שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז
4 באוגוסט 2009
ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.
פרוטוקול זה מתחיל בהוספת באפר אינקובציה, תמיסת FXI casein ודגימה המכילה את הפרוטאיז הרלוונטי למבחנה למיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן בערבוב עדין ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות בחושך. כדי להפסיק את התגובה הפרוטאוליטית בסוף תקופת הדגירה, יש להוסיף תמיסת TCA, לערבב בעדינות ולדגור שוב בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות בחושך. שלב זה יגרום למשקע של הסובסטרט שאינו פעיל.
סבב את הדגימה בצנטריפוגה למשך 10 דקות, ב-10,000 Gs. הסר את הנוזל העליון (supernatant), המכיל את מקטעי ה-FXI המסומנים המסיסים בחומצה. העבר את הנוזל העליון למבחנה או ללוחית רב-בארים, דלל בעזרת באפר בדיקה (assay buffer) ומדוד את הדגימה בפלואורימטר.
שלום, אני Carrie Cup Vineyard ואני מדענית במתקן Sigma Aldridge DeKalb שלנו בסנט לואיס, מיזורי. היום אדגים לכם פרוטוקול לקביעת פעילות פרוטאז פלואורומטרית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה לבקרת איכות כדי לקבוע פעילות פרוטאז נמוכה.
בואו נתחיל. עבור פרוצדורה זו, בופר האינקובציה, בופר הבדיקה ותמיסת חומצה טריכלורואצטית (TCA) בריכוז 0.6 N מסופקים כתמיסות מוכנות לשימוש. חלקו את תמיסת ה-fite המסומנת כ-Cain לנפחים קטנים יותר ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. הקפידו להגן מהאור על ידי שימוש במבחנות ענבר או עטיפת מבחנות שקיפות בנייר גפית.
שימוש בתשת ה-fite Cain מצמצם את הצורך במחזורי הקפאה והפשרה חוזרים; מחזורי הקפאה והפשרה חוזרים או ניעור וערבוב נמרץ של ה-fite Cain עלולים להוביל להפרדה של ה-fite מה-Cain, דבר שיגרום לרקע גבוה יותר. לצורך כיול הפלוארימטר או קביעת הטווח הליניארי עבור אות ה-fit e, הכין את תמיסת הבקרה של ה-fit. הכן את התמיסどれ באופן רענן על ידי הרכבה מחדש בבופר של הבדיקה לריכוז המתאים.
כאשר התמיסה מוכנה, יש להגן עליה מפני אור. לבסוף, הכין את בקרת הפרוטאז tripsin על ידי הוספת 100 µL של חומצה כלורית (hydrochloric acid) בריכוז 1 mM למבחנה עם ה-trypsin הליאופיליזד, וערבב קצרות כדי להבטיח שה-trypsin הומס. אחסון ה-trypsin בתנאים חומציים מגביר את יציבותו.
שים לב כי תמיסת הבקרה של Tripsin רגישה לטמפרטורה ואינה יציבה בריכוזים נמוכים. כעת, התחל בהכנת כל דגימות הבדיקה, הכוללות את דגימות הניסוי, דגימות הבקרה והדגימות הריקנות (blanks) לאורך הבדיקה. שמור על הדגימות מוגנות מאור עבור כל דגימת ניסוי.
ערבבו בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה 20 µL של בופר דגירה, 20 µL של סובסטרט fit c kian ו-10 µL של דגימת הבדיקה. ניתן להשתמש במבחנת מיקרו-צנטריפוגה שקופה, כל עוד הדגימה מדגירה בחושך. שימו לב כי דגימות בדיקה בעלות פעילות פרוטאז גבוהה ידרשו דילול.
מדגם הבקרת ה-trypsin משמש כביקורת חיובית לכך שהבדיקה מתבצעת כראוי, לצורך קביעת סף הגילוי או ליצירת עקומת סטנדרט כללית. כדי להכין את בקרת ה-trypsin, ערבבו חלק אחד של trypsin מחומץ עם תשעה חלקים של בופר אינקובציה או הבופר המשמש לדגימות הבדיקה, וערבבו היטב. ריכוז העבודה הסופי של ה-trypsin הוא 20 µg/mL. במידה ומשתמשים בפרוטאז ספציפי אחר, הכינו את תמיסת הבקרה עם אותו פרוטאז ספציפי ובבופר מתאים.
המשיכו להכין את דגימת הביקורת על ידי ערבוב של 20 microliters של בופר אינקובציה, 20 microliters של מצע fz cain ו-10 microliters של ביקורת trypsin בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. מומלץ להריץ לפחות דגימת ביקורת אחת של 5 nanograms trypsin עם כל בדיקה או להשתמש בדילול סדרתי. הדגימה האחרונה היא דגימת הבלנק (blank), המוכנת על ידי ערבוב של 20 microliters של בופר אינקובציה, 20 microliters של מצע Fitz Caine ו-10 microliters של מים אולטרה-טהורים בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה.
לאחר שהשלושה סוגי הדגימות מוכנים, ערבבבו בעדינות כל מבחנה והדגימו בטמפרטורה של 37 °C בחושך למשך 60 דקות. יש להימנע מערבוב חזק מדי, שכן טורבולנציה מוגברת עלולה לגרום לרקע פלואורסצנטי גבוה ולהפחית את רגישות הבדיקה. ניתן להדגים עד 24 שעות כדי להגביר את הרגישות, אך הדגמות ממושכות יותר אינן מומלצות מכיוון ש-FXI casein עלול להתחיל להתפרק.
כדי למנוע רקע פלואורסצנטי גבוה בסיום האינקובציה, השתמשו בציוד מגן מתאים והוסיפו 150 µL של תמיסת TCA לכל מבחנת מיקרו-צנטריפוגה. לאחר האינקובציה עם TCA, יש להבחין בערפל לבן במבחנה, המהווה את תערובת החלבונים המשקועים, הבלתי מעוקלים והבלתי מסיסים; ערבבו בעדינות דגרו בטמפרטורה של 37 °C בחושך למשך 30 דקות. בתום האינקובציה עם תמיסת ה-TCA, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-10,000 Gs בטמפרטורת החדר.
העלייה מכילה את מקטעי ה-fite מסיסי החומצה המסומנים ב-Cain המשמשים למדידת הפלואורסצנציה; שאבו בזהירות מהחלק העליון של המבחנה כדי שלא יישאף למטר השאיבה השקע שנמצא בתחתית, דבר שיגרום לקריאה חיובית שגויה במהלך גילוי הפלואורסצנציה הבא. כדי למדוד את פעילות הפרוטאז באמצעות פלואורימטר, ערבבו 10 µL מהעלייה של ה-TCA עם מיליליטר אחד של תמיסת באפר למדידה במבחנה וערבבו בעדינות. בנוסף, דללו את סטנדרט ה-FE לצורך אנליזה על ידי הוספת 10 µL של FE למיליליטר אחד של באפר למדידה. בקרת ה-FE וסטנדרט ה-Tripsin מספקים רמת פלואורסצנציה שהדגימה אינה אמורה לעבור אותה. ניתן לשמור את התמיסה של עליית ה-TCA ובאפר המדידה בחושך בטמפרטורה של 2 עד 8 °C למשך עד 24 שעות לפני מדידת הפלואורסצנציה.
אם המדידה מתבצעת באמצעות Cuvette, העבירו מיליליטר אחד של התמיסה ל-Cuvette מתאימה; אם יש להריץ מספר רב של דגימות, ניתן להשתמש בלוחית 96 בארות ובקורא לוחיות פלואורסצנטי לרכישת נתוני פלואורומטריה. בבדיקה זו, fluorescein isothiocyanate מסופק כביקורת לצורך כיול אפשרי של המכשיר. מוצג כאן טווח ליניאריות מייצג של אות ה-FS e בעקבות הפרוטוקול המתואר.
שימוש בערכה זו עם זמן דגירה של 30 דקות לשלב הדגירה הראשון מניב עקומת סטנדרט טיפוסית זו עבור טריפסין ודגימות ביקורת בטווח שבין 1.5 nanograms ל-25 nanograms. מדידות פלואורסצנציה בוצעו בלוחית ריבוי בארות (multi-well plate). גבול הגילוי של הבדיקה הוא כמות הפרוטאז המייצרת קריאת פלואורסצנציה משמעותית מעל הערך שהתקבל עם דגימת הריק (blank sample).
היום הצגנו בפניכם כיצד להשתמש בערכה של Sigma Aldridge לקביעת פרוטאז כדי לזהות פעילות פרוטאז פלואורימטרית בדגימה ביולוגית. בעוד שערכה זו מותאמת לשימושכם, חשוב לזכור כי עבור הפרוטאזים הספציפיים שלכם, ייתכן שיהיו נחוצים שינויים קלים. וזהו זה.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
סקירה כללית
ערכה לגילוי פלואורסצנטי של פרוטאז מאפשרת מדידה של פעילות פרוטאז באמצעות פלואורומטריה, מה שהופך אותה למתאימה לגילוי זיהומים של עקבות פרוטאז. השיטה משתמשת בסובסטרט קזאין מסומן ב-FITC, רשום כפטנט, עבור הידרוליזה פרוטאוליטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדידת פעילות פרוטאז
- ניתוח פלואורומטרי
- בקרת איכות בסביבת מעבדה
רקע
- הערכה תוכננה לזיהוי מדויק של פעילות פרוטאז.
- היא חיונית לבקרת איכות ביישומים ביולוגיים שונים.
- שיטות פלואורומטריות מספקות יכולות זיהוי רגישות.
- טיפול ואחסון נאותים של הרכיבים קריטיים לביצועי הבדיקה.
מטרת המחקר
- לספק שיטה מהימנה למדידת פעילות פרוטאז.
- להקל על זיהוי רמות נמוכות של זיהום בפרוטאז.
- להבטיח בקרת איכות בסביבות מעבדה.
שיטות ששימשו במחקר
- הכנת באפר אינקובציה ומצע קזאין המסומן ב-FITC.
- אינקובציה של הדגימות ב-37 °C בחושך.
- שימוש בתמיסת TCA לעצירת התגובות הפרוטאוליטיות.
- מדידת פלואורסצנציה באמצעות פלואורימטר או פלטת 96 בארות.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של פעילות פרוטאז בדגימות שונות.
- הקמה של עקומת סטנדרט לכיול הבדיקה.
- הדגמה של הרגישות והספציפיות של הבדיקה.
- תיקוף של השיטה באמצעות דגימות ביקורת.
מסקנות
- ערכה לגילוי פלואורסצנטי של פרוטאזה יעילה להערכת פעילות פרוטאזית.
- תנאי בדיקה נאותים משפרים את רגישות הגילוי.
- שיטה זו מתאימה ליישומי בקרת איכות שגרתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ערכה לזיהוי פלואורסצנטי של פרוטאז מאפשרת מדידה רגישה וכמותית של פעילות פרוטאז באמצעות קריאה פלואורומטרית של פירוק קזאין המסומן ב-FITC. בדיקה זו תומכת בתיקוף יעדים בשלב מוקדם על ידי אספקת שיטה אמינה וניתנת לשחזור להערכת תפקוד פרוטאוליטי בדגימות ביולוגיות, ובכך היא מסייעת בהורדת סיכונים מכניסטיים של מסלולים תלויי-פרוטאז. התאימות שלה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה וללוחות רב-בארים מאפשרת שילובה בתהליכי סריקה לזיהוי מולקולות מובילות (leads) ופיתוח בדיקות בתוכניות לגילוי תרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות תלויות-פרוטאז באמצעות זיהוי כמותי של פיצול סובסטרט.
- ערך תפעולי: מספק פורמט סטנדרטי מבוסס-ערכה המפחית שונות במדידות פעילות פרוטאז בין ניסויים שונים.
- ערך חיזוי: תומך בהערכת העוצמה והסלקטיביות של מעכבי פרוטאז על ידי מדידת הפעילות השיורית בדגימות מטופלות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתוני תגובה למינון עבור מעכבי פרוטאז באמצעות אות פלואורסצנציה ליניארי הפרופורציונלי לפעילות הפרוטאוליטית.
- ערך תפעולי: תואם לפורמטים של פלטות בעלות 96 בארות, מה שמאפשר סריקה של ספריות תרכובות או ספריות מוטנטים בתפוקה בינונית.
- מוכנות הבדיקה: עושה שימוש בביקורות ליופיליזיות יציבות ובבופרים מוכנים לשימוש כדי למזער את זמן ההכנה ולהבטיח עקביות של הריאגנטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בהערכה של סמנים ביולוגיים של פרוטאז במודלים רלוונטיים למחלה על ידי זיהוי פעילות פרוטאז אנדוגנית בליזאטים או בתת-נוזלים (supernatants).
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מסייע להבחין בין השפעות פרוטאוליטיות על המטרה (on-target) להשפעות שאינן על המטרה (off-target) במהלך אופטימיזציה של מולקולת מוביל (lead optimization).
- ביטחון חיזוי: מאפשר ניטור לאורך זמן של מודולציית פרוטאז במחקרים פרה-קליניים באמצעות נקודת סיום פלואורומטרית כמותית.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), כאשר מדידות כמותיות של פעילות הפרוטאז מספקות מידע על קשרי מבנה-פעילות (structure-activity relationships) ופרופיל סלקטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי מדידת שינויים בפעילות הפרוטאז בעקבות הפרעה גנטית או פרמקולוגית.
- סקר (Screening): מאפשר הערכה של ספריות תרכובות לעיכוב פרוטאז באמצעות קריאה הומוגנית המבוססת על פלואורסצנציה.
- אנליטיקה: מייצר נתוני פלואורסצנציה כמותיים שניתן לנרמל אל מול ביקורות ולהשתמש בהם לחישוב ערכי IC50 או % עיכוב.
- מחקר תרגומי: מסייע בהתאמת סממנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי זיהוי פעילות פרוטאז במודלים פרה-קליניים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול הסטנדרטי של הערכה מאפשר שימוש חוזר בפרויקטים ובצוותים השונים החוקרים פרוטאזים או מעכבים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי תפקוד הפרוטאז ומנגנון הפעולה של המעכב.
- ערך תפעולי: מציע בדיקה חסונה וניתנת לשחזור עם רגישות מוגדרת (מזהה ~0.5 µg/mL trypsin) וזמני דגירה ניתנים להתאמה לצורך אופטימיזציה.
- ערך אסטרטגי: מפחית תוצאות חיוביות שגויות בסריקה על ידי הבחנה בין פעילות פרוטאוליטית אמיתית לבין הפרעות בבדיקה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות go/no-go מבוססות נתונים על סמך פרופילים כמותיים של מודולציה של פרוטאז.
שיקולי יישום
- דורש הכשרה בסיסית בפלואורומטריה וטיפול נכון בריאגנטים רגישים לאור המסומנים ב-FITC.
- תלוי בגישה לפלואורומטר או לקורא פלטות בעל יכולת פלואורסצנציה לצורך זיהוי נקודת סיום (endpoint detection).
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי האינקובציה והעצירה בין המשתמשים כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין ניסויים.
- דורש דילול של דגימות בעלות פעילות גבוהה כדי להישאר בתוך הטווח הליניארי של הבדיקה.
- מומלץ להשתמש בביקורות ספציפיות לפרוטאז כדי לתקף את ביצועי הבדיקה עבור מטרות שאינן טריפסין.
