שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

פרוטוקול זה מתחיל בהוספת מאגר דגירה, תמיסת קזאין FXI ודגימה המכילה את הפרוטאז המעניין לצינור מיקרו צנטריפוגה, ולאחר מכן ערבוב עדין ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות בחושך. כדי לעצור את התגובה הפרוטאוליטית בסוף תקופת הדגירה, הוסיפו תמיסת TCA ערבבו בעדינות ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות שוב בחושך. שלב זה יגרום למצע הלא תגובתי לשקע.

צנטריפוגה את הדגימה למשך 10 דקות. ב-10,000 גרם, הסר את הסופרנטנט, המכיל את השברים המסומנים ב-FXI המסיסים בחומצה. העבירו את הסופרנטנט לווטרינר או לצלחת בארות מרובות מדללים עם מאגר בדיקה וקוראים את הדגימה על פלואורמטר.

היי, אני Carrie Cup Vineyard ואני מדען במתקן Sigma Aldridge DeKalb שלנו בסנט לואיס, מיזורי. היום אראה לך נוהל לקביעת פעילות פרוטאז פלואורומטרי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדת בקרת האיכות שלנו כדי לקבוע פעילות נמוכה של פרוטאז.

אז בואו נתחיל עבור הליך זה, מאגר הדגירה, מאגר הבדיקה ו-0.6 חומצה טריכלורואצטית רגילה או תמיסת TCA מסופקים כפתרונות מוכנים לשימוש. ציטטו את התמיסה של המסומן קין בנפחים קטנים יותר ואחסנו במינוס 20 מעלות צלזיוס. הקפידו להגן מפני אור על ידי שימוש בבקבוקוני ענבר או עטיפת צינורות שקופים בנייר כסף עלי.

ציטוט מצע קין ממזער את הצורך במחזורי הפשרה חוזרים ונשנים, מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים בהקפאה או ניעור נמרץ או ערבוב של הקין עלולים להוביל להפרדת הפיט מהקין, וכתוצאה מכך רקע גבוה יותר. אם מכייל את הפלואוריומטר או קובע את הטווח הליניארי עבור אות ההתאמה e, הכן את פתרון בקרת ההתאמה. הפוך את התמיסה לטרייה על ידי בנייה מחדש של מאגר הבדיקה לריכוז המתאים.

ברגע שמוכן, הגן על התמיסה מפני אור. לבסוף, הכינו את בקרת הפרוטאז של הטריפסין על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית מילי-מולרית אחת לבקבוקון הטריפסין הליופילי, ולערבב קצרות כדי להבטיח שהטריפסין מומס. אחסון הטריפסין בתנאים חומציים מגביר את יציבותו.

שימו לב שתמיסת הבקרה של טריפסין רגישה לטמפרטורה ואינה יציבה בריכוזים נמוכים. לאחר מכן, התחל להכין את כל דגימות הבדיקה, הכוללות דגימות בדיקה ובקרה וריקות לאורך כל הבדיקה. שמור על הדגימות מוגנות מפני אור עבור כל דגימת בדיקה.

שלב בצינור מיקרו צנטריפוגה, 20 מיקרוליטר של מאגר דגירה, 20 מיקרוליטר של מצע fit c kian ו-10 מיקרוליטר של דגימת הבדיקה. מותר להשתמש במיקרו צנטריפוגה שקופה כל עוד הדגימה מודגרת בחושך. שימו לב גם שדגימות בדיקה, שיש להן פעילות פרוטאז גבוהה, יצטרכו להיות מדוללות.

דגימת בקרת הטריפסין משמשת כבקרה חיובית שהבדיקה מבצעת כראוי כדי לקבוע את גבול הזיהוי או ליצור עקומה סטנדרטית כללית להכנת בקרת הטריפסין, לשלב חלק אחד של טריפסין מחומצן לתשעה חלקים של מאגר הדגירה או המאגר המשמש לדגימות הבדיקה ולערבב היטב. ריכוז העבודה הסופי של טריפסין הוא 20 מיקרוגרם למיליליטר. אם משתמשים בפרוטאז ספציפי אחר, הכינו את תמיסת הבקרה עם הפרוטאז הספציפי הזה ומאגר מתאים.

המשך להכין את דגימת הבקרה על ידי שילוב של 20 מיקרוליטר של מאגר דגירה, 20 מיקרוליטר של מצע fz cain ו-10 מיקרוליטר של בקרת הטריפסין בצינור מיקרו צנטריפוגה. מומלץ להריץ לפחות דגימת בקרה אחת של חמישה ננוגרם טריפסין בכל בדיקה או להשתמש בדילול סדרתי. הדגימה האחרונה היא הריק, שהוכן על ידי שילוב של 20 מיקרוליטר של מאגר דגירה, 20 מיקרוליטר של מצע פיץ קיין ו-10 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד בצינור מיקרו צנטריפוגה.

כששלושת סוגי הדגימות מוכנים, מערבבים בעדינות כל שפופרת ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 60 דקות. היזהר לא לערבב במרץ מדי מכיוון שמערבולות מוגזמות עלולות לגרום לרקע פלואורסצנטי גבוה ולהפחית את רגישות הבדיקה. ניתן לדגור עד 24 שעות כדי להגביר את הרגישות, אך דגירה ארוכה יותר אינה מומלצת מכיוון שקזאין FXI עלול להתחיל להתכלות.

שוב, מה שמוביל לרקע פלואורסצנטי גבוה בסיום הדגירה, השתמש בציוד מגן מתאים כדי להוסיף 150 מיקרוליטר של תמיסת TCA לכל צינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר הדגירה עם TCA יש להבחין באובך לבן הקיים בצינור, שהוא תערובת קין משקעת, לא מעוכלת ובלתי מסיסה, בעדינות ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות. בתום הדגירה עם תמיסת TCA צנטריפוגה את הצינורות למשך 10 דקות ב-10,000 גרם בטמפרטורת החדר.

הסופרנטנט מכיל את שברי הקיין המסיסים בחומצה המסומנים בפיט המשמשים למדידת הקרינה בעדינות מהחלק העליון של הצינור כך שאף אחד מהמשקעים בגלולה לא נשאב לתוך קצה הפיפטה, מה שיגרום לקריאה חיובית כוזבת במהלך הזיהוי הפלואורסצנטי הבא כדי למדוד את פעילות הפרוטאז באמצעות פלואורמטר המשולב 10 מיקרוליטר של סופרנטנט TCA עם מיליליטר אחד של מאגר הבדיקה בשפופרת ולערבב בעדינות. בנוסף, יש לדלל את תקן FE לניתוח על ידי הוספת 10 מיקרוליטר FE למיליליטר אחד של מאגר בדיקה. בקרת ה-FE ותקן Tripsin נותנים רמת פלואורסצנטיות שהדגימה לא תעלה על התמיסה של ה-TC. ניתן לאחסן סופרנטנט ומאגר בדיקה בחושך בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה.

אם מדידה באמצעות vete מעבירים מיליליטר אחד של התמיסה ל-vete מתאים, אם יש להפעיל מספר רב של דגימות, ניתן להשתמש בקורא צלחות 96 בארות וצלחות פלואורסצנטיות כדי לרכוש נתונים פלואורומטריים. בבדיקה זו, פלואורסצאין איזותיוציאנט מסופק כבקרה לכיול מכשיר אפשרי. מוצג כאן טווח ליניאריות מייצג של אות FS e בעקבות ההליך המתואר.

שימוש בערכה זו עם זמן דגירה של 30 דקות עבור שלב הדגירה הראשון מניב עקומה סטנדרטית טיפוסית זו עבור טריפסין ודגימות בקרה הנעות בין 1.5 ננוגרם ל-25 ננוגרם. מדידות הקרינה נעשו בצלחת מרובת בארות. גבול הזיהוי של הבדיקה הוא כמות הפרוטאז המייצרת קריאת פלואורסצנטיות משמעותית מעל הערך המתקבל עם הדגימה הריקה.

היום הראינו לך כיצד להשתמש בערכת קביעת הפרוטאז של סיגמא אולדרידג' כדי לזהות פעילות פרוטאז מטרי פלואור בדגימה ביולוגית. בעוד שערכה זו מותאמת לשימוש שלך, חשוב לזכור שעבור הפרוטאזות הספציפיות שלך, ייתכן שתזדקק לשינויים קלים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.