מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

הקדמה. שלום. אנחנו מהמכון למדעי הביומטריה באוניברסיטה הפדרלית של Faja בברזיל. בסרטון זה נכין פריסות כרומוזומים של תאי גזע עובריים אנושיים כדי לזהות שינויים כרומוזומליים אפשריים. למרות שהוכח כי תאי גזע עובריים אנושיים מראים קריוטיפ פרוס ויציב, מחקרים הראו כי בהתאם לתנאי התרבית, הם נוטים לרכוש anomalias כרומוזומליות כגון הוספה של כרומוזומים שלמים או חלקים מהם.

אפיון השלמות הגנטית של HASS in vitro הוא קריטי, בהתחשב בחשיבותו למחקרי embryogenesis ובבדיקת תרופות. יתרה מכך, עבור הצעות טיפוליות עתידיות, שינויים כרומוזומליים מהווים מקור לדאגה ממשית, שכן הם קשורים לעיתים קרובות לקרצינוגנזה. אם כן, בואו נתחיל.

טיפול בתאים ב-ate בהליך זה, אנו משתמשים בו. התאים גודלו ב-F 12 מועשר ב-20% תחליף סרום ללא עגלים ו-80 to nine גרם למילליליטר של גורם גדילה של פיברובלסטים. התחל בהוצאת בקבוק התרבית מהאינקובטור ותחת מנדף זרימה למינרית, הוסף coit לריכוז סופי של 0.1 microgram per milliliter.

הוספת Coit למצע גורמת להשראת mitoka, מנוחה ומטפאזה. כאשר הכרומוזומים מעובים היטב וניתן להדמייתם בקלות רבה יותר תחת המיקרוסקופ, הקפידו להשתמש בטכניקות סטריליות כדי למנוע זיהום. לאחר הוספת ה-coit, סגרו את הבקבוק והחזירו את התאים לאינקובטור.

קיבוע התאים לאחר תקופת הדגירה; התאים אינם מוכנים לקיבוע בשלב זה. אין צורך לעבוד בתנאים סטריליים. התחילו בשאיבת המצע, ולאחר מכן הוסיפו טריפסין.

הוסיפו 0.05% DTA לבקבוק. ודאו שאתם מוסיפים מספיק tryin כדי לכסות את שטח הפנים התחתון של התאים. סגרו את הבקבוק ונערו בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד.

השאירו את התאים לדגירה עם ה-trypsin למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר, התאים לא אמורים להיות צמודים יותר לדופן התחתונה של הבקבוק, ויש לנטרל את ה-trypsin על ידי הוספת מדיום גידול המכיל סרום או על ידי הוספה עדינה של סרום לתאים. הסירו בזהירות את פקק הבקבוק והוסיפו את מדיום הגידול או את הסרום, ואפשרו לנוזל לרדת לדופן התחתונה של הבקבוק על התאים.

בצעו פיפטינג (שאיבה והזרקה) של תגלי התאים מספר פעמים כדי להפריד את התאים לחלוטין. העבירו את התאים לתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר, אך לפני כן, ודאו שהתאים הופרדו היטב וכי התגלי אינו מכיל גושי תאים נראים לעין. עם סיום ההעברה, סגרו את המבחנה במכסה וסובבו בצנטריפוגה.

ערבבו את התרחיף בקיפולים למשך חמש דקות. לאחר סבוב של 800 RPM בצנטריפוגה, אמור להיווצר משקע תאים בתחתית המבחנה. היזהרו לא להפריע למשקע התאים.

שאפו את הנוזל באמצעות P 1000 עד שנותרו כ-200 microliters. זהו נפח מתווך ל-Resus. השעו את המשקע ב-Resus.

שעלה את תרחיף החיך. נקש בעדינות על המבחנה באמצעות האצבעות מספר פעמים. ודא שהתאים שועלו היטב על ידי בדיקה שאין גושי תאים שנותרו בתמיסה.

בשלב זה, התמיסה צריכה להיות עכורה. לאחר מכן, יש להוסיף חמישה מיליליטרים של תמיסות KCl בריכוז 75 millimolar שחוממה מראש ל-37 °C. יש להוסיף את התמיסה ההיפוטונית באיטיות רבה דרך הפיה למספרה תוך כדי סיבוב המבחנה.

לאחר הוספת שלושת המיליליטרים הראשונים, סגרו את פיית המבחנה בחוזקה ובזהירות. הומוגניזרו את תרחיף התאים עם תמיסה היפוטונית על ידי סיבוב עדין של המבחנה בצורה אופקית ובסבוב איטי.

המשיכו להוסיף לאט את שני המיליליטרים הנותרים באותו אופן כפי שנעשה קודם לכן. מטרת התמיסה ההיפוטונית היא להגדיל את נפח התא כדי לאפשר לכרומוזומים להיפתח. לכן, תקופת דגירה זו קריטית להשגת פריסות כרומוזומים איכותיות. לאחר הוספת כל חמשת המיליליטרים, סגרו את השפופרת במכסה ודגרו את התאים במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.

עם השלמת תקופת האינקובציה של 15 דקות, הוציאו את המבחנה מהמקובית. בשלב זה, ניתן לעבוד בתוך מapay תחת מנדף, שכן האדים הנוצרים מהתמיסה המקבעת הם רעילים. אם אין לכם גישה למנדף, הקפידו לעבוד באזור מאוורר היטב.

הסיר את מכסה המבחנה והוסף שלוש טיפות מהתמיס המקבע. זהו תמיס של מתנול וחומצה אצטית ביחס של שלוש לאחת, ויש להכינו ביום השימוש. סגור את מכסה המבחנה היטב והטה את המבחנה בעדינות באופן אופקי תוך כדי סיבוב איטי, תחילה עם כיוון השעון ולאחר מכן נגד כיוון השעון.

סובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות במהירות של 800 RPM ללא הפסקה. חשוב מאוד שהסבוב יעצור לאט כדי למנוע אובדן חומר הנגרם משחיקת תאים לאחר הצנטריפוגה. תסביך לב זה חי בערך ב-200.

כדי להשעות את המשקע, דפקו בעדינות על השפופרת עם האצבעות מספר פעמים. ודאו שהתאים הושעו היטב על ידי בדיקה שאין גושי תאים שנותרו. הוסיפו לאט 3 mL של תמיסת קיבוע דרך דופן השפופרת תוך כדי סיבוב השפופרת לאחר הוספת שלושת המיליליטרים הראשונים.

סגור את המבחנה T היטב והומוגניז בזהירות את תרחיף התאים על ידי סיבוב עדין של המבחנה בצורה אופקית ובסיבוב איטי שלה. ודא שביצעת לפחות סיבוב מלא אחד. כדי למקסם את תהליך הערבוב, הוסף עוד.

הוסף שני מיליליטר של תמיסת הקיבוע לצד הדופן של הכלי כדי להשקיע את התאים. אחסן את תרחיף התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. תאים מקובעים אלו ניתנים לאחסון בתמיסת קיבוע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חודשים.

שטיפת התאים למחרת תתבצע על ידי צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות במהירות של 800 RP ללא הפסקה. יש להשליך את הנוזל שמעל ולהשאיר כ-200 µL. יש לסבסב את המשקע על ידי נקישה של המבחנה עם האצבעות מספר פעמים.

ודאו שהתאים התחברו היטב ושתמיסת התליה אינה מכילה גושי תאים נראים לעין. הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת קיבוע טרייה באיטיות דרך דופן המבחנה. סגרו את המבחנה והומוגניזו את התאים על ידי סיבוב עדין של המבחנה בצורה אופקית תוך כדי סיבובה באיטיות.

מלבד הגנה על התאים, תמיסת הקיבוע מסירה ליפידים ולאחר מכן חלבונים, וכתוצאה מכך, מאפשרת פריסה קלה של הכרומוזומים. סבבו את המבחנה בצנטריפוגה במשך חמש דקות במהירות של 800 RRP M ללא הפסקה. הכנת השקופיות: בשלב הסנטריפוגציה, השאירו כמות מספקת של תמיסה כדי להומוגנז את משקע התאים.

כמות נוזל זו עשויה להשתנות בהתאם למספר התאים. נקשו קלות על השפופרת בעזרת האצבעות מספר פעמים. ודאו שהתאים התערבבו היטב על ידי בדיקה שאין גושי תאים הנראים לעין.

בשלב זה, יש להוסיף 20 עד 30 µL של תרחיף תאים על גשרי זכוכית נקי ויבש, על ידי הזזת הפפיטה במקביל לפני השטח. עם התאיידות תמיסת הקיבוע, פני השטח הופכים מיד למראה גרגירי. חשוף את פני השטח כלפי מעלה לזרם של מים חמים למשך 30 שניות כדי לגרום לתאים להתנפח.

ניתוח התאים. לאחר הכנת הנסליות, יש לבחון אותן תחת מיקרוסקופ בניגוד מופע (phase contrast) באמצעות העדשות 10X והעדשה הגבוהה כדי לבדוק אם צפיפות התאים מתאימה לניתוח המשך. נסלית זו היא דוגמה לריכוז גבוה מדי.

שימו לב כי גרעיני התאים קרובים מדי לפריסות המטפאזה. אם יש לכם סלייד שבו צפיפות התאים גבוהה מדי, יש לדלל את תרחיף התאים על ידי הוספת תמיסת קיבוע נוספת. סלייד זה מציג את צפיפות התאים הרצויה.

שימו לב כי פריסות המטפאזה מפוזרות היטב ומבודדות. ברגע שהתמיס שקופית עם צפיפות תאים אופטימלית, ניתן לצבוע אותה ולנתח אותה. הימנעו מבחירה של מטפאזות הנמצאות סמוך לגרעין, שכן כרומוזומים עשויים להיות חבויים או חסומים מהראייה.

חפשו מטאפאזות בעלות צורה עגולה, אך ודאו ששום כרומוזום לא התרחק מהמטאפאזה; בחרו מטאפאזות עגולות ומבודדות היטב. כפי שמוצג בשקופית הבאה, נסו להימנע מדיווח על IES שגוי, כגון תוספת של כרומוזומים הנובעת משני פריסות סמוכות שנתערבבו יחד, או אובדן של כרומוזומים הנובע מכרומוזומים ישרים.

אנו מקווים שסרטון זה יסייע לכם בניסוייכם הבאים. אם יש לכם כל שאלה, אל תהססו ליצור איתנו קשר. נהנו ובהצלחה.