Name: מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למדו הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים לצורך קריוטיפינג. שיטה זו מאפשרת לזהות שינויים גנטיים בתרביות תאים ולהבטיח את היושרה הגנטית הדרושה למחקר ולטיפולים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ציוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תרבות חממה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט של micropipettors (100, 100μL) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה 37 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבט המים 90 מעלות צלזיוס להיות מקור של מים קיטור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניגוד שלב מיקרוסקופ </li></ul> צעד ראשון טיפול בתאי עם colcemid בהליך זה השתמשנו קו hESC H9 תרבותי על fibroblasts העכבר עובריים (MEF) מומת עם mitomycin C (Sigma) ומתוחזק DMEM/F12 (Invitrogen) בתוספת החלפת בנוקאאוט 20% נסיוב (KSR, Gibco) ו 8ng/mL של גורם גדילה פיברובלסטים (FGF-2, R &amp; D). כדי לקבל מספר גדול של ממרחים metaphases, מומלץ להשתמש תרבויות עם מדד גבוה mitotic שבו יש חלוקת תאים רבים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הבקבוק תרבות מן החממה, בזרימה למינרית, להוסיף Colcemid בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את הבקבוק אל האינקובטור ולחכות 3 שעות כל כך מעכב יכולה לגרום למעצר mitotic על metaphase, כאשר כרומוזומים מרוכזים היטב ניתן דמיינו בקלות מתחת למיקרוסקופ. </li></ol> תיקון התאים <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את המדיום ולהוסיף tripsin / EDTA 0.05% מספיק כדי לכסות את פני השטח לתאים. אפשר תאים כדי לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להשבית את האנזים או על ידי הוספת בינוני תרבות המכילה סרום או פשוט על ידי הוספת נסיוב לתאים. הערה: חשוב לוודא כי השעיה תא בודד מושגת להשיג מתפשט metaphase טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל ו - 122 גרם ב צנטריפוגות במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, והשאיר על 200 מ&quot;ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על הצינור, כפי שמוצג בסרטון. ודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא תצטרך להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת hypotonic (KCl 75mm) מראש לחמם 37 ° C, לאט, על ידי הקיר צינור כמו בתיאור הבא. ראשית להוסיף 3 מ&quot;ל, להפוך לצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים עם פתרון hypotonic מכן להוסיף את שאר מ&quot;ל 2 ו להתחמם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הערה: בשלב זה הפתרון hypotonic יגרום לעלייה בנפח הסלולר לעזור לפענח את הכרומוזומים. זמן הדגירה חשוב לרכוש מתפשט כרומוזום טוב. אם העיתוי הוא ארוך מדי, קרום התא עשוי לפרוץ מוקדם מדי כרומוזומים יאבדו. אם קצר מדי, זה יכול להיות קשה להשיג מתפשט כרומוזום כי קרום התא לא יכול לשבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 טיפות של הפתרון מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), להפוך את הצינור בעדינות כדי לערבב את הפתרון מקבע עם תאים צנטריפוגות ב 122 גר &#39;במשך 5 דקות ללא הפסקה. הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה. הערה: חשוב להשתמש צנטריפוגה ללא הפסקה, כדי למנוע שחיקה התאים, מניעת אובדן של החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, והשאיר על 200 מ&quot;ל, ו resuspend את הכדור בעדינות על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור. הערה: שוב, לוודא התאים ניתק היטב, כך שאתה לא יכול לדמיין את כל הגושים בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הראשון 3 מ&quot;ל של תמיסת מקבע, לאט ליד הקיר צינור, תוך כדי לסובב את הצינור. הפוך את הצינור למצב אופקי פשוט לערבב את התאים, ולאחר מכן להוסיף עוד 2 מ&quot;ל של הפתרון מקבע ליד הקיר צינור לקחת את התאים מטה. במלאי ב 4 ° C למשך הלילה. הערה: תאים קבוע ניתן לאחסן פתרון מקבע במשך חודשים 4 ° C. מלבד הגנה על תאים במצב נפוח שלהם, הפתרון מקבע מסיר שומנים וחלבונים denatures. אירועים אלה להפוך את קרום התא שברירי, וכתוצאה מכך, להפוך את כרומוזום מתפשטת בקלות. </li></ol> ניקוי שקופיות הזכוכית לפני תחילת ביצוע מתפשט כרומוזום שלך לוודא כי השקופיות מנקים כמו שצריך אחרת אתם עלולים לאבד כמה גרעינים וגם metaphases. שלב זה הוא חשוב גם אם אתה רוצה לנסות כל טכניקה הכלאה 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות כוס המכילה HCl 6M לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופה זו, לשטוף במים זורמים שקופיות ברז למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות במים מזוקקים ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו השקופיות ניתן לאחסן לתוך אתנול 96% מיובשים עם ונטולת מוך מיד לפני השימוש. </li></ol> הערה: לקבלת בשיטות הכלאה באתרו, השקופיות לא ניתן לאחסן יותר מ 2 ימים לתוך אתנול 96% שלב השני כביסה התאים <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, צנטריפוגה התאים ב 122 גר &#39;במשך 5 דקות ללא הפסקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Discard supernatant עוזב על 200 מ&quot;ל. Resuspend גלולה מצליף בעדינות על ידי צינור ולאחר מכן להוסיף 5 מ&quot;ל של תמיסת טרי מקבע (מתנול / חומצה אצטית קרחונית 03:01), לאט ליד הקיר צינור תוך סיבוב הצינור. חזור על שלב 2 לשטוף יותר פעמים עבור סכום כולל של שלושה שוטף. הערה: הפתרון צריך להיעשות מקבע עתה. </li></ol> הכנת שקופיות <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעד צנטריפוגה האחרון לעזוב כמות מספקת של פתרון homogenize התא גלולה ולקבל צפיפות מספקת של תאים השקופיות (ראה תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20-30 μL ההשעיה תא לשקופית יבש ונקי על ידי העברת פיפטה קרוב מאוד ובמקביל פני השטח. כמו מתאדה פתרון מקבע, את פני השטח של שקופיות הופך מגורען. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לחשוף את השקופית, עם הפנים כלפי מעלה, לתוך האדים של מים חמים (90 מעלות) למשך 30 שניות כדי לגרום לתאים לפוצץ. הערה: ברגע זה, מתנול מ מתאדה פתרון מקבע, וכתוצאה מכך גדל ריכוז חומצה אצטית, אשר יחד עם המים מגרה את כרומוזום מתפשטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראו מיקרוסקופ לעומת השלב רק כדי לבדוק אם הריכוז כמו גם את חלוקת התא הוא טוב (ראו תרשים 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו השקופיות מוכנים לשמש כדי לבדוק את ערכה של כרומוזומים על ידי גישות cytogenetics כמו ה-G-banding (Giemsa) SKY, דגים, או CGH. </li></ol> חשוב רמזים איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח בחירת metaphases עגולים מבודדים (דמות 2D), אתה עשוי להימנע בהתחשב aneuploidies כוזבת רווח של כרומוזומים שנוצר על ידי שניים או יותר מרווחי מעורבבים יחד או אובדן של כרומוזומים שנוצר על ידי כרומוזום השיק. אז, להימנע מבחירת metaphases ליד גרעינים כי כמה כרומוזומים עשוי להיות מוסתר על ידי אותם (דמות 2 א ו -2). חוץ מזה, לחפש metaphases עגול להיות בטוח כי כל כרומוזום מופרד מן metaphase (דמות 2C). מזין תאים קריוטיפ hESC עבור ה-G-banding וניתוח SKY, נוכחות של תאים מזין בתרבות hESC לא להפריע התוצאות, כי התאים מזין אינם תחת מדינה חלוקת (מומת על ידי mitomycin C או הקרנה) ולא יהיה חלק מהאוכלוסייה metaphase. עם זאת, עבור היישום של טכניקה דגים גרעינים שלבי הביניים, הוא העדיף להפריד את האוכלוסייה hESC מתאי מזין ידי קצירת המושבות ידנית לפני trypsinization לניתוח FISH. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig1tmb.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: איך לדעת את צפיפות התאים המתאימים השקופיות. תמונות של המיקרוסקופ שלב הניגוד אובייקטיבי 10x. (א) צפיפות התאים גבוהה מדי. החיצים מצביעים על metaphase מתפשטת קרוב מדי של גרעינים. (ב) שקופית עם צפיפות התאים טוב. חוגים מראים metaphases מתפשט מבודד גרעינים או metaphases אחרים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1512/1512fig2tmb.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: איך לבחור metaphase נאותה כדי להיות מנותח. הכרומוזומים הם מוכתמים DAPI ותמונות מתקבל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב אובייקטיבית 100x. (א) (ב) להימנע metaphases ליד גרעינים (מסומנת בחצים) (C) metaphases לא עגול כי הכרומוזומים מופרדים נוכח (עיגול). (ד) metaphase עגול הוא metaphase טוב כדי להיות מנותח. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1512/1512fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).</li>
<li>Draper, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+gain+of+chromosomes+17q+and+12+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).</li>
<li>Maitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+alterations+in+cultured+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).</li>
<li>Mitalipova, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+the+genetic+integrity+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).</li>
<li>Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype+of+human+ES+cells+during+extended+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Karyotype of human ES cells during extended culture.</a> Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).</li>
<li>Caisander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+integrity+maintained+in+five+human+embryonic+stem+cell+lines+after+prolonged+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture.</a> Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).</li>
<li>Imreh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+conditions+favoring+selection+of+chromosomal+abnormalities+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells.</a> J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).</li>
<li>Robin-Wesselschmidt, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobin-Wesselschmidt%2C+JL+%22Human+Stem+Cell+Manual%22">Human Stem Cell Manual</a>. Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. chwartz , Elsevier's Science & Technology Rights. California. 59-59 (2007).</li>
<li>Rooney, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRooney%2C+DE+%22Human+Cytogenetics%22">Human Cytogenetics</a>. , Third Edition, Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeslop-Harrison%2C+P+%22Practical+in+situ+hybridization%22">Practical in situ hybridization</a>. Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. , BIOS Scientific Publishers. Oxford. 51-51 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

הכנת ממרחים כרומוזום הוא שלב קריטי לניתוח מוצלח של מצב גנטי של תאים עובריים באופן שגרתי על ידי טכניקות כמו ה-G-banding, טכניקות מתוחכמות יותר כגון דגים, SKY ו - CGH. הליך זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים רבים על ידי שינוי תקופת הדגירה colcemid, אשר תלוי באורך מחזור התא. עבור מושבות של תאים עובריים, נחכה 3 שעות ואילו גופים embryoid (EB) זמן זה יכול להיות עד 6 שעות. <p class="jove_content" style=";text-align:ri...

<table><tbody><tr><td>מבחנה לצנטריפוגה 15 ml</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid Karyo MAX</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Isofar</td><td>721</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית גלציאלית</td><td>Isofar</td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Isofar</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>אשלגני כלוריד (KCl)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>104.931.000</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית למשחה</td><td>Bioslide</td><td>7105-1</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור karyotyping

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

למרות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הוכחו מציגים קריוטיפ דיפלואידי יציב 1, מחקרים רבים דיווחו כי בהתאם לתנאי התרבות הם הופכים נוטה לרכוש מומים כרומוזומליים כגון תוספת של שלם או חלקי כרומוזומים. ואכן, במהלך לתרבות לטווח ארוך, שינויים karyotypic הם נצפו כאשר אנזימטית או כימי דיסוציאציה משמשים 2,3,4, בעוד דיסקציה ידנית של המושבות עבור passaging שומרת קריוטיפ יציב 5. חוץ מזה, שינויים בסביבה, כגון הסרת תאים מזין גם נראה להתפשר על שלמות הגנטי של hESC 3,6. לאחר שינויים כרומוזומליים יכולים להשפיע על הפיזיולוגיה הסלולר, אפיון של שלמות הגנטי של hESC במבחנה הוא hESC בהתחשב מכריע ככלי חיוני במחקרים embryogenesis בדיקות סמים. יתר על כן, למטרות טיפוליות עתידיות שינויים כרומוזומליים הם חשש ממשי כפי שהוא מזוהה לעתים קרובות סרטן. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ושימושית להשיג איכות גבוהה כרומוזום מתפשט עבור ניתוח בדיעבד של כרומוזום שנקבעו על ידי G-banding SKY, דגים או טכניקות CGH 7,8. אנו ממליצים לבדוק את מצב הכרומוזומים באופן שגרתי במרווחים של 5 קטעים על מנת לפקח על המראה של טרנסלוקציות ו aneuploidies Priscila Britto ו Rafaela Sartore תרמו באופן שווה על הנייר.

Karyotyping היא טכניקה פשוטה ושימושית בשימוש נרחב לאיתור שינויים גנטיים. כאן אנו מתארים צעד אחר צעד להכנת פרוטוקול כרומוזום התפשטות בתאי גזע עובריים אנושיים לניטור מצב הכרומוזומים של תאים אלה נשמר בתרבות.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

אף על פי שהוכח שתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מציגים קריוטיפ דיפלואידי יציב 1, מחקרים רבים דיווחו כי בהתאם לתנאי התרבית...

הקדמה. שלום. אנחנו מהמכון למדעי הביומטריה באוניברסיטה הפדרלית של Faja בברזיל. בסרטון זה נכין פריסות כרומוזומים של תאי גזע עובריים אנושיים כדי לזהות שינויים כרומוזומליים אפשריים. למרות שהוכח כי תאי גזע עובריים אנושיים מראים קריוטיפ פרוס ויציב, מחקרים הראו כי בהתאם לתנאי התרבית, הם נוטים לרכוש anomalias כרומוזומליות כגון הוספה של כרומוזומים שלמים או חלקים מהם.אפיון השלמות הגנטית של HASS in vitro הוא קריטי, בהתחשב בחשיבותו למחקרי embryogenesis ובבדיקת תרופות. יתרה מכך, עבור הצעות טיפוליות עתידיות, שינויים כרומוזומליים מהווים מקור לדאגה ממשית, שכן הם קשורים לעיתים קרובות לקרצינוגנזה. אם כן, בואו נתחיל.טיפול בתאים ב-ate בהליך זה, אנו משתמשים בו. התאים גודלו ב-F 12 מועשר ב-20% תחליף סרום ללא עגלים ו-80 to nine גרם למילליליטר של גורם גדילה של פיברובלסטים. התחל בהוצאת בקבוק התרבית מהאינקובטור ותחת מנדף זרימה למינרית, הוסף coit לריכוז סופי של 0.1 microgram per milliliter.הוספת Coit למצע גורמת להשראת mitoka, מנוחה ומטפאזה. כאשר הכרומוזומים מעובים היטב וניתן להדמייתם בקלות רבה יותר תחת המיקרוסקופ, הקפידו להשתמש בטכניקות סטריליות כדי למנוע זיהום. לאחר הוספת ה-coit, סגרו את הבקבוק והחזירו את התאים לאינקובטור.קיבוע התאים לאחר תקופת הדגירה; התאים אינם מוכנים לקיבוע בשלב זה. אין צורך לעבוד בתנאים סטריליים. התחילו בשאיבת המצע, ולאחר מכן הוסיפו טריפסין.הוסיפו 0.05% DTA לבקבוק. ודאו שאתם מוסיפים מספיק tryin כדי לכסות את שטח הפנים התחתון של התאים. סגרו את הבקבוק ונערו בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד.השאירו את התאים לדגירה עם ה-trypsin למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר, התאים לא אמורים להיות צמודים יותר לדופן התחתונה של הבקבוק, ויש לנטרל את ה-trypsin על ידי הוספת מדיום גידול המכיל סרום או על ידי הוספה עדינה של סרום לתאים. הסירו בזהירות את פקק הבקבוק והוסיפו את מדיום הגידול או את הסרום, ואפשרו לנוזל לרדת לדופן התחתונה של הבקבוק על התאים.בצעו פיפטינג (שאיבה והזרקה) של תגלי התאים מספר פעמים כדי להפריד את התאים לחלוטין. העבירו את התאים לתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר, אך לפני כן, ודאו שהתאים הופרדו היטב וכי התגלי אינו מכיל גושי תאים נראים לעין. עם סיום ההעברה, סגרו את המבחנה במכסה וסובבו בצנטריפוגה.ערבבו את התרחיף בקיפולים למשך חמש דקות. לאחר סבוב של 800 RPM בצנטריפוגה, אמור להיווצר משקע תאים בתחתית המבחנה. היזהרו לא להפריע למשקע התאים.שאפו את הנוזל באמצעות P 1000 עד שנותרו כ-200 microliters. זהו נפח מתווך ל-Resus. השעו את המשקע ב-Resus.שעלה את תרחיף החיך. נקש בעדינות על המבחנה באמצעות האצבעות מספר פעמים. ודא שהתאים שועלו היטב על ידי בדיקה שאין גושי תאים שנותרו בתמיסה.בשלב זה, התמיסה צריכה להיות עכורה. לאחר מכן, יש להוסיף חמישה מיליליטרים של תמיסות KCl בריכוז 75 millimolar שחוממה מראש ל-37 °C. יש להוסיף את התמיסה ההיפוטונית באיטיות רבה דרך הפיה למספרה תוך כדי סיבוב המבחנה.לאחר הוספת שלושת המיליליטרים הראשונים, סגרו את פיית המבחנה בחוזקה ובזהירות. הומוגניזרו את תרחיף התאים עם תמיסה היפוטונית על ידי סיבוב עדין של המבחנה בצורה אופקית ובסבוב איטי.המשיכו להוסיף לאט את שני המיליליטרים הנותרים באותו אופן כפי שנעשה קודם לכן. מטרת התמיסה ההיפוטונית היא להגדיל את נפח התא כדי לאפשר לכרומוזומים להיפתח. לכן, תקופת דגירה זו קריטית להשגת פריסות כרומוזומים איכותיות. לאחר הוספת כל חמשת המיליליטרים, סגרו את השפופרת במכסה ודגרו את התאים במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.עם השלמת תקופת האינקובציה של 15 דקות, הוציאו את המבחנה מהמקובית. בשלב זה, ניתן לעבוד בתוך מapay תחת מנדף, שכן האדים הנוצרים מהתמיסה המקבעת הם רעילים. אם אין לכם גישה למנדף, הקפידו לעבוד באזור מאוורר היטב.הסיר את מכסה המבחנה והוסף שלוש טיפות מהתמיס המקבע. זהו תמיס של מתנול וחומצה אצטית ביחס של שלוש לאחת, ויש להכינו ביום השימוש. סגור את מכסה המבחנה היטב והטה את המבחנה בעדינות באופן אופקי תוך כדי סיבוב איטי, תחילה עם כיוון השעון ולאחר מכן נגד כיוון השעון.סובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 800 RPM ללא הפסקה. חשוב מאוד שהסבוב יעצור לאט כדי למנוע אובדן חומר הנגרם משחיקת תאים לאחר הצנטריפוגה. תסביך לב זה חי בערך ב-200.כדי להשעות את המשקע, דפקו בעדינות על השפופרת עם האצבעות מספר פעמים. ודאו שהתאים הושעו היטב על ידי בדיקה שאין גושי תאים שנותרו. הוסיפו לאט 3 mL של תמיסת קיבוע דרך דופן השפופרת תוך כדי סיבוב השפופרת לאחר הוספת שלושת המיליליטרים הראשונים.סגור את המבחנה T היטב והומוגניז בזהירות את תרחיף התאים על ידי סיבוב עדין של המבחנה בצורה אופקית ובסיבוב איטי שלה. ודא שביצעת לפחות סיבוב מלא אחד. כדי למקסם את תהליך הערבוב, הוסף עוד.הוסף שני מיליליטר של תמיסת הקיבוע לצד הדופן של הכלי כדי להשקיע את התאים. אחסן את תרחיף התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. תאים מקובעים אלו ניתנים לאחסון בתמיסת קיבוע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חודשים.שטיפת התאים למחרת תתבצע על ידי צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות במהירות של 800 RP ללא הפסקה. יש להשליך את הנוזל שמעל ולהשאיר כ-200 µL. יש לסבסב את המשקע על ידי נקישה של המבחנה עם האצבעות מספר פעמים.ודאו שהתאים התחברו היטב ושתמיסת התליה אינה מכילה גושי תאים נראים לעין. הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת קיבוע טרייה באיטיות דרך דופן המבחנה. סגרו את המבחנה והומוגניזו את התאים על ידי סיבוב עדין של המבחנה בצורה אופקית תוך כדי סיבובה באיטיות.מלבד הגנה על התאים, תמיסת הקיבוע מסירה ליפידים ולאחר מכן חלבונים, וכתוצאה מכך, מאפשרת פריסה קלה של הכרומוזומים. סבבו את המבחנה בצנטריפוגה במשך חמש דקות במהירות של 800 RRP M ללא הפסקה. הכנת השקופיות: בשלב הסנטריפוגציה, השאירו כמות מספקת של תמיסה כדי להומוגנז את משקע התאים.כמות נוזל זו עשויה להשתנות בהתאם למספר התאים. נקשו קלות על השפופרת בעזרת האצבעות מספר פעמים. ודאו שהתאים התערבבו היטב על ידי בדיקה שאין גושי תאים הנראים לעין.בשלב זה, יש להוסיף 20 עד 30 µL של תרחיף תאים על גשרי זכוכית נקי ויבש, על ידי הזזת הפפיטה במקביל לפני השטח. עם התאיידות תמיסת הקיבוע, פני השטח הופכים מיד למראה גרגירי. חשוף את פני השטח כלפי מעלה לזרם של מים חמים למשך 30 שניות כדי לגרום לתאים להתנפח.ניתוח התאים. לאחר הכנת הנסליות, יש לבחון אותן תחת מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast) באמצעות העדשות 10X והעדשה הגבוהה כדי לבדוק אם צפיפות התאים מתאימה לניתוח המשך. נסלית זו היא דוגמה לריכוז גבוה מדי.שימו לב כי גרעיני התאים קרובים מדי לפריסות המטפאזה. אם יש לכם סלייד שבו צפיפות התאים גבוהה מדי, יש לדלל את תרחיף התאים על ידי הוספת תמיסת קיבוע נוספת. סלייד זה מציג את צפיפות התאים הרצויה.שימו לב כי פריסות המטפאזה מפוזרות היטב ומבודדות. ברגע שהתמיס שקופית עם צפיפות תאים אופטימלית, ניתן לצבוע אותה ולנתח אותה. הימנעו מבחירה של מטפאזות הנמצאות סמוך לגרעין, שכן כרומוזומים עשויים להיות חבויים או חסומים מהראייה.חפשו מטאפאזות בעלות צורה עגולה, אך ודאו ששום כרומוזום לא התרחק מהמטאפאזה; בחרו מטאפאזות עגולות ומבודדות היטב. כפי שמוצג בשקופית הבאה, נסו להימנע מדיווח על IES שגוי, כגון תוספת של כרומוזומים הנובעת משני פריסות סמוכות שנתערבבו יחד, או אובדן של כרומוזומים הנובע מכרומוזומים ישרים.אנו מקווים שסרטון זה יסייע לכם בניסוייכם הבאים. אם יש לכם כל שאלה, אל תהססו ליצור איתנו קשר. נהנו ובהצלחה.

chromosomal-spread-preparation-human-embryonic-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Karyotyping ספקטרלי (שמים) היא טכניקה מתקדמת cytogenetics לזהות סטיות כרומוזומליות גנומית. שיטה זו מנצלת את בדיקות ציור כרומוזום, המאפשרים סיווג של כרומוזומים כל. SKY יכול גם לזהות סטיות כרומוזום מורכבים ופגמים הפרדה בעכברים ובבני אדם עם מחלות שונות, לרבות מחלת כליות פוליציסטיות.

Karyotyping רפאים ללמוד חריגות כרומוזום בבני אדם ועכברים עם מחלת כליות פוליציסטיות

יכולים להיות מבודדים הכרומוזומים מתאי חיים כגון לימפוציטים או fibroblasts עור, ומאורגניזמים כולל בני אדם או עכברים. הכנות כרומוזום אלה יכולים להיות מנוצלים נוספים עבור ה-G-פסים שיגרתי ונהלים ציטוגנטית מולקולריים כגון הקרינה הכלאה באתרו (FISH), הכלאה השוואתית גנומית (CGH), וkaryotyping ספקטרלי (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נחוצים לניתוח חוסר יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה אינה קלה. הדו"ח הנוכחי מתאר הליכים פשוטים יחסית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים ללא אוכלוסייה דיפלואידית מפיברובלסטים אנושיים רגילים.

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

למדו הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים לצורך קריוטיפינג. שיטה זו מאפשרת לזהות שינויים גנטיים בתרביות תאים ולהבטיח את היושרה הגנטית הדרושה למחקר ולטיפולים עתידיים.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

גלה סרטונים נוספים