Name: Lentivirus הפקה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למדו להפיק לנטיווירוסים באמצעות תאי 293T אנושיים לצורך העברת גנים וטיפול גני. השיטה כוללת טרנספקציה, ריכוז באולטרצנטריפוגה וקביעת כמות נגיפים באמצעות ביטוי פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סנדלר אסטמה בסיסי Research Center (סיף) קרן סנדלר

חלק 1: transfection של HEK 293 תאים כדי לייצר Lentiviruses * 24 שעות לפני, transfection צלחת 2.5 X 10 6 תאים צלחת 10 ס&quot;מ עבור confluency של 50-70% למחרת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל בפרוטוקול זה על ידי הכנת ה-DNA עם איזה מהם יהיה מאוחר transfect תאים של אדם לעשות וירוס. ראשית, לדלל FuGENE 6 מגיב transfection רוש, מגיב השומנים שהופכים תאים לקחת את ה-DNA. בתוך צינור 1.5 מ&quot;ל, פיפטה 30μl FuGENE 6 לתוך מדיום סרום ללא 600ul (SFDMEM). היזהרו לא לתת FuGENE לגעת בצד של הצינור כפי שהוא מועבר לתוך המדיום. בואו הזה FuGENE ומערבבים SFDMEM ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכובע של הצינור, לערבב 4 מיקרוגרם lentiviral פלסמיד עם 4 מיקרוגרם כל 3 הדור השלישי וקטורים ויראליים אריזה (pMDL, pRSV pVSV ו-G). Lentiviral פלסמיד המכיל את ה-DNA הווירוס יהיה להכניס לתוך הגנום של כל תא הוא מדביק, בעוד וקטורים האריזה מכילים גנים לכל וחלבונים אחרים הדרושים כדי לבצע lentivirus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה ומערבבים על ידי צינור inverting כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה התוכן של הצינור לתוך צלחת 293. מערבבים בעדינות על צלחת הטיה קדימה ואחורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את התאים החממה ולאפשר ייצור ויראלי להימשך 48-96 שעות לפני הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, 293 תאים לתעתק את ה-DNA של עניין מן הפלסמיד lentiviral, יצירת עותק של RNA לבנות את lentiviral. הם גם לתמלל ולתרגם את הגנים של וקטורים אריזה לחלבונים ויראליים. חלבונים אלה להמשיך לייצר וירוסים המכילים את הגרסה של RNA לבנות lentiviral שלך, הווירוס יהיה הפוך להעתיק ולהכניס לתוך הגנום של כל התאים שהוא מדביק. </li></ol> חלק 2: קציר lentiviral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, לקחת תאים מתוך האינקובטור ולהשתמש מזרק חד פעמי, 10 מ&quot;ל להסיר את supernatant, אשר מכיל כעת את הנגיף. יהיו כ 10 מ&quot;ל של supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף לסנן מזרק 0.45μM אל קצה ולסנן את הווירוס לתוך צינור ultracentrifuge Beckman. המסנן מאפשר רק וירוסים, ולא התאים לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השלכת, דגירה כל וירוס תאים מייצרי, צלחות תרבות, מזרקים מסננים אקונומיקה 10% במשך 45 דקות. </li></ol> חלק 3: ריכוז lentiviral דרך ultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען צינורות צנטריפוגות לתוך SW-41Ti או SW-28 דליים הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסרום ללא DMEM לאזן כל וירוס המכילים צינורות אל תוך 0.2g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם לסגור דליים הרוטור קרס אותם על הרוטור לפני הצבת הרוטור בתוך ultracentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הנגיף במשך 90 דקות ב ultracentrifuge ב 4 ° C בסל&quot;ד 25,000 ב הרוטור SW-41Ti או 24,000 סל&quot;ד ב הרוטור SW-28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף בתרבית רקמה, להפוך צינורות הפוך supernatant לשפוך לתוך מיכל המכיל אקונומיקה 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Kimwipe לספוג עודפי נוזלים סביב גלולה ו להפוך את הצינור במעמד נוח לא יותר מחמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחדש את להשעות את גלולה ויראלי, השתמש טיפ לסנן להוסיף 100 PBS סטרילי μL אל הצינור, ואז פיפטה למעלה ולמטה כ -20 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את וירוס ב 4 מעלות למשך הלילה כדי להשלים מחדש ההשעיה C. אפשר לאחסן preps ויראלי ב 4 מעלות במשך שבוע על 1 ו - ב -80 מעלות למשך עד שנה. זכור להתייחס לכל שפופרות ריק עם אקונומיקה 10% לפני השלכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מישהו מתכוון להשתמש הכנה ויראלי עבור יותר משבוע 1, לעשות aliquots מינימלי של 5-20μl לניסויים עתידיים aliquot 1 של 3 עד 5μl עבור טיטרציה. להקפיא ולאחסן את aliquots בגיל 80 מינוס. </li></ol> חלק 4: טיטרציה lentiviral שימוש cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא לקבוע את titer ויראלי ידי cytometry הזרימה. שיטה זו פועלת רק במקרים שבהם lentiviral פלסמיד המכיל את הגן כתב ניאון. הרעיון הוא שכאשר נגיף מדביק תא, היא מציגה את ה-DNA פלסמיד lentiviral לתוך הגנום של התא הזה. תא נגוע לאחר מכן לתמלל ולתרגם את הגנים אתה נכלל פלסמיד lentiviral, ואם אתה כללו גן הכתב ניאון, תאים נגועים יהיה לזרוח. רמת הקרינה מייצג את העוצמה, או titer, של הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מניות ויראלי להיות titered, לדלל 3 μl של נגיף מרוכז לתוך 1.5 מ&quot;ל של מדיה מלאה (DMEM, עט סטרפטוקוקוס, גלוטמין, FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 1-6 בארות בשורה בודדת של צלחת 96 היטב, לבצע דילולים סדרתי הבאים: לכל 6 בארות להוסיף 100 μl של שלמה DMEM התקשורת. כדי הראשונה גם להוסיף 100μl של התקשורת עם וירוס לא (זה בלא כתם השליטה שלך), אל השני היטב להוסיף 100 μl של הנגיף בדילול מלא (שהוא שווה ערך מ&quot;ל to1 של נגיף חי), על השלישי גם להוסיף 100 μlתמהיל מן השני היטב, הרביעי גם להוסיף 100 מ&quot;ל מן 3 היטב, החמישי טוב להוסיף 100μl מהבאר 4, וכדי השישי היטב להוסיף 100 μl של 5 היטב. לבסוף לקחת 100ul מתוך הבאר 6 וזורקים ב אקונומיקה. דילול סדרתי בוצעה בו היטב לכל אחד מהם יש חצי נפח של הנגיף בהשוואה אחד לפני זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את הנפח הכולל של הבארות כל 200μl. שים לב כי אלה דילולים הציע בלבד, אשר אמור לעבוד גם עבור titering וירוסים המרוכזת ביותר. אם הנגיף הוא נמוך titer, או unconcentrated אפשר צריך להתאים את דילולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו כל וירוס בדילול מלא בשימוש עם אקונומיקה 10% במשך 45 דקות לפני השלכת לתוך מיכל פסולת Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את ~ 15,000 בריא, פעיל חלוקת 293 תאים לכל אחד 6 בארות. צלחת 96-היטב יחיד יכול לשמש titer 16 preps ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור התאים 37 מעלות באינקובטור עם 5% CO 2 ולאפשר זיהום להמשיך לפחות 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, התאים הם ניתחו לביטוי עיתונאי (ב הקרינה במקרה שלנו) עם cytometer זרימה. חלקיקים נגיפיים נבדקת ונרשמת אחוזים של תאים פלורסנט לכל טוב. </li></ol> לחשב את מספר יחידות זיהומיות לכל מ&quot;ל עם הנוסחה הבאה: <div style="text-align:center;;text-align:right;direction:rtl"> (# של תאים לכל גם ביום של תאים זיהום X כתב חיובי) X 1000 ______________________________________________________ מ&quot;ל של וקטור להוסיף גם </div> חלק 5: תוצאות נציג: לאחר transfection 48 שעות שלאחר תקופת הדגירה, את צלחת של 293 תאים צריך להיות בסביבות 90% ניאון. אחוז גבוה של תאים פלורסנט אינדיקציה אחוז גבוה של תאים וירוס לייצר. לאחר צנטריפוגה, גלולה ויראלי היא בקושי נראית לעין כאשר resuspending. זה נורמלי כמו גלולה היא ברורה קטן מאוד. כאשר לפרש cytometer תוצאות זרימה, יש לציין כי ניתן להשיג רק חישובים titer מדויק כאשר נגוע (ניאון) התאים קיבלו לא יותר אינטגרציה ויראלי לכל תא. על מנת להבטיח כי זה המקרה, יש להשתמש בתאים עם שיעור &lt;זיהום 15% עבור חישובים. תאים עם שיעורי זיהום גבוהים קיבלו סביר integrants ויראלי מרובות לכל תא. דילולים הציע בשלב 2 צריך להניב מספר דוגמאות בטווח זה של זיהום. באופן אידיאלי, להשתמש כמה דגימות כדי ליצור עלילה טיטרציה (קו ליניארי) שממנו ניתן לחשב את titer הסופי, אבל אתה יכול לחשב titer באמצעות מדגם יחיד, במידת הצורך. אפשר לצפות titer של 1.0 x 10 7 TU / ml וירוס בלתי מרוכז 1.0 x 10 8 TU / ml וירוס מרוכז.

<ol><li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors.%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.</a> Gene Therapy. , 72-7211 (2000).</li>
<li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>DMEM, תאי HEK 293T, פניצילין-סטרפטומיצין, גלוטמין, Phosphate-buffered saline, FBS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכן טרנספקציה FuGENE 6, pSico mCherry, pMDL, pRSV, pVSVG</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומר הלבנה</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים 10-cm, צלוחיות תרבית תאים 96 בארות</td><td>Falcon BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>פיפט רב-ערוצי</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טיפי פיפט עם מסנן</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות Eppendorf 1.5ml, מזרק, מסנן מזרק (0.45-&amp;mu;m)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות לאולטרסנטריפוגה</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור לתרביות רקמה ב-5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור Beckman SW41T.I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולטרסנטריפוגה Beckman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת FACS Array</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lentivirus הפקה

Lentivirus Production

התערבות RNA (RNAi) היא מערכת של להשתקת גנים בתאים חיים. ב RNAi, גנים הומולוגיים ברצף RNAs התערבות קצרות (siRNA) מושתקים במצב שלאחר תעתיק. RNAs מכבנה קצר, מקדימים siRNA, ניתן לבטא באמצעות lentivirus, המאפשר RNAi במגוון רחב של סוגי תאים. Lentiviruses, כגון וירוס הכשל החיסוני האנושי, הם מסוגלים להדביק גם חלוקת ולא חלוקת התאים. נתאר תהליך אשר עד lentiviruses החבילה. אריזות מתייחס הכנת וירוס המוסמכת וקטורים מ-DNA. Lentiviral ייצור מערכות וקטור מבוססים על מערכת &quot;פיצול&quot;, כאשר הגנום הנגיפי טבעי כבר התפצלה בונה עוזר אישי פלסמיד. זה פיצול של אלמנטים ויראליים שונים לארבע וקטורים נפרד מפחית את הסיכון של יצירת שכפול נגיף המסוגל ידי רקומבינציה adventitious של הגנום lentiviral. כאן, וקטור המכיל את shRNA עניין ושלושה וקטורים אריזה (p-VSVG, pRSV, pMDL) הם transfected transiently לתוך 293 תאים אנושיים. לאחר תקופה לפחות 48 שעות דגירה, supernatant וירוס המכיל נאסף ומרוכז. לבסוף, titer וירוס נקבעת על ידי הכתב (ניאון) הביטוי cytometer זרימה.

כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.

Lentivirus הפקה

השתקה באמצעות RNA (RNA interference או RNAi) היא מערכת להשתקת גנים בתאים חיים. ב-RNAi, גנים בעלי רצף הומולוגי ל-RNAs קצרים משתקים (siRNA) הם...

הליך זה מתחיל בהעברה (transfection) של תאי 2 9 3 T עם לנטי-וירוס, פלסמיד ווקטורים לאריזה ויראלית, כאשר התסנין הוויראלי נאסף לאחר תקופת דגירה של 48 שעות לפחות. התסנין מסונן כדי להיות מרוכז באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לאחר ביצוע אולטרה-צנטריפוגציה. המשקע הוויראלי מומס מחדש ב-PBS כדי לקבוע את התר, ראשית מדוללים את הוירוס המרוכז במצע גידול מלא, ולאחר מכן מבצעים דילול סדרתי כדי להדביק את התאים בלנטי-וירוס.שלום, אני שיין וונג מהמעבדה של מייקל מקמאנוס במרכז לסוכרת באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. אני מייקל מקמאנוס. היום נדגים לכם פרוטוקול להפקה של לנטי-וירוסים.אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי להכין לנטי-וירוסים עבור השתקה (RNA interference). אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הכינו את ה-DNA שבו תבצעו טרנספקציה לתאי 2 9 3 T.ראשית, דללו את ריאגנט הטרנספקציה FU gene six במבחנה של 1.5 מיליליטר על ידי ערבוב של 30 µL של Fuji six עם 600 µL של מצע ללא סרום. הקפידו ש-Fuji לא ייגע בדפנות המבחנה בעת הוספתו למצע, והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, במכסה של המבחנה, ערבבו 4 µg של פלסמיד לנטי-ויראלי עם 1.33 µg.כל אחד מוטורי אריזה ויראליים מהדור השלישי. הפלסמיד הלנטי-ויראלי מכיל את ה-DNA. הווירוס יטמע בתוך הגנום של כל תא שיודבק, בעוד שמוטורי האריזה מכילים גנים לכל שאר החלבונים הדרושים ליצירת וירוס לנטי. סגור את המכסה וערבב על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים.דגרו את ה-DNA ואת ריאגנט הטרנספקציה במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר. כעת הגיע הזמן לבצע טרנספקציה לתאי 293 עם ה-DNA שהכנתם; השתמשו בתאים שזרעתם 24 שעות מראש והגיעו ל-50% עד 70% קוֹנפְלוּאֶנְסִי (confluency) בתוך מנף התרבית. העבירו בעזרת פיפטה את כל ה-DNA שהוכן אל צלחת תאי ה-293, ערבבו בעדינות על ידי הטיית הצלחת קדימה ואחורה, והחזירו את התאים לאינקובטור כדי לאפשר להפקת הנגיפים להימשך במשך 48 עד 96 שעות לפני הקציר. במהלך הדגירה, תאי ה-293 מייצרים לנטיוירוסים שגנומיהם מכילים עותק RNA של ה-DNA הרצוי.עתה הגיע הזמן לאסוף את הווירוס. הוצא את התאים מהאינקובטור. הכן במנדף לתרביות רקמה מסנן מזרק של 0.4 או חמישה מיקרון, מזרק חד-פעמי של 10 מיליליטר ושפופרת צנטריפוגה מסוג UltraClear של Beckman.השתמש במזרק חד-פעמי כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant), המכיל כעת את הנגיף. חבר מסנן מזרק של 0.45 מיקרון לקצה המזרק וסנן את הנגיף אל תוך מבחנת צנטריפוגה מסוג UltraClear Beckman. המסנן מאפשר רק לנגיפים, ולא לתאים, לעבור דרכו; לאחר מכן השלך את התאים המייצרים נגיפים שנותרו באינקובציה.השרו פלטות תרבית, מזרקים ומסננים בתמיסת אקונומיקה 10% למשך 45 דקות. כעת, לאחר שאספתם וסיננתם את הווירוס, הגיע הזמן לרכז תחילה את הווירוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. השתמשו ב-DMEM נטול סרום כדי לאזן את כל המבחנות המכילות וירוס כך שההפרש ביניהן לא יעלה על 0.2 גרם.בשלב הבא, העמיסו את מבחנות הצנטריפוגה המאוזנות לתוך דליי הרוטור מסוג SW 41 TI או SW 28. אטמו את דליי הרוטור והשחילו אותם אל הרוטור. לאחר מכן, הניחו את הרוטור בתוך האולטרה-צנטריפוגה.סובב את הווירוס במשך כ-90 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהירות של 25,000 RPM ברוטור SW 41 TI, או במהירות של 24,000 RPM ברוטור SW 28. לאחר הצנטריפוגציה, חזור למנדף של תרבית הרקמה והפוך את המבחנה כדי לשפוך את ה-SNAT לתוך מכל המכיל 10% bleach. השתמש בנייר Kim wipe כדי לספוג נוזלים עודפים מסביב למשקע והפוך את המבחנה על גבי מעמד נוח למשך לא יותר מחמש דקות, עד שתהיה מוכן לביצוע רספנסיה של המשקע.כדי להמיס מחדש את משקע הנגיף, השתמשו בטיפ עם פילטר כדי להוסיף 100 µl של PBS סטרילי שעבר סינון מוקדם לשפופרת. לאחר מכן, בצעו פיפטינג (שאיבה ופליטה) כ-20 פעמים. השאירו את הנגיף בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי להשלים את ההמסה.ניתן לאחסן תכשירים נגיפיים בטמפרטורה של ארבע מעלות למשך כשבוע ובטמפרטורה של מינוס 80 מעלות למשך עד שנה אחת. זכרו לטפל בכל השפופרות הריקות ב-10% bleach לפני השלכתן. אם בכוונתכם להשתמש בתכשיר הנגיפי למשך יותר משבוע, הוא יישמר במקרר.הכינו אליקוטות מינימליות של 5 עד 20 µL עבור ניסויים עתידיים ואליקוטה אחת של 3 עד 5 µL עבור קביעת הטיטר (titration), הקפיאו ואחסנו את האליקוטות בטמפרטורה של כ-80- °C. השלב הבא הוא קביעת הטיטר הוויראלי. אם כללתם גן רפורטר פלואורסצנטי בפלסמיד הלנטי-וויראלי, התאים המודבקים יפגינו פלואורסצנציה וניתן יהיה לקבוע את הטיטר הוויראלי באמצעות ציטומטריית זרימה.בתחילה, דללו שלושה µL של נגיף רכז לתוך 1.5 mL של מצע מלא בבארות אחת עד שש, בשורה אחת של פלטת 96 בארות. בצעו את הדילולות הסדרתיות הבאות לכל שש הבארות ב-100 µL של DM מלא. לבאר הראשונה הוסיפו 100 µL של מצע ללא נגיף.זוהי ביקרת האי-צביעה שלך. לבאר השנייה נוסיף 100 µL מהנגיף המדולל. לבאר השלישית נוסיף 100 µL מהתערובת של הבאר השנייה אל הבאר הרביעית.נוסיף 100 µL מהבאר השלישית לבאר החמישית. נוסיף 100 µL מהבאר הרביעית לבאר השישית. נוסיף 100 µL מהבאר החמישית.לבסוף, הוציאו 100 µL מהבאר השישית והשליכו אותם למיכל עם אקונומיקה. השלימו את הנפח הכולל בכל הבארים ל-200 µL באמצעות DMEM. בכל דילול, ריכוז הנגיף פוחת בחצי. שימו לב כי אלו הם דילולים מוצעים בלבד, שאמורים להתאים לטיטרציה של רוב הנגיפים בריכוז גבוה.אם התרכזות הנגיף (titer) נמוכה או אם הנגיף אינו מרוכז, ייתכן שיהיה עליך להתאים את הדילול. יש לטפל בכל נגיף מדולל שלא נעשה בו שימוש ב-10% bleach למשך 45 דקות לפני השליכה למכל פסולת ביולוגית מסוכנת. הוסף כ-15,000 תאי 2 9 3 T בריאים המתחלקים באופן פעיל לכל אחת משש הבארות.ניתן להשתמש בפלטה אחת של 96 בארות כדי לתתר 16 דגימות נגיפיות, להשלים את נפח הבארות ל-200 microliters, להחזיר את התאים לאינקובטור ולאפשר לזיהום להימשך לפחות 48 שעות. לאחר האינקובציה, נתחו את פלואורסצנציית התאים באמצעות ציטומטר זרימה. ניתן להשתמש באחוז התאים הפלואורסצנטיים לכל באר כדי לקבוע את התיתר או את מספר החלקיקים הנגיפיים המדבקים למיליליטר של נגיף שהוסף.חשב את מספר היחידות הזיהומיות למילליליטר באמצעות הנוסחה הבאה בעת פירוש תוצאות ה-flow cytometer. שים לב שניתן להשיג חישובים מדויקים של הטיטר רק כאשר תאים מזוהמים קיבלו לא יותר מאינטגרציה ויראלית אחת לתא.כדי להבטיח שזהו אכן המצב, השתמשו בחישובים בתאים עם שיעור הדבקה של פחות מ-15%. תאים עם שיעורי הדבקה גבוהים יותר קיבלו ככל הנראה מספר רב של אינטגרציות ויראליות לתא. הדילול המוצע בשלב השני אמור להניב מספר דגימות בטווח הדבקה זה.מומלץ להשתמש במספר דגימות כדי ליצור גרף טיטרציה שממנו ניתן לחשב את הטיטר הסופי. ניתן להשתמש בנוסחה המחושבת מהקו הליניארי המותאם כדי לחשב את הטיטר הוויראלי, אך ניתן לחשב את הטיטר באמצעות דגימה אחת במידת הצורך. ניתן לצפות לטיטר של 1x10⁷ יחידות התהייה (transducing units) למילליליטר עבור נגיף שאינו מרוכז, ו-1x10⁸ יחידות התהייה למילליליטר עבור נגיף מרוכז.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לייצר לנטי-וירוסים במהלך ביצוע פרוצדורה זו. חשוב להקפיד על כל תקנות הבטיחות הביולוגית ולפנות את הפסולת כראוי. זהו כל התהליך.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים...

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המציעים בסיס גמיש ואסטרטגי למניפולציה ויראלית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים על מנת לחקור באופן ספציפי את תפקידם באוליגודנדרוציטים באמצעות מודל מבחנה של מיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

אנו מתארים את האסטרטגיה הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) בתור כלי רכב להעברת CRISPR/Cas9 לתאים. עם היכולת לתווך ג'ין מהיר וחזק עריכה בתאים, IDLVs להציג דרך בטוחה יותר, פלטפורמה וקטור יעיל באותה מידה המסירה הגן לעומת integrase-המוסמכת וקטורים.

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

כאן, אנו מתארים שיטה לוויזואליזציה מבוססת תאים, לוקאליזציה תת-תאית וניתוח כמותי של מוקדים מועשרים בפולי(ADP-ריבוז) (PAR) בתאי יונקים קבועים. מבחן זה מאפשר לכימות אתרים של הפעלת PARP הנגרמת מנזק DNA, כולל זה הקשור לתיקון כריתת בסיס או תיקון שבירה חד-גדילית, בגרעינים של תאים שנחשפו לגנוטוקסין.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי

למדו להפיק לנטיווירוסים באמצעות תאי 293T אנושיים לצורך העברת גנים וטיפול גני. השיטה כוללת טרנספקציה, ריכוז באולטרצנטריפוגה וקביעת כמות נגיפים באמצעות ביטוי פלואורסצנטי.

Lentivirus הפקה

גלה סרטונים נוספים