי הזחל והבוגר. השיטות כוללות ניתוח ושימוש בדבק היסטואקרילי לקביעה, המאפשרות מחקר פיזיולוגיה לבבית ופיתוח.

לדמיין את הלב הפועם תסיסנית

גלה סרטונים נוספים