Name: Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-12T23:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: למד שיטה לכימות פוספופרוטאומיקה ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות כריוליזה, שסוי חלבונים, ועשרות IMAC. שיטה זו מאפשרת ניתוח מסה ספקטרומטרי של פפטידים מסומנים מטבולית לחקר מסלולי תמרור תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד&quot;ר עשיר רוג&#39;רס לקבלת סיוע טכני עם מנתח ספקטרומטריית מסה ודיונים מועיל, בני הזוג. רוב מוריץ, ג&#39;ף Ranish ו חמיד Mirzai לדיונים מועילים. עבודה זו מומנה על ידי המרכז הלאומי לבריאות של אקסלנס.

תא צמיחה התקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבה אחת של תאים BY4742Δarg4Δlys1 לילה 100 מ&quot;ל מדיה עשירה כדי OD 600 של זרע אז 1.0 לשתי התרבויות 1 ליטר של מדיום שמרים מינימלי (0.17% חנקן שמרים ללא בסיס אמוניום סולפט או חומצות אמינו, אמוניום סולפט 0.5%) המכיל מלא של חומצות אמינו, בתוספת L / 20 מ&quot;ג של ארגנין נורמלי isotopically או כבד (13 ג 6 15 N 4; Isotec) ו ליזין (13 ג 6 15 N 2; Isotec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים גדלו במשך 18 שעות, כדי OD 600 של 1.8. זה קריטי, כי התאים לעבור לפחות 9 דורות כדי להשיג שילוב מלא של איזוטופים שכותרתו. המדגם היה אור pelleted, שטפתי עם מים סטריליים, reseeded לתוך oleate המכיל בינוני (רגיל isotopically ארגינין וליזין, Oleate 0.2% (כימיקלים סיגמא) ו 0.5% Tween 40 (Sigma כימיקלים)) ועורר עוד 85 דקות. זה מניב אור isotopically, ביחס ארגינין ליזין, oleate-מגורה מדגם כבד isotopically גלוקוז מבוגר מדגם התייחסות. </li></ol> תמוגה התא, בידוד ההיפוך חלוקה של פפטידים <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול בקבוק צנטריפוגות. קציר דגימות על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות. הסר מדיה לשאוב נוזל עודף. לשקול גלולה ובקבוק (יהיו בדרך כלל התשואות בין 1-2 גרם) ואז להקפיא פלאש חנקן נוזלי. הוסף נפח שווה למשקל של גלולה חיץ &quot;טחינה&quot; של כדורי מוקפאת בחנקן נוזלי (בופר פוספט (PBS, Gibco), 10% גליצרול, מעכבי פרוטאז (מעכבי פרוטאז SigmaFAST טבליות, Sigma) ולעצור מעכבי phosphatase (Thermo Scientific )). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את כלי שחיקה של חנקן נוזלי. המתן עד חנקן נוזלי חדל רותחים. מעבירים את גלולה לכלי השיט שחיקה, עם מיסבים קפוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים בסל&quot;ד 600 עם מחזור 1 דקות 20 שניות עם היפוך כיוון במשך 3 דקות. Refreeze כלי שחיקה של חנקן נוזלי. חזור 4 פעמים יותר במשך 15 דקות זמן שחיקה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את grindate קפוא לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל קרח פלקון מקום יבש. חנות ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 10ml של 8M אוריאה, אמוניום ביקרבונט 0.1M, 0.1M טריס pH 8.6. הוסף 3 כרכים של למאגר אוריאה עד נפח של 1 grindate הקפוא (עבור 3mls דוגמה למאגר אוריאה להוסיף 1 גרם גלולה עם 1 מ&quot;ל של PBS חיץ). מיד sonicate את התערובת עם sonicator בדיקה קצה (2-10 פעימות השני). שמרו על קצה בתחתית הצינור כדי למנוע הקצפה של הפתרון. Grindate צריך מיד להיכנס פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את lysate ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינורות טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך aliquot טרי טריס 0.5m [2-carboxyethyl] phosphine (TCEP). הוסף מדגם בשעה 1:100 ריכוז סופי 5mm. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקילציה של cysteines מופחת. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר. הפוך aliquot טרי iodoacetamide 1M. שמור בחושך (אנחנו לעטוף את צינור בנייר כסף). הוסף בריכוז הסופי של 20mm. דגירה בחושך 1 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את iodoacetamide עם DTT 20mm ממלאי 1M בטמפרטורת החדר 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את החלבונים עם ברדפורד סטנדרטי או BCA assay (לא תיאר). קח דוגמה לניתוח על ידי SDS להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת שילוב של איזוטופים כבדים, שימוש 100 μl של lysate מופחת alkylated. לדלל 1:04 עם DH 2 O, sonicate ולהוסיף טריפסין על חלבון 50:1 כדי טריפסין. תקציר עבור מינימום של 4 שעות, מדגם יבש למטה במהירות VAC ו desalt אז עם עמודות Ultramicrospin C18 (קבוצת קן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור מימה עם μl 100 של אצטוניטריל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עם TFA 200 μl 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מדגם יבש TFA 200 μl 0.1%. עומס על עמוד. צנטריפוגה XG ב 200 ~ או את מהירות מינימלית הדרושה לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם TFA 200 μl 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם פעמיים עם אצטוניטריל 50 60% μl, TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם יבש במהירות VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם Resuspend בחומצה פורמית μl 20 0.1%. הפעלה 2 μl על ספקטרומטר מסה. בדוק שילוב של כבד isotopically ארגינין וליזין על ידי שינוי דלתון 10 ו -8 הספקטרום m / z בהתאמה. שילוב של חומצה אמינית כל צריך להיות בין 96-98%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות שוות ערך (מ&quot;ג של חלבונים) של דגימות כבד isotopically ואור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל מדגם 01:04 מתנול עם 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טריפסין ב 1:200. דגירה לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק העיכול כי הלכה השלמת ידי SDS. הפעלה 2 ו - 4 μl של המדגם predigestion ו 8ד 16 μl של טריפסין הודעה לעכל. דמיינו ידי מכתים Coomassie כי עיכול תושלם. אם זה לא שלם, sonicate המדגם עם בקצרה קצה החללית sonicator ולעכל שוב עם טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש המדגם למטה במהירות VAC. כאשר מוסיפים יבש 200 μl של מסונן DH 2 O ו מערבולת עד גלולה נכנס הפתרון. מדגם יבש למטה במהירות VAC. Resuspend שוב עם DH 2 O. יבש מדגם שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בחומצה Trifluoracetic 0.1% (TFA; סיגמא). בדוק כי ה-pH הוא בסביבות 3 באמצעות רצועות pH. אם יש צורך להפוך לחומצה TFA עם 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את כל המשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt דגימות על עמודה ספטמבר-Pak ווטרס Vac מ&quot;ג 500 C18. אל תעמיס יותר מדי עמודות אלה. הסכום המקסימלי הוא 5 מ&quot;ג אבל עדיף להעמיס קצת פחות. מחלקים את המדגם בין עמודות מרובות במידת הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור מימה עם אצטוניטריל 5 מ&quot;ל ב -100%. צנטריפוגה XG ב 200 ~ או את מהירות מינימלית הדרושה לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן טור עם TFA 0.1% 5 מ&quot;ל. טען המדגם. איסוף זרימה לטעון שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם TFA 5 מ&quot;ל 0.1%. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם אצטוניטריל 2ml 60% TFA 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם יבש למטה במהירות VAC. </li></ol></li></ol> ההיפוך חלוקה בידוד פפטיד של Phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים הם מופרדים על עמודה HILIC. אנו משתמשים TOSOH טפו-Gel אמיד-80 4.6 מ&quot;מ x 25 ס&quot;מ עמודה אנליטית עם עמודה השומר. קחי את הזמן שלך עם הצעד הזה, להפעיל את העמודה עבור 2 שעות 90% בטווח ולאחר מכן שני מילויים ריק לפני טעינת המדגם שלך. העומס המרבי על עמודה בגודל כזה נחשב סביב XX, אנחנו בדרך כלל לא להעמיס יותר מ 5 מ&quot;ג לרוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכך - 98% ACN/0.1% TFA מרכך ב - 2% ACN/0.1% TFA טען% 90 מעל 20 &quot;, 90% עד 85% מעל 5&quot;, 85% ל -60% מעל גיל 40 &quot;, 60% ל -0% במשך 5 &#39;, 0% עד 90% על 5 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצב הזרימה הוא 1ml/min ושברים נאספו ב 2 מרווחי דקות החל 85% עד 60% שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב שברים כדי לצמצם את מספר שברים עד 10. שברים מוגברת צפויה להניב כיסוי גדול יותר של phosphoproteome. </li></ol> העשרה של phosphopeptides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphopeptides מועשרים באמצעות PHOS בחירה ג&#39;ל ברזל זיקה. אנו aliquot שרף iMac שלנו כדי למנוע הקפאת חזר הפשרה. הפוך את 50 ה-MLS של חומצה אצטית 250 מ&quot;מ, 30% עומס פתרון ACN. תביאו את ה-pH ל -2.7 עם HCl. Resuspend כדורי ב μl 500 של פתרון העומס. בדוק pH, להתאים עם HCl או NaOH במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 Prewash μl של חרוזים iMac בעמודה המתאימה. אנו משתמשים עמודות ספין Molbiotec. הוסף 15 μl של slurry של 50% (ג&#39;ל לטעון פתרון) לשבר כל אחד, דגירה דגימות עבור 30 &quot;עם סיום סיבוב על הקצה. שמור את זרימת לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 3 פעמים עם פתרון לטעון פעם אחת עם 500 μl מסוננים DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים Elute עם 2-3 דק &#39;עם 400 μl של 50 mM Na 2 HPO 4 (pH 8.4) חיץ. העברה בקבוקון זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך לחומצה pH 3 עם חומצה פורמית μl 5 100%, הקפאה בחנקן נוזלי פלאש, מדגם יבשים למטה במהירות VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphopeptides Resuspend ב μl 200 TFA של 0.1% ו - C18 נקי כמתואר לעיל. יבש את דגימות eluted במהירות VAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פפטידים ב 20 μl של חומצה פורמית 0.1%. שימוש 2 μl לכל ניתוח ספקטרומטר מסה או לפי הצורך. </li></ol> הערות במשך רוב פרוטוקול זה תהיה עבודה &quot;עיוור&quot;. תמוגה התא יכול להיות פיקוח על ידי סופג המערבי מבחני ברדפורד או BCA, ואת מערכת העיכול טריפסין ניתן להעריך בקלות. העמודה HILIC יהיה נתן שמץ דומה לזה, או נתפס על ידי אחרים [1, 2] בהתאם מכונת כרומטוגרפיה נוזלית המשמשת. דוגמאות מנוטרים על ידי ספקטרומטריית מסה, מבחן דגימות שלך במחשבים זולים כגון LCQs או MALDIs לפני שהולכים מנתח העלות הגבוהה על דיוק מסה גבוהה, מכונת ברזולוציה גבוהה. לבסוף, אם אתה ייבוש מטה מדגם עם חומצה בו, להשתמש בזכוכית.

<ol><li>Albuquerque, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multidimensional+chromatography+technology+for+in-depth+phosphoproteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).</li>
<li>McNulty, D. E., Annan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography+reduces+the+complexity+of+the+phosphoproteome+and+improves+global+phosphopeptide+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).</li>
<li>Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Gruhler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteomics+applied+to+the+yeast+pheromone+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of fission yeast.</a> J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).</li>
<li>Villen, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCX%2FIMAC+enrichment+approach+for+global+phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).</li>
<li>Jensen, S. S., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+impact+of+some+experimental+procedures+on+different+phosphopeptide+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).</li>
<li>Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).</li>
<li>Pinkse, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+isolation+at+the+femtomole+level+of+phosphopeptides+from+proteolytic+digests+using+2D-NanoLC-ESI-MS%2FMS+and+titanium+oxide+precolumns%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns.</a> Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).</li>
<li>Tao, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phosphoproteome+analysis+using+a+dendrimer+conjugation+chemistry+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry.</a> Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).</li>
<li>Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+to+the+analysis+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).</li>
<li>Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+distinct%2C+overlapping+segments+of+the+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome.</a> Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).</li>
</ol>

שיטה זו תניב העשרה של phosphopeptides כי ניתן לנתח באופן כמותי. מספר פרמטרים ניתן לשנות בפרוטוקול זה, אבל ההיבט החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשמר זירחון שלך. הכנת תאים כימות ניתן להשיג במספר דרכים שונות, למשל אם אתה לא יכול תווית התאים שלך, תגי vivo כגון ICAT [3] או ITRAC [4] יכול לשמש להפקת לפרסם דיפרנציאלי התווית שתי התרבויות עבור כימות מטרות. עבור חלוקה השיטות הנפוצות ביותר הן על ידי חלוקה ג&#39...

<table><tbody><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-ארגינין-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;פחמן&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;,&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Isotec&amp;#8482; L-ליזין-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>609021</td><td></td></tr><tr><td>GIBCO&amp;#8482; תמיסת סলাইন בבופר פוספט (PBS) 7.4 (ריכוז 10X) נוזל</td><td>Invitrogen</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכבי פרוטאין סיגמא-פסט (SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת כדורי Retsch PM100 </td><td>Retsch</td><td>20.540.0001</td><td></td></tr><tr><td>כלי טחינה מנירוקס (Stainless Steel) בנפח 125 מ"ל של Retsch</td><td>Retsch</td><td>01.462.0148</td><td></td></tr><tr><td>עמודת Ultramicrospin C18</td><td>קבוצת הקינון</td><td>SUM SS10</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Vac 500 mg C18</td><td>Waters</td><td>WAT043395</td><td></td></tr><tr><td>עמודה אנליטית TSK-Gel Amide-80 4.6 מ"מ x 25 ס"מ</td><td>Tosoh Corp.</td><td>13071</td><td>זוהי עמודת הכרומטוגרפיה מסוג HILIC.</td></tr><tr><td>עמודת הגנה בקוטר פנימי (ID) של 4.6 מ"מ ואורך של 1 ס"מ</td><td>Tosoh Corp.</td><td>19021</td><td>אנו ממליצים על עמודה הגנה זו כדי להאריך את חיי מדף עמודת ה-HILIC שלך.</td></tr><tr><td>PHOS-Select&amp;#8482; ג'ל זיקה לברזל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9740</td><td>זהו שרף ה-IMAC. יש לחלק לאליקוואוטים (מנות) ולאחסן.</td></tr></tbody></table>

phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה saccharomyces cerevisiae</em

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה גירוי, עם oleate חומצת שומן, כבד isotopically ואור תאים ס cerevisiae. תאים הם הקרקע באמצעות הליך cryolysis במטחנת כדור הטחנה ואת grindate וכתוצאה מכך הביא לתוך פתרון על ידי solubilization אוריאה. הליך זה מאפשר תמוגה של התאים במצב פעיל מטבולית, שימור זירחון ומניעת ארגון מחדש של phosphoproteome במהלך תמוגה התא. בעקבות הירידה, אלקילציה, עיכול טריפסין של החלבונים, הן דגימות desalted על עמודות C18 ואת המורכבות מדגם מופחת על ידי חלוקה באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי (HILIC). עמודות HILIC מעדיפים לשמור על מולקולות הידרופיליות אשר הוא גם מתאים phosphoproteomics. פפטידים phosphorylated נוטים elute בהמשך הפרופיל chromatographic מאשר עמיתיהם הלא פוספורילציה. לאחר חלוקה, phosphopeptides מועשרים באמצעות כרומטוגרפיה מתכת משותקת, אשר מסתמכת על תשלום מבוסס זיקות להעשרת phosphopeptide. בתום הליך זה דגימות מוכנים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית.

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

פרוטוקול זה מתאר את הגידול והסטימולציה, באמצעות חומצת השומן אולאט (oleate), של תאי *S. cerevisiae* כבדים וקלים איזוטופית. התאים נגרסים...

פספורילציה היא מנגנון העברת אותות תאי מרכזי השולט בתהליכים החל ממיקום חלבונים ועד לתמלול DNA, והלימוד של הפספונו באמצעות ספקטרומטריית מס הוא התקדמות חדשה ומרגשת בחקר התוויתקה (סיגנלינג) והפרוטאומיקה כאחד. תאים המסומנים באופן דיפרנציאלי עוברים ליזיס במטחנת כדורים, לאחר מכן רדוקציה, אלקילציה, ערבוב ועיכול. הפפטידים שעובדו עוברים הפרדה בשיטת כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופילית, ופפטידים מזופספורלים מועשירים מהפראקציות באמצעות העשרה ב-iMac.הפרקציות המועשרות בפספו-פפטידים מזוהות לאחר מכן באמצעות msm. שלום, אני Ramsey Celine מקבוצת E במכון Persistence Biology. היום נדגים לכם פרוצדורה למיצוי של פספו-פפטידים המסומנים מטבוליות.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור באופן כמותי את הפרוטאום של ה-fossa. אז בואו נתחיל. הליך זה מתחיל בגידול של תאי שמרים קלים וכבדים איזוטופית.ראשית, יש להדביק 100 מיליליטר של מצע עשיר עם מושבה בודדת של תאי שמרים. גדלו תרבית זו למשך לילה עד ל-OD 600 של 1.0. לאחר מכן, השתמשו בה כדי להזריע שתי תרביות של ליטר אחד של מצע מינימלי המכיל את כלל החומצות האמינו ומועשר ב-20 מיליגרם לליטר של איזוטופים.גדלו שתי תרביות של ליטר אחד במשך 18 שעות עד ל-OD 600 של 1.8, אחת עם ארגנין וליזין רגילים והשנייה עם ארגנין וליזין כבדים איזוטופית. זהו שלב קריטי שהתאים יעברו לפחות תשעה דורות כדי להשיג שילוב מלא של האיזוטופים המסומנים. כאשר התאים השלימו את שילוב האיזוטופים המסומנים, סבב בצנטריפוגה את התאים שגדלו במצע עם ארגנין וליזין רגילים איזוטופית.כדי לקבל משקע תאים, שטפו את המשקע במים סטריליים והעבירו אותו למצע המכיל oleate עם ארגנין וליזין רגילים מבחינה איזוטופית, ועבדו בגירוי למשך 85 דקות. פעולה זו תניב דגימה שעברה גירוי ב-oleate והיא קלה מבחינה איזוטופית. התרבית השנייה, שגודלה במצע עם ארגנין וליזין כבדים מבחינה איזוטופית, לא תעבור גירוי ב-oleate ותשמש כדגימת ביקורת כבדה מבחינה איזוטופית שגודלה על גלוקוז.כדי לאסוף ליטר אחד, התרבית מחולקת בין ארבעה בקבוקי צנטריפוגה של 250 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגציה, התאים נאספים לשפרורה אחת על ידי השארת 100 מיליליטר בלבד מהמדיה, השעיה מחדש של התאים והעברתם לשפרורה הבאה. בסיום, נאסף משקע גדול אחד בשפרורת צנטריפוגה בודדת למשך שלוש דקות במהירות של 4,000 RPM.לאחר הסרת המצע, משווים את משקל בקבוק הצנטריפוגה והמשקע למשקל של בקבוק צנטריפוגה ריק. לאחר הצנטריפוגציה, מסירים את המצע ושואבים את עודפי הנוזלים מהבקבוקים, שוקלים את המשקעים; תפוקה טיפית היא בין גרם לשני גרמים. לאחר מכן, מקפיאים את המשקעים בהקפאה מהירה (flash freeze) בחנקן נוזלי ומוסיפים למשקעים באפר טחינה המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז.נפח בופר הטחינה שיש להוסיף צריך להיות שווה למשקל המשקע. הקפיאו את כלי הטחינה בחנקן נוזלי. כאשר החנקן הנוזלי יפסיק לרתוח.השתמשו בסקפולה (scapula) כדי לגרד את הפלט (pellet) ולהעבירו לכלי הטחינה המכיל כדורי מתכת קפואים. טחנו את הפלטים במהירות של 600 RPM במחזור של דקה אחת, עם מחזור של 22 שניות שכולל היפוך כיוון, למשך שלוש דקות. הקפיאו מחדש את כלי הטחינה בחנקן נוזלי.חזור על הטחינה ארבע פעמים נוספות, למשך 15 דקות בסך הכל. זמן הטחינה כאשר הטחינה הושלמה עבור שתי הדגימות. אסוף את התוצר הקפוא של הטחינה למבחנות פאלקון של 50 milliliter ושמור אותו קפוא, בחנקן נוזלי או בקרח יבש.יש לאחסן את התאריך הטחון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. הבידוד והפרקציה של הפפטידים מתחילים באלקילציה שלהם. השלב הראשון הוא להמיס את הדגימה בתמיסת urea.המיסו כל דגימה טחונה על ידי הוספת שלושה נפחים של באפר Urea לנפח אחד של דגימה טחונה קפואה. לדוגמה, הוסיפו שלושה מיליליטרים של באפר RIA לפלט של גרם אחד. עם מיליליטר אחד של באפר PBS.בצע סוניקציה מיידית של התערובת באמצעות המתמר. השתמש בסוניקציה עם קצה (tip sonicate). שמור על הקצה קרוב לתחתית המבחנה כדי למנוע היווצרות קצף בתמיסה.את התאריך של הטחינה יש להעביר מיד לתוך תמיסה. יש להבהיר את הליזטים באמצעות צנטריפוגציה ב-6,000 RPM למשך חמש דקות. בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, העבירו את ה-SUPINATE למבחנות נקיות.כדי להתחיל את תגובת החיזור, יש להוסיף לכל דגימה Tris בריכוז 0.5 מולארי שהוכן טרי, או TCEP או LITAL PHOSPHINE שני קרבוקסיל, בדילול של 1:100. כדי להגיע לריכוז סופי של 5 מילימולארי של TCEP, יש לדגור את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר הדגירה ב-37 °C, יש להמתין עד שהדגימות יתקררו לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, יש להוסיף iodoacetamide בריכוז 1 M שהוכן טרי, עד לריכוז סופי של 20 mM, ולהדגיר בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה של שעה אחת, יש לעצור את תגובת ה-iodoacetamide באמצעות DTT בריכוז 20 mM. יש להשאיר את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.הליזאטים לאחר הרדוקציה והאלקילציה מוכנים כעת לעיכול באמצעות tripsin. בשלב זה, ניתן להשתמש במדגמים של הליזאטים לצורך כימות חלבונים, ניתוח SDS page לאימות הליזיס של התאים, וניתוח ספקטרומטריה של מסות כדי לתקף את שילוב האיזוטופים הכבדים. כדי להתחיל את העיכול ב-tripsin, ערבב כמויות שוות של המדגמים הכבדים והקלים איזוטופית.דללו את הדגימה ביחס של אחד לארבע באמצעות 20% methanol והוסיפו trypsin בדילול של אחד ל-200. הדגירו את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, לאחר אימות של עיכול מלא באמצעות SDS page וצביעת kumasi, ייבשו את הדגימה ב-speed vac עד להשגת ייבוש מלא.הוסף 200 µL של מים מזוקקים מסוננים וערבב במכשיר vortex עד להמסה מלאה של המשקע. ייבש את הדגימה במכשיר speed vac ותלה אותה שנית במים מזוקקים. לאחר ייבוש הדגימה פעם נוספת, תלה את המשקע ב-0.1% Trifluoroacetic acid או TFA, ובדוק בעזרת נטרי pH במידת הצורך שה-pH הוא סביב 3. חמצץ באמצעות 10% TFA כדי להשקיע כל משקע שנותר.כעת יבוצע הסמכה לדגימה שעברה עיכול על ידי טריפסין באמצעות עמודת C 18 של Waters, דגם Sep-Pak VAC 500 mg. ראשית, יש להעשיר את העמודה בחמישה מיליליטרים של 100% acetonitrile בצנטריפוגה במהירות של כ-200 $\times$g או במהירות המינימלית הנדרשת למעבר הנוזל דרך העמודה. לאחר מכן, יש להביא את העמודה לשיווי משקל עם חמישה מיליליטרים של 0.1% TFA ולהטעין את הדגימה.הקפידו לא להעמיס יתר על העמוד, ובמידת הצורך, חלקו את הדגימה בין מספר עמודים. אספו את הזרימה למכל פסולת וטענו את העמוד שוב במידת הצורך, שטפו עם five milliliters, 0.1%TFA. חזרו על שטיפה זו ואז בצעו אלוציה עם two milliliters של 60%Aceto nitrile 0.1%TFA; יש לאסוף את ה-EEU באמצעות צנטריפוגציה.ייבשו את הדגימה ב-speed vac והמיסו מחדש את הדגימה המיובשת ב-200 µL של ממס B. הדגימה שהומסה מחדש מוכנה כעת לפרקציונציה של פפטידים. בצעו פרקציונציה לפפטידים בעזרת עמודה אנליטית מסוג TSK gel AMIDE 80 עם עמודת הגנה (guard column). בצעו את השלב הזה בנחת.הפעל את העמודה למשך שעתיים בריכוז של 90% solvent A, ולאחר מכן הרץ שני גרדיאנטים ריקים לפני טעינת הדגימה. בדרך כלל איננו טוענים יותר מחמישה מיליגרמים להרצה בעמודה בגודל זה; מכשירים מודרניים, ואפילו מכשירים שאינם מודרניים, של כרומטוגרפיה נוזלית מאפשרים הזרקת דגימה אוטומטית, איסוף פרקציות, בקרת קצב זרימה וערבוב גרדיאנטים.אלו נקבעים בתחילת ההרצה כפי שתואר. טען 90%A במשך 20 דקות, מ-90%A ל-85%A במשך חמש דקות, מ-85%A ל-60%A במשך 40 דקות, מ-60%A ל-0%a במשך חמש דקות ומ-0%A ל-90%a במשך חמש דקות. קבע את קצב הזרימה ל-one milliliter per minute ואסוף פראקציות במרווחים של שתי דקות.החל מהמדרג של 85%A עד 60%A, שלבו מקטעים כדי להפחית את מספר המקטעים ל-10; הגדלת מספר המקטעים תביא ככל הנראה לכיסוי רחב יותר של הפוספו-פרוטאומה. פפטידים זרחוניים מועשרו באמצעות כרומטוגרפיית מתכות מקובעות. אנו משתמשים בג'ל Phos Select Iron Affinity כשרף ה-iMac.ראשית, השעה את כדוריות ה-Resus ב-500 microliters של תמיסת טעינה. לאחר מכן, הוסף 15 microliters של slurry בריכוז 50% לכל פראקציה והדגר את הדגימות למשך 30 דקות בסיבוב end over end. שמור את הזרימה לצורך ניתוח.שטוף את הדגימה שלוש פעמים עם תמיסת הטעינה ופעם אחת עם 500 microliters של מים מזוקקים מסוננים; לאחר השטיפות, בצע אלוציה של פפטידים למשך שתי עד שלוש דקות עם 400 microliters של sodium phosphate buffer בריכוז 50 millimolar. העבר את הפפטידים שנאלואו למבחנה מזכוכית. הוסף חמש microliters של 100% formic acid לפפטידים כדי להחמיץ ל-pH 3; השהה מחדש את הפוספו-פפטידים ב-200 microliters של 0.1% TFA ובצע הסמכה מחדש באמצעות עמודת C 18 כפי שתואר קודם לכן. ייבש את הדגימות שנאלואו ב-speed vac.לבסוף, השביו מחדש את הפספו-פפטידים ב-20 µL של 0.1% formic acid. הדגימות מוכנות כעת לניתוח כמותי באמצעות ספקטרומטריית מסות. כאן מוצג עקבה גרפית כרומטוגרפית מהפרקציה של פפטידים תאיים כוללים באמצעות כרומטוגרפיית H-I-L-I-C.ניתן להבחין בעקבה זו כי בעוד שפפטידים מפספורים נמצאים לאורך כל פרופיל האלואציה, מרבית השאריות המופספורות נשמרות עד לסוף פרופיל האלואציה. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטחון תאים, לעכל חלבונים, להפריד פפטידים לפרקציות ולהעשיר פפטידים מפספורים באמצעות כרומטוגרפיית ספיחה של מתכות מאובלות (IMAC). בעת ביצוע נוהל זה, חשוב לזכור לשמר את הפספורילציה ולבדוק את ה-pH של התמיסות.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

quantitative-phosphoproteomics-fatty-acid-stimulated-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ליפאזות (פוספו)ליפאזות חזויות רבות מאופיינות בצורה גרועה מבחינת הספציפיות של הסובסטרט והתפקודים הפיזיולוגיים שלהן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לייעול פעילות האנזימים, חיפוש אחר סובסטרטים טבעיים ומציעים פונקציות פיזיולוגיות לאנזימים אלה.

הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז

פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לחלץ ולהעשיר את phosphopeptides סרטן הערמונית שורות תאים או רקמות עבור ניתוח של phosphoproteome באמצעות פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

מוצג כאן היא גישה זרחנית, כלומר לעצור וללכת מיצוי קצה מבוסס פוספופרוטומית, אשר מספק תפוקה גבוהה כיסוי עמוק של ערבידופסיס phosphoproteome. גישה זו מתווה את הסקירה של איתות מתח אוסמוטי ב Arabidopsis.

אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

למד שיטה לכימות פוספופרוטאומיקה ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות כריוליזה, שסוי חלבונים, ועשרות IMAC. שיטה זו מאפשרת ניתוח מסה ספקטרומטרי של פפטידים מסומנים מטבולית לחקר מסלולי תמרור תאיים.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae

גלה סרטונים נוספים