Name: Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: למדו כיצד לבנות מערך מזרקים נוזליים מקבילי להזרקת וירוסים למעגלים עצביים מורכבים במוח. שיטה זו מאפשרת מניפולציה אופטית מדויקת של תאים ספציפיים ומאיצה מחקרים בנוירוביולוגיה ובאופטוגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESB מודה מימון על ידי פרס ממציא ניו המנהל של NIH (DP2 OD002002-01), NIH אתגר גרנט 1RC1MH088182-01, NIH גרנד הזדמנויות גרנט 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 ו - 0,848,804), מכון מקגוורן תוכנית Neurotechnology פרס , משרד ההגנה, NARSAD, פ אלפרד סלואן קרן, ג&#39;רי מארג&#39; ברנט, פרס המחקר SFN עבור חדשנות Neuroscience, מעבדת המדיה ב-MIT, קרן Benesse ו ח &#39;וולאס קולטר קרן.

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

כל ההליכים היו בהתאם מדריך NIH עבור בחיות מעבדה ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים-MIT השתמשו ועדות biosafety.

בשנים האחרונות, מספר מקודדים גנטית לרגישות אופטי אפשרו נוירונים להיות מופעל השתיק in vivo באופן temporally מדויק, בתגובה פולסים קצרים של אור (למשל, 1,4,5,6,7,8 , 11). מפתח שיטה שבה הנוירונים היה רגיש לאור במוח של יונקים, היא באמצעות וירוסים כגון lentiviruses ו adeno הקשורים וירוסים (AAV), אשר יכול להעביר גנים קידוד עבור opsins אל מוחם של בעלי חיים, החל עכברים וקופים, ב אופנה בטוחים ויציבים (למשל, 2,9,10). וירוסים לאפשר זמן תגובה מהיר יותר מאשר לעשות transgenics, במיוחד עבור אורגניזמים שאינם אורגניזמים מודל גנטי כגון חולדות וקופים, ועל opsins עשוי לאפשר רמת ביטוי גבוהה כי לא ניתן בתרחישים מהונדס. כאן אנו מדגימים מערך מקביל מזרק מסוגל לייצר, תוך לוח זמנים מהיר, &quot;מעגל ברמה transgenics&quot;, המאפשר כולה 3 ממדי מבנים במוח להיות ממוקד virally עם הגן, בשלב ניתוח יחיד. המערך כולל מזרק אחד או יותר משאבות ספיקה שכל כונן סט של מזרקים, שכל אחד מהם הזנות לתוך סיליקה התמזגו-polyimide / נימי באמצעות מחבר בלחץ גבוה, סובלני. נימים הם בגודל, ונוסף אז אל, במקומות הרצויים שצוין על ידי אישית כרסום לוח מיצוב stereotactic, ובכך מאפשר וירוסים או חומרים כימיים אחרים כדי להיות מועברת להגדיר את הרצוי של אזורים במוח. כדי להשתמש במכשיר, המנתח הראשון ממלא את המשנה fluidic לחלוטין עם שמן, backfills הנימים עם הנגיף, מחדיר את המכשיר לתוך המוח, ממלאה ריאגנטים לאט (&lt;0.1 μL / min). טכנולוגיה זו תאפשר מגוון רחב של סוגים חדשים של ניסויים, כגון כיבוי אלפית השנייה, זמנים של המושלמת בצורת מבנים (כגון ההיפוקמפוס) בזמנים מדויקים במהלך התנהגות, איון temporally מדויק של מבנים דו שעשויים לפעול מיותר (כגון האמיגדלה על ימין ועל שמאל), ואת ההפרעות של מספר אזורים במוח בדידים (למשל, נהיגה שני האזורים מחוברים מחוץ שלב ללמוד איך האזור צולבות בתיאום תלוי הפעילות בכל אזור, או מגרה כניסות לאזור תוך השתקת קבוצת משנה של מטרות כדי להבין איזה מספר מטרות הן קריטיות עבור מתווך את ההשפעות של תשומות אלה). עבור מוחות גדולים כמו אלה הפרימטים, שבו יש לנו הפגינו לאחרונה ההפעלה אופטי תאים עצביים סוג מסוים 3, מביך הפעילות בתחום התנהגותית הרלוונטיים עשוי לדרוש תיוג ויראלי של מבנים גדולים ומורכבים. נציין כי במקביל מערכי מזרק ניתן להשתמש כדי להזריק כמעט כל מטען - סמים, neuromodulators, נוירוטרנסמיטורים, או אפילו תאים - ב 3-D דפוסים מורכבים במוח, באופן מדויק ובזמן. לבסוף, מבחינה translational, יתכן מהירה, המטופל אישית ריפוי גנטי או מסירה מכשירים התרופה עשויה להיות מהירה אישית מעוצבת ו מפוברק כדי להתאים הגיאומטריות מוח בודדים, תמיכה לטיפולים חדשים עבור מגוון רחב של פתולוגיות, באופן פוטנציאלי באמצעות מולקולות בקרה אופטית. מערכים מזרק נועדו להיות מדויק, הן מרחבית volumetrically. ב-X ו-Y הכיוונים, זה נעשה על ידי קידוח חורים מאוד למקם במדויק באמצעות זול מיני הטחנה, עם חורים גדולים מספיק כדי להתאים את מרססים, כך מרססים מוחזקים במקביל זה לזה, וגם מדויק מיקום. בכיוון-Z, מרססים הם גזומים באמצעות מנגנון stereotaxic, מה שמאפשר רמת דיוק שווה ערך לזה של הניתוח stereotaxic עצמו. הדיוק נפח העולה מן הדיוק של המשאבה המילטון, כמו גם כמעט אפס מת נפח מחברים, עיבוד כרומטוגרפיה בלחץ גבוה הנוזל (HPLC) שדה. מרססים עשויים צינורות סיליקה התמזגו נימי, שהוא חזק ונוקשה מספיק כי הוא שומר על צורה מדויקת המרווח תחת לחץ, ללא עובי קיר גדול של חלופות כגון cannulas פלדה. שינויים קטנים יכולים בקלות להיות עשוי להתאים את מערך מקביל מזרק מגוון של ניסויים. לדוגמה, אם נפח קטן יותר של וירוסים או ריווח עדין נדרש, צינור נימי קטן יכול להיות מועסק, יחד עם המקדח המתאים קטן יותר. מכשירים עתידיים עשויים לנצל את ערוצי microfluidic משאבות, כדי להגדיל את מספר מרססים במקביל, כדי למזער את גודל (אולי המאפשר מכשירים כאלה להיות מותקן על ראשיהם של בעלי החיים נעים באופן חופשי).

<table><tbody><tr><td>כלי דרמל</td><td>כלי</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>חותכן לייזר</td><td>כלי</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>אקדח דבק חם</td><td>כלי</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרקים להזרקה/שליפה (משאבת Hamilton)</td><td>כלי</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;מזרקים מסוג Hamilton</td><td>כלי</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>דרוש אחד לכל נקודת הזרקה</td></tr><tr><td>סטריאוטקס לעכברים</td><td>כלי</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>מיני-טחנה מדגם Modela</td><td>כלי</td><td>רולאן</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>0.011&quot; קוטר מקדח עבור מיני-מיל (mini mill)</td><td>כלי</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; מקדח בקוטר עבור מיני-מיל (mini-mill)</td><td>כלי</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>מקדח שיניים במהירות גבוהה</td><td>כלי</td><td>לינקס</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>אביזרים למקדחה דנטלית</td><td>כלי</td><td>הערכות פירסון (Pearson Assessments)</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>קנולה מפלדת אל חלודה בעלת קוטר חיצוני (OD) של 1.5 מ"מ</td><td>חומרים</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>בורג מכונה בעל חריץ להורגב, 1-72</td><td>חומרים</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>אום משושה 1-72</td><td>חומרים</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>לוח מעגלים מודפס (PCB) לבניית אבות-טיפוס, 1/32&quot; עבה</td><td>חומרים</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>לוח אקרילי, 1/8 אינץ'&quot; עבה</td><td>חומרים</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>מחברי HPLC</td><td>חומרים</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (חלק מאלה ניתנים לרכישה במארזים של 10; פשוט הוסיפו את &amp;#8216;מכיוון שלא סופק טקסט מקור לתרגום, אנא ספק את התוכן באנגלית שברצונך לתרגם לעברית.&amp;rsquo; עד לסוף מספר החלק)</td><td>דרוש אחד לכל הזרקה לכל אתר, למעט F-252, P-627 ו-P-235, שניתן להשתמש בהם שוב</td></tr><tr><td>צינור נימי מסיליקה מותכת, קוטר חיצוני: 245 &amp;mu;מ', מזהה: 100 &amp;mu;מ'</td><td>חומרים</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>אפוקסי רב-תכליתי בעל זמן ייבוש של 5 דקות</td><td>חומרים</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>אפוקסי רב-תכליתי בעל זמן ייבוש של 5 דקות</td></tr><tr><td>צינור פוליאתילן 0.066 x 0.095 אינץ'</td><td>חומרים</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

scalable fluidic injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-d מעגלים פגוע המוח

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

ההבנה שלנו של מעגלים עצביים - איך הם לתווך חישובים תחושה המשרתים מחשבה, רגש ופעולה, וכיצד הם פגומים ב הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות - יהיה הקל מאוד עבור במהירות המיקוד גנים 3 מורכבים על ידי טכנולוגיה - מעגלים עצביים ממדי, המאפשר יצירה מהירה של &quot;מעגל ברמה transgenics&quot;. לאחרונה פיתחנו שיטות שבו וירוסים קידוד רגישים לאור חלבונים יכול לרגש סוגי תאים מסוימים כדי הפעלת אלפית השנייה, זמנים ואת ההשתקה במוח שלם. כאן אנו מציגים את תכנון וביצוע של מערך מזרק מסוגל לספק וירוסים (או נוזלים אחרים) לעשרות נקודות מוגדר בתוך מבנה 3 מימדי של המוח (<strong&gt; איור. 1A, 1B</strong&gt;). המערך כולל מזרק אחד או יותר משאבות ספיקה שכל כונן סט של מזרקים, שכל אחד מהם הזנות לתוך סיליקה התמזגו-polyimide / נימי באמצעות מחבר בלחץ גבוה, סובלני. נימים הם בגודל, ונוסף אז אל, במקומות הרצויים שצוין על ידי אישית כרסום לוח מיצוב stereotactic, ובכך מאפשר וירוסים או חומרים כימיים אחרים כדי להיות מועברת להגדיר את הרצוי של אזורים במוח. כדי להשתמש במכשיר, המנתח הראשון ממלא את המשנה fluidic לחלוטין עם שמן, backfills הנימים עם הנגיף, מחדיר את המכשיר לתוך המוח, ממלאה ריאגנטים לאט (&lt;0.1 מיקרוליטר / min). אופי מקבילים של המערך ההזרקה מקלה תיוג מהיר, מדויק ויציב של מעגלים עצביים כולה עם מטענים ויראלי כגון לרגישות אופטי כדי לאפשר לאור הפעלה השתקה של מעגלים חשמליים במוח מוגדר. יחד עם טכנולוגיות אחרות, כגון מערכי סיבים אופטיים להעברת אור קובע הרצוי של אזורים במוח, אנו מקווים ליצור ארגז כלים המאפשר חיטוט שיטתי של פונקציות עצביות סיבתי במוח שלם. טכנולוגיה זו לא רק לפתוח את הגישות שיטתי כזה מעגל ממוקד המוח אצל יונקים, ולהקל על תיוג של אזורים במוח אצל בעלי חיים גדולים כמו פרימטים לא אנושיים, אך עשוי גם לפתוח נתיב translational קליניים תא ספציפי prosthetics שליטה אופטית דיוק, אשר עשוי לאפשר טיפול משופר של הפרעות מוח סורר. לבסוף, מכשירים כגון המתואר כאן עשוי להקל דווקא בעיתוי משלוח fluidic של מטענים אחרים, כגון לתאי גזע וסוכני תרופתי, ל 3 ממדי מבנים, בצורה בקלות להתאמה אישית למשתמש.

בקרה וניתוח של מעגלים עצביים<em&gt; In vivo</em&gt; יהיה בהנחיית טכנולוגיה עבור משלוח של וירוסים ריאגנטים אחרים 3 ממדי הרצוי סטים של אזורים במוח. אנו מדגימים אישית fluidic מזרק מערך ייצור, ואספקה ​​של virally בקידוד לרגישות אופטי, המאפשר מניפולציה אופטית של מעגלים חשמליים במוח ומורכב.

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

הבנתנו לגבי מעגלים עצביים – כיצד הם מתווכים את החישובים המהווים בסיס לתחושה, מחשבה, רגש ופעולה, וכיצד הם נפגעים...

שתי חתיכות מלבניות של אקריליל נגזרות בחיתוך לייזר ולאחר מכן מורכבות ליצירת התקן הקיבוע הסטריאוטקסי, המשמש להחזקה הדוקה של מערך המזרקים ביחס למיקומים הסטריאוטקסיים. משאבת מזרקים נטענת במזרקים המחוברים לצינורות פוליאתילן עבור מעגל מוחי רצוי. מקדח משמש לקדיחת חורים שדרכם מוכנסים צינורות סיליקה מותוכה, ובכך נוצרים המזרקים.המזרקים מותקנים באופן הפיך במלחציים ולאחר מכן מקוצצים כדי להכווין אותם למעגלי המוח הרלוונטיים. כל מזרק מחובר לתעלה פוליאתילן בודדת. הכנת המערכת לשימוש כוללת מילוי של המערכת באמצעות מזרקים בשמן סיליקון, ולאחר מכן טעינת ריאגנטים נוזליים לתוך המזרקים.לאחר מכן, המזרק המקבילי מוחדר למטרות במוח והריאגנטים מוזרקים. שלום, אני סטפני צ'אן מקבוצת הנוירוביולוגיה הסינתטית ב-MIT. עד כה, ביטוי של גנים במעגלי מוח מורכבים מרחבית דרש albo יצירה איטית ויקרה של בעלי חיים טרנסגניים או תהליך מפרך של הזרקות ויראליות, שיש לבצע בצד אחד בכל פעם.היום נראה לכם כיצד לבנות ולהשתמש במערך מזריקים מקבילי שיכול להזרים נוזלים לתבניות תלת-ממדיות מורכבות במוח. אנו משתמשים במערך זה כדי ליצור במהירות עכברים טרנסגניים ספציפיים למעגלים, על ידי הזרקה מקבילית של וירוסים באמצעות קבוצת המזריקים כדי להגיע לכל היעדים בו-זמנית. ניתן להשתמש במזריק שלנו להזרקת כל ריאגנט נוזלי לפיזור מורכב של אתרים במוח.מטרתנו היום היא להעביר נגיפים המקודדים לחלבונים רגישים לאור, כך שנוכל להפעיל ולכבות בצורה מדויקת מבחינה זמנית סוגי תאים ספציפיים במעגלים ספציפיים. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בטכנולוגיה זו בשילוב עם מערכים של סיבים אופטיים המעבירים אור באופן ספציפי למעגל. אז בואו נתחיל.ראשית, נבנה תפס סטריאוטקסי המחזיק את מערך המזרקים וניתן להרכבה על מכשיר הסטריאוטקס. כדי להכין את התפס דרושים הפריטים הבאים: קנולה מפלז פלדה באורך של שני אינץ' עם קוטר חיצוני (OD) של 1.5 millimeter, כאשר קצה אחד שטוח; חתיכה קטנה של לוח PCB Protoboard בגודל של בערך 0.5 על 0.5 centimeter; ושני מלבנים זהים.בכל אחד משני המלבנים האקריליים, חתוך פיסה בגודל חצי על שלושה שמיניות אינץ' מלוח אקרילי בעובי שמינית אינץ'. חורר שני חורים מעגליים בפינות נגדיות. לחור הראשון צריך להיות קוטר של 1.5 millimeters, וגודלו צריך להיות בדיוק מספיק כדי להחזיק את הקנולה המתכתית באופן הדוק.לקדח השני צריך להיות קוטר של 1/16 אינץ'. הכנס את הקנולה ממתכת לחור של 1.5 מילימטר במלבן אחד, ולאחר מכן דרך החור של 1.5 מילימטר במלבן השני, יישר את הקצה התחתון של הקנולה עם הפנים התחתונה של המלבן התחתון כדי ליצור צורה של מקל הוקי, והנח את המרווח בין שני המלבנים. חימר פיסול יעזור להחזיק את הרכיבים יחד במהלך תהליך זה, תוך כדי שמירה על המרווח לחוץ היטב בין שני המלבנים.הדביקו את המבנה זה לזה באמצעות דבק חם מסביב לקנולה ולחורים בקוטר 1.5 מילימטר. היזהרו לא להדביק את המפריד למלבנים לאחר שהדבק התייבש במרכז. מקמו בורג 1-72 מעל החור של 1/16, ולאחר מכן הבריגו בורג 1-72 מהצד הנגדי של המלבנים.טפטפו כמויות קטנות של אפוקסי בעל זמן ייבוש של חמש דקות סביב קצוות האום כדי לקבע אותו למלבן. היזהרו שלא לאפשר לאפוקסי לחדור להברגות של האום או של הבורג. לאחר התקשחות האפוקסי, הכניסו בורג 1 72 לחור בעובי 1/16 אינץ' מהצד העליון של המלבנים והבריגו אותו אל תוך האום.הסיר את חימר המידול ואשר שניתן להחזיק את המרווח באופן יציב על ידי הידוק הבורג. ניתן להתאים את מערכת מערך המזרקים לכל סט של קואורדינטות במוח. ראשית, אתר את הקואורדינטות של אתרי ההזרקה הרצויים באטלס המוח של המין הרלוונטי והמר אותן לקואורדינטות המתאימות המשמשות את הסטריאוטקס.בהדגמה זו, נשתמש בעכבר ויהיו שלושה אתרי הזרקה, ולכן יהיו שלוש שפופרות למזרקים. קואורדינטות X, y ו-Z יתאימו לקואורדינטות המדיאלי-לטרליות, האנטריוריות, הפוסטריוריות ו/או הוונטרליות של אטלס מוח העכבר. כעת, מקמו שלוש מזרקי Hamilton של 10 µL במשאבת הזרקה ושאיבה, כגון זו של Harvard apparatus, וחברו היטב קטעי צינור פוליאתילן באורך של שלוש רגליים למחט של כל מזרק Hamilton עבור כל קטע של צינור פוליאתילן.השחילו שרוול צינור F 2 52 מעל הקצה הפתוח וחברו אותו למתאם צינור P 6 27 באמצעות אום P 2 35 ו-P 200 fal. כדי לבנות את מערך המזרקים המותאם אישית, השתמשו במקדח mini mill מדגם modela ובמקדח בקוטר 0.011 inch כדי לקדוח שלושה חורים בלוח PCB protoboard בעובי 1/32 inch. קדחו את שלושת החורים בהתאם לקואורדינטות X ו-Y היחסיות של אתרי ההזרקה, ולפני הסרת הלוח מהמקדח, קדחו מלבן מסביב לחורים הקטנים באמצעות מקדח בקוטר 1/32 inch.בשלב הבא, יש להחדיר את המזרקים הבודדים עד מחציתם לתוך כל חור, כך שיימסקו בחוזקה ויהיו מקבילים זה לזה. יש לקבע אותם ללוח באמצעות אפוקסי כדי ליצור את מערך המזרקים. להצמדת מערך המזרקים לתפס הסטריאוטקסי.מקמו פינה אחת של לוח הבדיקות (protoboard) בין המלבנים האקריליים והדקו את הבורג של התסבך הסטריאוטקסי. לאחר מכן, חברו את הקנולה המתכתית של התסבך לסטריאוטקס באמצעות מנגנון החיבור של הסטריאוטקס. השלבים הבאים מבוצעים תחת מיקרוסקופ עבור אחד המזרקים החיצוניים שניתן לגשת אליו מהצד בעזרת קצה ישר מבלי להיתקל באף אחד מהמזרקים האחרים.גזרו את הקצה הבולט מעבר לתחתית לוח הפרוטובורד (protoboard). השטיחו את הקצה באמצעות כלי דרמל. לאחר מכן, בחרו נקודת ייחוס יציבה בטווח התנועה של זרוע הסטראוטקסיס והזיזו את מערך המזרקים כך שהקצה המשטוח של המזרק החיצוני יהיה בנקודת ייחוס זו.בחרו מזרק שני יחד עם הקואורדינטות המתאימות לו. הזו את מערך המזרקים לאורך ציר Z בהתאם להפרש הגובה היחסי או כיוון Z שבין קואורדינטות המזרק הראשון והשני. קצצו את המזרק השני כך שהחוד יהיה כעת בגובה נקודת הייחוס והחליקו אותו באמצעות כלי דרמל (Dremel).ניתן להזיז את מערך המזרקים בצירים X ו-Y כדי להקל על השוואת קצה המזרק לנקודת הייחוס. לאחר חזרה על תהליך הקיצוף עבור שאר המזרקים, מערך המזרקים מוכן להרכבה למערכת השלמה. הרכבת המערכת השלמה דורשת את התפס הסטראאוטקטי שנבנה קודם לכן ואת מערך המזרקים המותאם אישית.לאחר עיקור מערך המזרקים, הכניסו את החלק האחורי של כל מזרק, הקצה שלא נגזז, לתוך שרוול פוליאתילן כחול מסוג F two 40. באמצעות אום P 2 35 ואטבת P 200, חברו את החלק האחורי של המזרק למתאם ההברגה המחובר כבר למשאבת Hamilton באמצעות צינור פוליאתילן. בעזרת מחט בכיל 27, מזריקו שמן סיליקון סטרילי לחלק האחורי של מזרקי Hamilton, כך שכל המערכת תהיה מלאה, ממזרקי Hamilton ועד לקצות המזרקים.הקפידו מאוד לא להחדיר בועות אוויר, אחרת נפח הנגיף שיוחדר לא יהיה מדויק או שהנגיף לא ייוחדר כלל. בעת החלפת מזרקי ההמילטון במשאבת ההמילטון, נשמר הנפח המירבי האפשרי של שמן סיליקון במזרקים. אם הניסוי דורש יותר משני מזרקים, ניתן להניח ספייסרים (מרווחים) במשאבת ההמילטון, כפי שעשינו כאן.לחלופין, ניתן לרכוש ערכה לשדרוג עם מספר מעמדים מ-Harvard apparatus להחזקת עד 10 מזרקים בו-זמנית. כדי להזריק את הנגיף למוח העכבר, התחל במתן משככי כאבים בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שלך. הנח את העכבר המורדם בסטריאוטקס (stereo attacks) ואשר באמצעות צביטה בבהו 통해 שהבעל sufficiently מורדם.לאחר מכן, בצעו חתך בודד לאורך קו האמצע של העור, מבין העיניים ועד לבין האוזניים. הזיזו את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת ונקו את הפסציה. הצמידו פיפטה מזכוכית משוכה למערכת הסטריאו.כווננו את מיקומי מוטות התמיכה לאוזניים עד ש-bgma ו-lambda יהיו מיושרים לאותו גובה והקו המחבר ביניהם יהיה מקביל לציר Y של מכשיר הסטריאוטקס. אפסו את מכשיר הסטריאוטקס כאשר קצה פפיטת הזכוכית נמצא ב-bgma, ולאחר מכן מקמו את הקצה מעט מעל הגולגולת בקואורדינאטות x ו-Y של אחד מאתרי ההזרקה. באמצעות מקדח שיניים, קדחו בזהירות בגולגולת מתחת לקצה עד שתישאר שכבה דקה מאוד של עצם; בעזרת מחט במידה 30 gauge, הסירו בעדינות חתיכה קטנה מהשכבה בקואורדינאטות x ו-y הנכונות כדי לחשוף את הקשת הערה (dura mater).חור זה צריך להיות גדול מספיק כדי להכניס אותו אחד מהמזרקים באופן זה. חורים קטנים ברוחב 0.25 מילימטר נקדחים בגולגולת בקואורדינטות x ו-y המתאימות לכל אתר הזרקה. לאחר השלמת הקידוח, השליכו את פיפטת היישור מזכוכית וחברו את מערך המזרקים המותאם אישית למכשיר הסטריאוטקס באמצעות התסמיך הסטריאוטקסי.על מנת לכוונן נכונה את זווית מערך המזרקים, בחרו שני מזרקים חיצוניים שיכוילו ביחס לנקודת ייחוס נתונה. לאחר התאמת אחד המזרקים לנקודת הייחוס, בחנו את מרחקי ה-X וה-Y היחסיים בין אתרי ההזרקה של מזרק זה לבין זה השני. העבירו את מערך המזרקים בכיווני x ו-y לפי מרחקים יחסיים אלו. אם המזרק השני אינו מיושר עם נקודת הייחוס, יש לשחרר את הקנולה המתכתית ולסובב אותה.חזור על תהליך זה באופן חזרתי עד שזווית מערך המזרקים תהיה נכונה. הגדר את קצב המילוי של משאבת ה-Hamilton ל-1 µL לדקה ומלא מחדש את המזרקים בשמן סיליקון עד שהמזרקים יגיעו לנקודת ה-2 µL או יותר. פעולה זו מספקת כמות שמן רזרבית, כך שניתן יהיה להסיר בקלות בועות אוויר או סתימות בקצה על ידי דחיפת שמן קדימה באמצעות משאבת ה-Hamilton, מבלי שיהיה צורך למלא מחדש את כל המערכת בשמן סיליקון מאחור המזרקים כפי שמתואר קודם לכן.הניחו פיסת פאראפיל (paraform) נקייה על הגולגולת והורידו בעדינות את המזרקים אל תוך הפאראפיל. אם הכוונה היא להחדיר מיקרוליטר אחד של וירוס לכל אתר, טפטפו באמצעות פיפטה 1.5 µL של וירוס על הפאראפיל עבור כל אתר, עם קצב מילוי זהה של 1 µL לדקה. מלאו 1.2 µL של הווירוס לתוך כל מזרק.אפס את קצה המזריק הארוך ביותר ב-bgma, ולאחר מכן הזז את מערך המזריקים לקואורדינאטות X ו-Y של אותו מזריק. הורד את מערך המזריקים דרך החורים הקטנים שנוצרו עם מחטים בכישור 30 כדי לתקן את עומק ה-Z. הזרק 1 µL של וירוס דרך כל מזריק בקצב של 0.1 µL לדקה או לאט יותר.השאירו את ההזרקות ללא התערבות למשך 30 דקות כדי לאפשר להן להתפשט. לאחר 30 דקות, שלפו באיטיות את מערך המזרקים מהמוח. לאחר מכן, הגדירו את משאבת ה-Hamilton להזרקה באותו קצב של 0.1 microliters לדקה כדי לבדוק אם קיימת סתימה בכל מזרק.לאחר מכן, נקו את המזרקים על ידי מילוי מחדש והזרקה של 2 µL אתנול בקצב של 2 µL לדקה. לבסוף, מלאו מחדש את המזרקים בשמן סיליקון כדי לשמור על אזור חיץ של 2 µL בכל מזרק Hamilton. איור זה מציג את התוצאה של שימוש במערך המזרקים שהוצג זה עתה, המכיל שלוש קנולות, להחדרה של רכיבים ויראליים לחלקים מפוזרים במוח העכבר.במקרה זה, המטען הגנטי של הווירוס מכיל את המולקולה הפלואורסצנטית GFP, מה שמוביל לשלושה נפחים פלואורסצנטיים של תאים מסומנים בשלב אחד. באופן עקרוני, ניתן להשתמש במספר שרירי של קנולות כדי לבנות מערך מזריקי וירוס. כאן, לדוגמה, מוצג מערך מזריקים המתאים למיקוד דו-צדדי של אזור ה-ca1 בהיפוקמפוס עם 16 מזריקים.באמצעות הפרוטוקול שהצגנו בפניכם היום, תוכלו להחדיר וירוס בתבנית תלת-ממדית למוח, ובכך ליצור ביעילות טרנסגניקה ברמת המעגל העצבי. בנוסף, ניתן להשתמש במערך המזרקים המקבילי כדי להחדיר כל ריאגנט נוזלי למוח, מה שעשוי לאפשר, למשל, החדרת אגוניסטים דופמינרגיים בתבנית מסוימת למעגלים עצביים ספציפיים בבעל חיים בעל ראש מקובע בזמן התנהגות. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה, אנו מציגים שיטה להפוך מחטים נימי זכוכית עם לומן 50 מיקרומטר. טכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את הנזק המוחי, ממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים.

מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

מקור: Pereira, M. et al., In vivo Direct Reprogramming של תאי גליה תושבים לאינטרנוירונים על ידי הזרקה תוך מוחית של וקטורים ויראליים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הזרקה סטריאוטקסית של נגיף הקשור לאדנו לקליפת המוח של עכבר טרנסגני כדי להעביר תכנות מחדש של עצבים תלויי Cre וגנים מדווחים פלואורסצנטיים לתאי גליה.

הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

המוח הוא אתר ייחודי עם איכויות שאינם מיוצגות היטב על ידי במבחנה או ניתוחים מחוץ לרחם. מודלים עכבר orthotopic עם מאפייני מיקום וצמיחה לשחזור ניתן ליצור באופן אמין עם זריקות תוך גולגולתי באמצעות מכשיר קיבוע stereotaxic ומשאבת מזרק בלחץ נמוך.

יצירה אנטומית מדויק והשחזור תוך גולגולת xenografts של גידולים במוח אדם

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

כאן, אנו מדגימים תהודה מגנטית (MR)-הסעה מודרך משופרת משלוח (משופר) של וקטורים ויראלי לתוך קליפת המוח כגישה יעילה ומפושטת להשגת ביטוי אלקטרואופטיקה על פני אזורים קורטיקליים גדולים במוחו של מקוק.

הסעה משופר משלוח אלקטרואופטיקה Adeno-וקטור ויראלי הקשורים לקליפת מקוק רזוס תחת הדרכה של תמונות MRI מקוונות

המתואר כאן הוא הליך סטריאוטקטי שיכול למקד אזורים מאתגרים וקשים להשכה למוח (בשל מגבלות מרחביות) באמצעות גישה קורונטית זוויתית. פרוטוקול זה מותאם הן למודלים של עכברים והן למודלים של חולדות וניתן ליישם אותו על יישומים מוחיים מגוונים, כולל השתלת צינורית ומיקרו-נג'קציה של מבנים ויראליים.

גישה סטריאו-טיאו-טסטרואקטיבית מסתגלת לטכניקות רב-תכליתיות במדעי המוח

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בפלטפורמה רובוטית למיקרו-זיקיה לתאי גזע עצביים בודדים ונוירונים בפרוסות מוח. טכניקה זו היא רב-תכליתית ומציעה שיטה למעקב אחר תאים ברקמה ברזולוציה מרחבית גבוהה.

מניפולציה של תאי גזע עצביים יחיד ונוירונים בפרוסות מוח באמצעות Microinjection רובוטי

כפי שמיושם כיום, אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים דורשת הזרקה של וקטורים נגיפיים למוח. שיטת הזרקה אופטימלית צריכה להיות אמינה, ועבור יישומים רבים, מסוגלת להתמקד באתרים בודדים בעלי עומק שרירותי המזוהים בקלות ובאופן חד משמעי בהיסטולוגיה שלאחר המוות. שיטת הזרקה עם תכונות אלה מוצגת.

זריקות של וקטורים AAV לאופטוגנטיקה במוח פרימטים מורדם וער המתנהג באופן לא אנושי

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

למדו כיצד לבנות מערך מזרקים נוזליים מקבילי להזרקת וירוסים למעגלים עצביים מורכבים במוח. שיטה זו מאפשרת מניפולציה אופטית מדויקת של תאים ספציפיים ומאיצה מחקרים בנוירוביולוגיה ובאופטוגנטיקה.

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

גלה סרטונים נוספים