Name: שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למד כיצד למדוד פעילות פרוטאז באמצעות ערכת איתור פלורסנט הכוללת סובסטרט casein מסומן ב-FITC. השיטה מאפשרת זיהוי רגיש של זיהום פרוטאז בדגימות ביולוגיות לבקרת איכות מעבדתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הוראות הכנה מאגר הדגירה, Buffer Assay, ו 0.6 פתרון N TCA מסופקים מוכן לשימוש פתרונות. המצע FITC-קזאין - מומלץ aliquot המצע FITC-קזאין לתוך נפח קטן יותר עם הגעתו, כדי למנוע חזרה להקפיא להפשיר מחזורים. אם המצע FITC-קזאין נתונה להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים, עלייה קלה ברקע יתרחש, ובכך להקטין את הרגישות. Aliquots צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. מדגם כל, התגובה ריק, או לשלוט דורש 20 μl של המצע FITC-קזאין. הקפאה / הפשרה, כמו גם ערבוב נמרץ או רועד יכול לגרום FITC כדי להפריד בין קזאין שהתקבל ברקע גבוה קריאה גרימת המצע פחות להיות זמין עבור מחשוף פרוטאז. Isothiocyanate והעמסת (FITC), פתרון בקרת השליטה FITC ניתן מחדש של הצפת Assay לריכוז המתאים. פתרון זה צריך להיעשות טריים מוגן מפני אור. הפתרון הסופי הבקרה טריפסין - הוסף 100 μl של 1 mM HCl כדי בקבוקון של טריפסין, פרוטאז Control (קוד מוצר T 6567). מערבבים בקצרה, כדי להבטיח את טריפסין הוא מומס. הוסף 900 ​​μl של הצפת הדגירה ומערבבים היטב. לחלופין, מאגרים אחרים עשויים לשמש אם רוצים עבור assay. ריכוז העבודה הסופית של טריפסין הוא 20 מיקרוגרם / μl. כאשר מוכן להכין את פתרון בקרת טריפסין, לשלב aliquot הפתרון טריפסין חומצי עם כמות נכונה של הצפת הדגירה (1 acidified חלק טריפסין למאגר חלקי 9). אחסון טריפסין בתנאים חומצי מגביר את היציבות של טריפסין. הפתרון לשלוט טריפסין רגיש טמפרטורה אינו יציב בריכוזים נמוכים. נא לעיין בעלון הטכני של ערכת לאחסון והיציבות של הפתרונות הללו מוכנים. נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הכי קל להכין שולטת, החסר, ואת כל הדגימות בבת אחת. עבור כל מדגם הבדיקה, להוסיף 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl של מדגם הבדיקה לצינור microcentrifuge. לקבלת דוגמיות מבחן עם פעילות הפרוטאז גבוהה, דילול מדגם ייתכן שתידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות בקרה מתאימה (ראה דוגמאות הבקרה) על ידי הוספת 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl של המדגם שליטה צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם ריק ידי הוספת 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl מים ultrapure לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות כל צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 60 דקות. היזהר לא לערבב יותר מדי במרץ, כמו מערבולת מופרז עלול לגרום רקע הקרינה גבוהה להפחית את הרגישות של assay. הערה: זמן דגירה ניתן להאריך עד 24 שעות כדי להגביר את הרגישות. היזהר שלא יעלה על 24 שעות כמו FITC-קזאין עשויים להתחיל לבזות, המוביל רקע הקרינה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה להוסיף 150 μl הפתרון N 0.6 חומצה Trichloroacetic אל צינור כל microcentrifuge. TCA היא מאכל מאוד יש לטפל תוך לבישת ציוד מגן מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 10 דקות על 10,000 x ז Supernatant מכיל חומצה מסיסים, שברי שכותרתו FITC והוא משמש למדידת הקרינה. </li></ol> מדידות הקרינה שיטות אלה תשודרג כלפי מעלה או מטה בהתאם לדרישות של המכשור זמין. לשם השוואה עקומת סטנדרט מוכן עם דגימות בקרה מתאימה, לחסר הקריאה הקרינה של המדגם ריק (FLUblank) מהערך של מדגם הבדיקה (FLUtest). Cuvettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של supernatant (שלב 7) ו - 1 מ"ל של הצפת Assay לתוך קובט מתאים ומערבבים בעדינות. הערה: פתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר. </li></ol> Multiwell פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של הערה supernatant (שלב 7) 1 מ"ל של הצפת Assay לתוך צינור הבקבוקון מתאים או ומערבבים בעדינות: הפתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 μl לבאר צלחת 96 שחור טוב. רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר. או </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μl של supernatant (שלב 7) ו - 200 μl של B Assayuffer לבאר צלחת 96 שחור טוב. הערה: פתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר. </li></ol> בקרת דוגמאות פתרון בקרת טריפסין ניתן להשתמש כדי לאשר assay הוא מבצע כראוי, כדי לקבוע את גבול הגילוי, או ליצור עקומת סטנדרט כללי. עבור assay של פרוטאז אחר, ספציפי, מומלץ להכין פתרון בקרת המכיל את פרוטאז ספציפי למאגר הדגירה המתאים. גבול הגילוי של assay הוא כמות פרוטאז שמייצר קריאה הקרינה משמעותית מעל הערך שהושג עם המדגם ריק. גבול הגילוי ישתנה בהתאם הרגישות של המכשור. דילולים סידורי הפתרון בקרת טריפסין עשויים לשמש ליצירת פתרונות שליטה. שווה קריאה עד 120% מהשווי המתקבל עם המדגם ריק נחשב משמעותי. באופן שגרתי, הגבלה של גילוי של ng 5 של טריפסין התקבל עם הליך זה. מומלץ כי לפחות אחד 5 שליטת ng טריפסין להתנהל עם כל assay. פתרון בקרת טריפסין עם ריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​תגרום ng 5 הרצויה של טריפסין ב assay. דילול של פי 40 הפתרון בקרת טריפסין (20 מיקרוגרם / מ"ל) תוצאות בפתרון מיקרוגרם / מ"ל ​​0.5 שליטה, כלומר חלק אחד של פתרון בקרת טריפסין עד 39 חלקים של הצפת דגירה. <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="איור 1"> איור 1 (Curve האחיד של פעילות טריפסין): הפתרון בקרת טריפסין (20 מיקרוגרם / מ"ל) עשוי לשמש גם כדי ליצור עקומת סטנדרט ידי ביצוע דילולים סדרתי (ראה איור 1). הקריאה הקרינה של המדגם כל פקד תוקנה על ידי הפחתת הקרינה קריאה של המדגם ריק (FLUblank) מהערך של המדגם כל פקד (FLUcontrol). עקומת סטנדרט אופיינית עבור טריפסין (קוד מוצר T 6567) באמצעות ערכת דגימות השליטה החל 0.15 מיקרוגרם / מ"ל ​​(ננוגרם 1.5) על 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(ננוגרם 25). עקומת הזה נוצר על ידי ביצוע ההליך המתואר, עם זמן דגירה של 30 דקות עבור לשלב 4. מדידות הקרינה שנעשו צלחת multiwell. Isothiocyanate והעמסת מסופק כביקורת לצורך כיול מכשיר אפשרי (ראו הוראות היצרן המתאים) או קביעת טווח הלינאריות של האות FITC.

<ol><li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li>
</ol>

הכותב הוא עובד של סיגמא אולדריץ המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

הראינו רק assay למשל באמצעות ערכת פלורסנט פרוטאז איתור לזהות פעילות הפרוטאז במדגם ביולוגי. ערכה זו כבר אופטימיזציה לאתר מגוון רחב של פרוטאזות למצוא יישומים פיזיולוגיים. הוא מתאים לכל גילוי של ציסטאין סרין, Metallo ו פרוטאזות אספרטית, אולם שינויים עשויים להידרש לזהות כמה פרוטאזות ספציפיות.

<table><tbody><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=PF0100%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346&quot;&gt;ערכה לגילוי פלואורסצנטי של פרוטאז&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=H1758%7CSIGMA&amp;amp;N5=חיפוש_שרשור_מספר_קטלוג%7Cמפתח_מותג&amp;amp;F=מפרט&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347&quot;&gt;חומצה כלורית&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מספק מוכן לשימוש ריאגנטים לגילוי נוכחות של פעילות הפרוטאז. Assay זה פשוט לזהות פעילות הפרוטאז משתמש שכותרתו קזאין כמו המצע עם isothiocyanate והעמסת (FITC). פעילות פרוטאז תוצאות המחשוף של המצע קזאין FITC שכותרתו לרסיסים קטנים, אשר אינם לזרז בתנאים חומציים. לאחר דגירה של המדגם פרוטאז ואת המצע, התגובה היא acidified עם תוספת של חומצה Trichloroacetic (TCA). התערובת היא centrifuged אז עם המצע מעוכלים להרכיב גלולה ואת קטנים, שברי מסיס חומצה שנותרו פתרון. Supernatant היא לנטרל את הקרינה של ה-FITC שכותרתו שברי נמדד. ההליך המתואר הערכה מזהה את השליטה הפרוטאז טריפסין בריכוז של כ 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(5 ng של טריפסין הוסיף assay). רגישות זו יכולה להיות מוגברת עם זמן דגירה ארוכה יותר, עד 24 שעות. Assay מתבצעת צינורות microcentrifuge והנהלים ניתנים לאיתור באמצעות פלואורסצנציה או cuvettes או צלחות multiwell.

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

ערכה לזיהוי פלואורסצנטי של פרוטאז מספקת ריאגנטים מוכנים לשימוש לזיהוי נוכחות של פעילות פרוטאז. בדיקה פשוטה זו לזיהוי...

פרוטוקול זה מתחיל בהוספת באפר אינקובציה, תמיסת FXI casein ודגימה המכילה את הפרוטאיז הרלוונטי למבחנה למיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן בערבוב עדין ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות בחושך. כדי להפסיק את התגובה הפרוטאוליטית בסוף תקופת הדגירה, יש להוסיף תמיסת TCA, לערבב בעדינות ולדגור שוב בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות בחושך. שלב זה יגרום למשקע של הסובסטרט שאינו פעיל.סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 10 דקות, ב-10,000 Gs. הסר את הנוזל העליון (supernatant), המכיל את מקטעי ה-FXI המסומנים המסיסים בחומצה. העבר את הנוזל העליון למבחנה או ללוחית רב-בארים, דלל בעזרת באפר בדיקה (assay buffer) ומדוד את הדגימה בפלואורימטר.שלום, אני Carrie Cup Vineyard ואני מדענית במתקן Sigma Aldridge DeKalb שלנו בסנט לואיס, מיזורי. היום אדגים לכם פרוטוקול לקביעת פעילות פרוטאז פלואורומטרית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה לבקרת איכות כדי לקבוע פעילות פרוטאז נמוכה.בואו נתחיל. עבור פרוצדורה זו, בופר האינקובציה, בופר הבדיקה ותמיסת חומצה טריכלורואצטית (TCA) בריכוז 0.6 N מסופקים כתמיסות מוכנות לשימוש. חלקו את תמיסת ה-fite המסומנת כ-Cain לנפחים קטנים יותר ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. הקפידו להגן מהאור על ידי שימוש במבחנות ענבר או עטיפת מבחנות שקיפות בנייר גפית.שימוש בתשת ה-fite Cain מצמצם את הצורך במחזורי הקפאה והפשרה חוזרים; מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים או ניעור וערבוב נמרץ של ה-fite Cain עלולים להוביל להפרדה של ה-fite מה-Cain, דבר שיגרום לרקע גבוה יותר. לצורך כיול הפלוארימטר או קביעת הטווח הליניארי עבור אות ה-fit e, הכין את תמיסת הבקרה של ה-fit. הכן את התמיסどれ באופן רענן על ידי הרכבה מחדש בבופר של הבדיקה לריכוז המתאים.כאשר התמיסה מוכנה, יש להגן עליה מפני אור. לבסוף, הכין את בקרת הפרוטאז tripsin על ידי הוספת 100 µL של חומצה כלורית (hydrochloric acid) בריכוז 1 mM למבחנה עם ה-trypsin הליאופיליזד, וערבב קצרות כדי להבטיח שה-trypsin הומס. אחסון ה-trypsin בתנאים חומציים מגביר את יציבותו.שים לב כי תמיסת הבקרה של Tripsin רגישה לטמפרטורה ואינה יציבה בריכוזים נמוכים. כעת, התחל בהכנת כל דגימות הבדיקה, הכוללות את דגימות הניסוי, דגימות הבקרה והדגימות הריקנות (blanks) לאורך הבדיקה. שמור על הדגימות מוגנות מאור עבור כל דגימת ניסוי.ערבבו בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה 20 µL של בופר דגירה, 20 µL של סובסטרט fit c kian ו-10 µL של דגימת הבדיקה. ניתן להשתמש במבחנת מיקרו-צנטריפוגה שקופה, כל עוד הדגימה מדגירה בחושך. שימו לב כי דגימות בדיקה בעלות פעילות פרוטאז גבוהה ידרשו דילול.מדגם הבקרת ה-trypsin משמש כביקורת חיובית לכך שהבדיקה מתבצעת כראוי, לצורך קביעת סף הגילוי או ליצירת עקומת סטנדרט כללית. כדי להכין את בקרת ה-trypsin, ערבבו חלק אחד של trypsin מחומץ עם תשעה חלקים של בופר אינקובציה או הבופר המשמש לדגימות הבדיקה, וערבבו היטב. ריכוז העבודה הסופי של ה-trypsin הוא 20 µg/mL. במידה ומשתמשים בפרוטאז ספציפי אחר, הכינו את תמיסת הבקרה עם אותו פרוטאז ספציפי ובבופר מתאים.המשיכו להכין את דגימת הביקורת על ידי ערבוב של 20 microliters של בופר אינקובציה, 20 microliters של מצע fz cain ו-10 microliters של ביקורת trypsin בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. מומלץ להריץ לפחות דגימת ביקורת אחת של 5 nanograms trypsin עם כל בדיקה או להשתמש בדילול סדרתי. הדגימה האחרונה היא דגימת הבלנק (blank), המוכנת על ידי ערבוב של 20 microliters של בופר אינקובציה, 20 microliters של מצע Fitz Caine ו-10 microliters של מים אולטרה-טהורים בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה.לאחר שהשלושה סוגי הדגימות מוכנים, ערבבבו בעדינות כל מבחנה והדגימו בטמפרטורה של 37 °C בחושך למשך 60 דקות. יש להימנע מערבוב חזק מדי, שכן טורבולנציה מוגברת עלולה לגרום לרקע פלואורסצנטי גבוה ולהפחית את רגישות הבדיקה. ניתן להדגים עד 24 שעות כדי להגביר את הרגישות, אך הדגמות ממושכות יותר אינן מומלצות מכיוון ש-FXI casein עלול להתחיל להתפרק.כדי למנוע רקע פלואורסצנטי גבוה בסיום האינקובציה, השתמשו בציוד מגן מתאים והוסיפו 150 µL של תמיסת TCA לכל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר האינקובציה עם TCA, יש להבחין בערפל לבן במבחנה, המהווה את תערובת החלבונים המשקועים, הבלתי מעוקלים והבלתי מסיסים; ערבבו בעדינות דגרו בטמפרטורה של 37 °C בחושך למשך 30 דקות. בתום האינקובציה עם תמיסת ה-TCA, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-10,000 Gs בטמפרטורת החדר.העלייה מכילה את מקטעי ה-fite מסיסי החומצה המסומנים ב-Cain המשמשים למדידת הפלואורסצנציה; שאבו בזהירות מהחלק העליון של המבחנה כדי שלא יישאף למטר השאיבה השקע שנמצא בתחתית, דבר שיגרום לקריאה חיובית שגויה במהלך גילוי הפלואורסצנציה הבא. כדי למדוד את פעילות הפרוטאז באמצעות פלואורימטר, ערבבו 10 µL מהעלייה של ה-TCA עם מיליליטר אחד של תמיסת באפר למדידה במבחנה וערבבו בעדינות. בנוסף, דללו את סטנדרט ה-FE לצורך אנליזה על ידי הוספת 10 µL של FE למיליליטר אחד של באפר למדידה. בקרת ה-FE וסטנדרט ה-Tripsin מספקים רמת פלואורסצנציה שהדגימה אינה אמורה לעבור אותה. ניתן לשמור את התמיסה של עליית ה-TCA ובאפר המדידה בחושך בטמפרטורה של 2 עד 8 °C למשך עד 24 שעות לפני מדידת הפלואורסצנציה.אם המדידה מתבצעת באמצעות Cuvette, העבירו מיליליטר אחד של התמיסה ל-Cuvette מתאימה; אם יש להריץ מספר רב של דגימות, ניתן להשתמש בלוחית 96 בארות ובקורא לוחיות פלואורסצנטי לרכישת נתוני פלואורומטריה. בבדיקה זו, fluorescein isothiocyanate מסופק כביקורת לצורך כיול אפשרי של המכשיר. מוצג כאן טווח ליניאריות מייצג של אות ה-FS e בעקבות הפרוטוקול המתואר.שימוש בערכה זו עם זמן דגירה של 30 דקות לשלב הדגירה הראשון מניב עקומת סטנדרט טיפוסית זו עבור טריפסין ודגימות ביקורת בטווח שבין 1.5 nanograms ל-25 nanograms. מדידות פלואורסצנציה בוצעו בלוחית ריבוי בארות (multi-well plate). גבול הגילוי של הבדיקה הוא כמות הפרוטאז המייצרת קריאת פלואורסצנציה משמעותית מעל הערך שהתקבל עם דגימת הריק (blank sample).היום הצגנו בפניכם כיצד להשתמש בערכה של Sigma Aldridge לקביעת פרוטאז כדי לזהות פעילות פרוטאז פלואורימטרית בדגימה ביולוגית. בעוד שערכה זו מותאמת לשימושכם, חשוב לזכור כי עבור הפרוטאזים הספציפיים שלכם, ייתכן שיהיו נחוצים שינויים קלים. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

use-protease-fluorescent-detection-kit-to-determine-protease

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מבצעים זימוגרפיה, טכניקה אלקטרופורטית, כדי לנתח את הפעילות הפרוטאוליטית בתוך דגימות ביולוגיות.

Zymography פפטיד פלואורסצנטי: טכניקה שונה לזיהוי פעילות פרוטאז באמצעות מצעים פלואורוגניים בג'ל זימוגרפיה

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות באמצעות פפטידים פלואורוגניים. הפרוטאז מזהה את מיקום המחשוף שלו על הפפטיד, חותך אותו ומפריד את המרווה מהפלואורופור, מה שמאפשר את פליטת הפלואורסצנטיות שלו. האות הפלואורסצנטי מזוהה ומנותח כדי לבדוק את יעילות המחשוף של גרסאות פפטידים שונות.

בדיקת מחשוף פפטיד פלואורוגני לבדיקת הפעילות הפרוטאוליטית של פרוטאזות

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לכימות פעילות פרוטאז סרין נויטרופילים בדגימות כיח. הדגימה המכילה פרוטאז מופרש מודגרת בכתב פלורסנט הנושא מוטיב זיהוי. פיצול המוטיב על ידי הפרוטאז מאפשר פליטת פלואורסצנטיות אינדיבידואלית על ידי התורם והמקבל פלואורופור של המדווח, דבר המעיד על פעילות פרוטאז בדגימה.

בדיקת מבחנה למדידת פעילות פרוטאז סרין נויטרופיל באמצעות כתב פלואורסצנטי

סרטון זה מדגים כיצד למדוד את פעילות הפרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים של האמיגדלה הצידית ממוחות של חולדות מותני פחד ולשלוט בהם באמצעות בדיקת פפטיד פלואורוגני. הפרוטאזום חותך את המצע הפפטידי הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורסצנטיות, אשר מכומתות באמצעות קורא לוחות כדי להעריך את פעילות הפרוטאזום בשברים של חלבון גרעיני וסינפטי. פעילות גרעינית מוגברת מצביעה על שינויים בביטוי גנים, בעוד שפעילות סינפטית מופחתת מצביעה על ייצוב חלבונים הנחוץ לתחזוקת הזיכרון לטווח ארוך.

מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הכיוון והטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים. פרוטוקול פשוט זה מסתמך על רגישות סלקטיבית לפרוטאז של כימרות בין החלבון המעניין ל-GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

פרוטאזות הם מוסדרים בחוזקה אנזימים המעורבים התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, והתקדמות dysregulated פרוטאז פעילות כוננים של מחלות מורכבות כגון סרטן. בשיטה זו המטרה היא ליצור nanosensors המודדים פרוטאז פעילות ויוו על ידי ייצור לאות המחשוף שקיימים משתן מארח ומפלה המחלה.

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

כאן, אנו מציגים את ההליך מפורט של פלטפורמה assay פרוטאז שפותחו לאחרונה ניצול N-מסוף hexahistidine/מלטוז-מחייב חלבון ותערובות פלורסנט התמזגו חלבון רקומביננטי המחובר למשטח של ניקל-nitrilotriacetic חומצה agarose מגנטי חרוזים. גם מוצג ניתוח בג'ל עוקבות של הדגימות assay המופרדות על-ידי נתרן גופרתי-לזיהוי dodecyl בג'ל.

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

אנו מציגים פפטיד fluorogenic assay המחשוף המאפשר הקרנה מהירה הפעילות הפרוטאוליטי של פרוטאזות על פפטידים המייצגים האתר המחשוף של פפטידים פיוז'ן ויראלי. שיטה זו יכולה לשמש גם על כל מוטיב חומצת אמינו אחרות בתוך רצף חלבונים כדי לבדוק את הפעילות פרוטאז.

Fluorogenic פפטיד Assay המחשוף, למסך לפעילות הפרוטאוליטי: יישומים עבור הקורונה ספייק הפעלת חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור טכניקה שונה zymographic שבו ניאון פפטידים משמשים את המצע מתכלה במקום חלבונים מקורית. אלקטרופורזה של דגימות ביולוגיות בפפטיד פלורסנט zymograms מאפשר זיהוי של מגוון רחב יותר של פרוטאזות מאשר טכניקות zymographic הקודם.

זיהוי של פרוטאז פעילות על-ידי ניאון פפטידים Zymography

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות למדידת פעילות הקספז באמצעות מצע פלואורוגני באמצעות ציטומטריית זרימה או ספקטרופלואורומטר.

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

למד כיצד למדוד פעילות פרוטאז באמצעות ערכת איתור פלורסנט הכוללת סובסטרט casein מסומן ב-FITC. השיטה מאפשרת זיהוי רגיש של זיהום פרוטאז בדגימות ביולוגיות לבקרת איכות מעבדתית.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

גלה סרטונים נוספים