Lentivirus הפקה
2 באוקטובר 2009
כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.
הליך זה מתחיל בהעברת 2 9 3 תאי T עם וקטורים של לנטי-וירוס, פלסמיד ואריזה ויראלית, הסופרנטנט הנגיפי נקצר לאחר תקופת דגירה של 48 שעות לפחות. הסנאט מסונן לריכוז עם אולטרה-צנטריפוגה לאחר אולטרה-צנטריפוגה. הגלולה הנגיפית מושעה מחדש עם PBS כדי להשיג טיטר נגיף, תחילה לדלל את הנגיף המרוכז במדיה שלמה, ולאחר מכן לבצע דילול סדרתי כדי להדביק תאים ב-lentivirus.
היי, אני שיין וונג מהמעבדה של מייקל מקמנוס במרכז לסוכרת באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. אני מייקל מקמנוס. היום נראה לכם נוהל לייצור נגיפי לנטי.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לייצר לנטי-וירוסים להפרעות RNA. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הכינו את הדנ"א שבעזרתו ניתן להעביר את תאי ה-T 2 9 3.
ראשית יש לדלל את ריאגנט הטרנספקציה של גן FU 6 בשפופרת של 1.5 מיליליטר על ידי ערבוב של 30 מיקרוליטר פוג'י שש עם מדיום חופשי של 600 מיקרוליטר בסרום. היזהר לא לתת לפוג'י לגעת בצד הצינור כשאתה מעביר אותו לטמפרטורת החדר הבינונית למשך חמש דקות. לאחר מכן, במכסה הצינור, מערבבים ארבעה מיקרוגרם פלסמיד לנטי-ויראלי עם 1.33 מיקרוגרם.
כל וקטורי אריזה ויראליים מהדור השלישי. הפלסמיד הלנטי-ויראלי מכיל את ה-DNA. הנגיף יכניס לגנום של כל תא מדביק, בעוד וקטורי האריזה מכילים גנים לכל שאר החלבונים הנדרשים כדי לגרום לנגיף עדשים, לסגור את המכסה ולערבב על ידי היפוך הצינור כמה פעמים.
דגרו את ה-DNA ומגיב הטרנספקציה למשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. עכשיו הגיע הזמן להעביר 2 9 3 תאים עם ה- DNA שהכנת השתמש בתאים שציפית 24 שעות מראש והגיעו לשטף של 50 עד 70% בפיפטת מכסה המנוע של תרבית הרקמה את כל ה- DNA המוכן על צלחת 2 9 3 מעורבב בעדינות על ידי הטיית הצלחת קדימה ואחורה, החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לייצור הנגיף להמשיך 48 עד 96 שעות לפני הקציר. במהלך הדגירה, התאים 2 9 3 מייצרים לנטי-וירוסים שהגנום שלהם מכיל עותק RNA של ה-DNA המעניין שלך.
עכשיו הגיע הזמן לאסוף את הנגיף. הוציאו את התאים שלכם מהאינקובטור. הכינו במכסה המנוע של תרבית רקמות, מסנן מזרק של 0.4 או חמישה מיקרון, מזרק חד פעמי של 10 מיליליטר וצינור צנטריפוגה UltraClear Beckman.
השתמש במזרק החד פעמי כדי להסיר את הסופרנטנט, המכיל כעת את הנגיף. חבר מסנן מזרק 0.45 מיקרון לקצה וסנן את הנגיף לתוך צינור צנטריפוגה UltraClear Beckman. המסנן מאפשר רק לנגיפים ולא לתאים לעבור לפני השלכתם, ודוגר על כל התאים המייצרים נגיפים.
צלחות תרבות, מזרקים ומסננים ב-10% אקונומיקה למשך 45 דקות. כעת, לאחר שאספתם וסיננתם את הנגיף, הגיע הזמן לרכז את הנגיף על ידי אולטרה-צנטריפוגה תחילה. השתמש ב-DMEM ללא סרום כדי לאזן את כל השפופרות המכילות וירוסים לטווח של 0.2 גרם זה מזה.
לאחר מכן, טען את צינורות הצנטריפוגה המאוזנים לתוך דליי רוטור SW 41 TI או SW 28. אטום את דליי הרוטור סגור וחבר אותם לרוטור. לאחר מכן הנח את הרוטור בתוך האולטרה-צנטריפוגה.
סובב את הנגיף במשך כ-90 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב-25,000 סל"ד ברוטור SW 41 TI, או 24,000 סל"ד ברוטור SW 28. לאחר הצנטריפוגה, חזור למכסה המנוע של תרבית הרקמות והפוך את הצינור כדי לשפוך את ה- SNAT למיכל המכיל 10% אקונומיקה. השתמש במגבון קים כדי לספוג עודפי נוזלים סביב הגלולה והפוך את הצינור במתלה נוח לא יותר מחמש דקות עד שאתה מוכן להשעות מחדש את הגלולה.
כדי להשעות מחדש את הגלולה הוויראלית, השתמש בקצה מסנן כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של PBS סטרילי מסונן מראש לצינור שלך. לאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה כ -20 פעמים. השאירו את הנגיף בארבע מעלות למשך הלילה כדי להשלים את ההשעיה מחדש.
אתה יכול לאחסן הכנות ויראליות בארבע מעלות למשך כשבוע ובמינוס 80 מעלות עד שנה. זכור לטפל בכל הצינורות הריקים ב-10% אקונומיקה לפני השלכתם. אם אתה מתכוון להשתמש בהכנה הנגיפית יותר משבוע, היא תישמר במקרר.
בצע מינימום של 5 עד 20 מיקרוליטר לניסויים עתידיים ומינימום אחד של 3 עד 5 מיקרוליטר להקפאת הטיטרציה ואחסן את האליקוטים בערך במינוס 80. השלב הבא הוא קביעת הטיטר הנגיפי. אם כללת גן מדווח פלואורסצנטי בתאים הנגועים בפלסמיד הלנטי-ויראלי שלך יזוהר ותוכל לקבוע את הטיטר הנגיפי באמצעות ציטומטריית זרימה.
כדי להתחיל, יש לדלל שלושה מיקרוליטרים של נגיף מרוכז ל -1.5 מיליליטר של מדיום שלם בבארות, אחד עד שישה. בשורה אחת של צלחת 96 בארות. בצע את הדילולים הסדרתיים הבאים לכל שש הבארות ב-100 מיקרוליטר של DM.To שלם, הבאר הראשונה הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום ללא וירוס.
זו השליטה הבלתי מוכתמת שלך. לשני, הוסיפו היטב 100 מיקרוליטר של הנגיף המדולל לשלישי. ובכן מוסיפים 100 מיקרוליטר מהתערובת מהבאר השנייה לרביעית.
ובכן מוסיפים 100 מיקרוליטר מהבאר השלישית לחמישית. ובכן מוסיפים 100 מיקרוליטר מהבאר הרביעית ולשישית. ובכן מוסיפים 100 מיקרוליטר מהחמישי.
ובכן, סוף סוף מוציאים 100 מיקרוליטר מהבאר השישית וזורקים ומלבינים מביאים את הנפח הכולל בכל הבארות ל-200 מיקרוליטר עם DMEM. עם כל דילול, ריכוז הנגיף יורד בחצי. שימו לב שאלו רק דילולים מומלצים, שאמורים לעבוד היטב לטיטרציה של רוב הנגיפים המרוכזים.
אם הנגיף שלך נמוך בטיטר או לא מרוכז, ייתכן שתצטרך להתאים את הדילול שלך. טפלו בכל וירוס מדולל שאינו בשימוש עם אקונומיקה של 10% למשך 45 דקות לפני השלכתם למיכל פסולת ביולוגית. הוסף כ-15,000 תאי T בריאים המחלקים באופן פעיל 2 9 3 תאי T לכל אחת משש הבארות.
אתה יכול להשתמש בצלחת אחת של 96 בארות כדי לטשטש 16 הכנות ויראליות, למלא בארות ל-200 מיקרוליטר, להחזיר תאים לאינקובטור ולאפשר לזיהום להמשיך לפחות 48 שעות. לאחר הדגירה, נתח את הקרינה של התא באמצעות ציטומטר זרימה. אתה יכול להשתמש באחוז התאים הפלואורסצנטיים לבאר כדי לקבוע את הטיטר או מספר החלקיקים הנגיפיים הזיהומיים למיליליטר של נגיף שנוסף.
חשב את מספר היחידות המזהימות למיליליטר עם הנוסחה הבאה בעת פירוש זרימה. תוצאות ציטומטר. שימו לב שניתן להשיג חישובי טיטר מדויקים רק כאשר תאים נגועים קיבלו לא יותר מאינטגרציה ויראלית אחת לכל תא.
על מנת להבטיח שזה המקרה, השתמש בתאים עם שיעור זיהום נמוך מ-15% לחישובים. תאים עם שיעורי זיהום גבוהים יותר ככל הנראה קיבלו אינטגרל ויראלי מרובה לכל תא. הדילול המוצע בשלב השני אמור להניב מספר דגימות בטווח זיהום זה.
באופן אידיאלי השתמש במספר דוגמאות כדי ליצור עלילת טיטרציה שממנה תוכל לחשב את הטיטר הסופי. ניתן להשתמש בנוסחה המחושבת מהקו הליניארי המותאם לחישוב הטיטר הנגיפי, אך ניתן לחשב טיטר באמצעות דגימה בודדת במידת הצורך. ניתן לצפות לטיטר של 10 פעמים 10 ליחידות התמרה שביעית למיליליטר עבור נגיף לא מרוכז, ואחד כפול 10 עד יחידות התמרה שמינית למיליליטר עבור נגיף מרוכז.
זה עתה הראינו לך כיצד לייצר לנטי-וירוסים בעת ביצוע הליך זה. חשוב להקפיד על כל תקנות הבטיחות הביולוגית ולהשליך פסולת כראוי. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מפרט את הנוהל לייצור לנטי-וירוסים באמצעות תאי אדם 293. התהליך כולל העברת גנים לתאים עם וקטורי DNA, קצירת העל-תרבות הנגיפי ובדיקת ריכוז הנגיף דרך ביטוי פלורוסצנטי.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- וירולגיה
- טיפול גנטי
- ביולוגיה תאית
רקע
- לנטי-וירוסים הם כלים חשובים להעברת גנים.
- תאי אדם 293 משמשים בדרך כלל לייצור וירלי.
- הבנת ריכוז הנגיף היא חיונית ליישומים יעילים.
- ביטוי פלורוסצנטי מאפשר כימות של חלקיקים נגיפיים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה אמינה לייצור לנטי-וירוסים.
- לספק תובנות לגבי תהליכי ההעברה והקציר.
- לאפשר שימוש בלנטי-וירוסים ביישומי מחקר וטיפוליים.
שיטות ששימשו
- העברת גנים לתאי 293T עם לנטי-וירוסים ווקטורי אריזה.
- דגירה לפחות 48 שעות כדי לאפשר ייצור נגיפי.
- קצירה וסינון של העל-תרבות הנגיפית.
- אולטרה-צנטריפוגה כדי לרכז את הנגיף.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של לנטי-וירוסים מתאי 293T.
- ריכוז יעיל של חלקיקים נגיפיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.
- קביעה מדויקת של ריכוז הנגיף דרך דילול סדרתי.
- הוכחת אמינות הנוהל ליישומים עתידיים.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לייצור לנטי-וירוסים.
- קביעת ריכוז על בסיס פלורוסצנציה היא יעילה.
- פרוטוקול זה ניתן להתאמה לצרכי מחקר שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Lentivirus production enables robust gene silencing and functional genomics studies across diverse cell types, supporting early discovery and target validation in biopharma R&D. Quantitative titering via flow cytometry ensures reproducibility and scalability for downstream screening and mechanistic studies. This capability underpins predictive confidence and risk-adjusted decision-making at key portfolio inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables stable gene knockdown for interrogation of gene function in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise modulation of target expression.
- Facilitates functional target validation through reproducible delivery of shRNA constructs.
Screening & Assay Development
- Provides standardized lentiviral stocks for consistent assay development and compound screening.
- Delivers quantitative viral titers to ensure reproducible infection rates across experiments.
- Enables scalable production for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical model validation when gene silencing is required.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling pathway interrogation in relevant cell systems.
- Reduces biological ambiguity in preclinical studies through controlled gene modulation.
Pipeline & Workflow Integration
Lentivirus production integrates into the discovery-to-preclinical continuum, providing a reusable platform for gene modulation and functional studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene knockdown.
- Screening: Supplies reproducible, titered viral stocks for assay readiness and quantitative outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of infection efficiency and gene silencing via flow cytometry.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through consistent gene modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across multiple targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible lentiviral preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and biosafety procedures.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for concentration and titering.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible viral production and quantification.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for specific systems.
- Strict biosafety and waste disposal protocols must be followed throughout the workflow.
