Name: ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 56 s
Description: למד שיטת טרנספקציה של DNA פלסמיד לשרירי כף הרגל בעכברים חיים באמצעות אלקטרופורציה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של ביטוי חלבונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסייעת במחקר תרפיית גנים וביולוגיית שריר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ט אוטיס, המחלקה לנוירוביולוגיה, UCLA, לשיתוף מתקן TPLSM איתנו, ד&quot;ר ג Fahlke, המכון לפיזיולוגיה, RWTH אאכן, גרמניה, על התרומה סוג של pEYFP-ClC1 פלסמיד, ומר . ר סראנו לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH / NIAMS מענקים AR047664 ו AR54816.

הפרוצדורות שכן electroporation vivo של השרירים FDB ו IO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת בפרוטוקולים vivo electroporation, פלסמידים ביטוי יונקים יש ריכוז מוגבר להניב בטווח של עד 2-5 מיקרוגרם הערה פלסמיד / μl של TE:. אנו משתמשים באופן שגרתי ערכות הגברה מסחרית בצע את ההליכים של היצרן. ביטוי מסחרי פלסמידים הנושאים את העבודה האמרגן CMV היטב בשרירי השלד ב transfections vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח Aliquot הצורך (1-20 μl) של הפתרון פלסמיד ולשמור אותו בשתי 0.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות (אחד עבור כל רגל של העכבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​hyaluronidase ב Tyrode סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתיבת הרדמה, עמוק להרדים בעכבר באמצעות 4% isoflurane ב O2 עם מכונת אושרה גז הרדמה. מניחים את חיה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) ולשמור על הרדמה באמצעות מסיכת פנים מכרסמים. צג את עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת התבוננות במיקרוסקופ לנתיחה, להזריק 10 μL הפתרון hyaluronidase מתחת לכפות הרגלים של רגל אחת על העכבר בעזרת 1 &quot;מחט ארוכה 33 מד סטרילית. לחדור את העור בנקודה קרוב לעקב כף הרגל ולקדם את מחט תת עורית לעבר בסיס של אצבעות על ~ 1 / 4 &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עם הרגל השנייה אם רוצים כל כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הרדמה במקום עכבר בכלוב. אפשר לו להחלים לחלוטין מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה, להרדים את החיה בפעם השנייה והנח אותו על משטח חימום. בעקבות ההליך אותו תיאר לפתרון hyaluronidase, להזרים סכום של 20-50 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד (תלוי בגודל של לבנות את הפלסמיד). נפח הזרקה בסך הכל צריך להיות פחות מ 20 μL / רגל. הערה: כאשר L μ 15-20 הכרחי, מומלץ לסגור את העור בנקודת הכניסה מחט עם דבק רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הרדמה במקום עכבר בכלוב. אפשר לו להחלים לחלוטין מן ההרדמה ולחכות 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה בפעם השלישית ולמקם אותו על משטח חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר רגל אחת של החיה. מקום אחד מצופה זהב דיקור מחט מתחת לעור בעקב, ואת השני בבסיס הבהונות. אלקטרודות מקבילים בכיוון אחד את השני בניצב לציר הארוך של כף הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ראש מחטים (אלקטרודות) כדי ממריץ החשמל באמצעות מיקרו קליפ מחברים. Electroporate את השרירים על ידי החלת פולסים 20, 20 מילישניות משך / כל אחד, בכל 1Hz. בהתאם המרווח של האלקטרודות, משרעת מתח &quot;פולסים מותאם (על ידי ניטור עם אוסצילוסקופ) להניב שדה חשמלי של הערה ~ 100 V / cm:. התכווצויות לא כתגובה לגירויים יש לשים לב אם רמת הרדמה היא נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה כך, חזור על התהליך המתואר לעיל ברגל הנגדי של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזירים את החיה לכלוב שלה התאושש לחלוטין מן ההרדמה פעם לשמור את זה תחת השגחה. הערה: אם ההליך המשיך כרגיל, החיה צריכה להחזיר ניידות מלאה בתוך 30 דקות ולאחר מכן הוא מוכן להישלח בחזרה לחדר חיה בבית ביבר. זריקות של hyaluronidase ו-DNA לכפות הרגלים אין תופעות לוואי מורגש על בעלי החיים. התאושש לאחר מההרדמה, עכברים מסוגלים בנחת בדרך כלל סביב הכלוב. כאמצעי זהירות נוסף, להוסיף למי השתייה של Carprofen החיה ב 0.0027 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במשך 2 ימים כמשכך כאבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי חלבון יכול להיות assayed 2-8 ימים לאחר transfection. עם זאת, ביטוי מתמשך של חלבונים רבים נצפתה במשך חודשים. </li></ol> הערה: כל הנהלים חיה אושרו על ידי ועדת הקנצלר של UCLA Animal Research כמו המנדט על ידי חוק לרווחת בעלי חיים ומדיניות PHS על טיפול השתמש ההומאנית של חיות מעבדה. נציג תוצאות: יישום נכון של תהליכי vivo electroporation שתוארו לעיל צריך לגרום transfection יעיל של פלסמידים בשרירים FDB ו Io. עם זאת, היעילות של הביטוי של וריאנטים חלבון מהונדס יהיה תלוי פלסמיד, את גודל ואת המורכבות של החלבון, את המאפיינים תפקודית של חלבון, וכן מספר משתנים אחרים מחוץ לשליטתנו. כמו באיור 1 של שריר FDB electroporated בנוכחות קידוד מסחרי (PMR-mCherry) פלסמיד לחלבון mCherry, רוב סיבי השריר הם transfected עם פרוטוקול שלנו כפי שמודגם על ידי העובדה שרובם להציג פלואורסצנטי אדום. זה אינו פוסל את האפשרות כי סיבים בודדים התערוכה דרגות שונות של ביטוי חלבון, או סיבים מעטים אינם transfected בכלל 3. יש בדואר ציין כי ביטוי יעיל של כמויות גדולות של חלבוני ניאון כגון mCherry, EGFP, ECFP ו EYFP, אינו פוגע רגישות סיבי &quot;עירור שרירים, התכווצות נכסים צימוד. למעשה, הם נבדלים אלה השרירים דמה transfected (תוצאות לא מוצג). גישות מעשיות להשתמש כדי לאמת את ביטוי מקומי של חלבונים fluorescently-tagged בתוך סיבי שריר השלד. לוקליזציה תאיים של חלבונים די נובו מהונדס הביע מוערך באופן שגרתי על ידי רכישת סימולטני, באמצעות, TPLSM תמונות הניאון של התגים ותמונות בהתאמה של סמנים היטב לזהות מבנים הסלולר. הטיפוסי ביותר של אלה האחרונים הם:) שנית הרמוני (SHG) דור תמונות, אשר נובעים אנאיזוטרופיה שרירן sarcomeric של להקות (מרוכז ב-M-lines) 9,10 ו, ב) di-8-ANEPPS פלואורסצנטי תמונות, אשר ניתן להשיג על ידי תיוג את פני השטח רוחבי צינורי (T-אבובית) מערכת הממברנות של סיבי השריר עם dye11 זה פוטנציומטרית impermeant. בתמונות הקרינה של סיבי שריר מוכתם di-8-ANEPPS, T-tubules יופיעו להקות הצר של הקרינה בכיוון מאונך כ על ציר זמן של סיבים. להקות אלו רווח שווה זה מזה: הם מופרדים על ידי מרחק רב אשר משתרע על פני ה-M-שורות קצרה כי משתרע על פני 11 Z-line. הביטוי לוקליזציה של α-actinin-EGFP בתוך סיבי שריר השלד. דוגמה לביטוי של גרסה מתויג של חלבון השריר מבניים α-actinin מוצג באיור 2. חלבון זה נקרא להיות מרכיב מרכזי של קו-Z, וככזה, הוא משמש באופן שגרתי כסמן של structure12 זה. אנו transfected השרירים FDB ו IO עם קידוד pEGFPN1-α-actinin1 פלסמיד עבור (שרירים שאינם) אדם α-actinin מתויג בטרמינל C עם EGFP. שישה ימים לאחר transfection, מצאנו כי, כפי שנבחנו על ידי חלוקת הקרינה EGFP, α-actinin מתבטאת בעיקר להקות צר ברווחים שווים לאורך ציר סיבים. להקה אחת לכל sarcomere נתפסת (איורים 2A &amp; 2D). Colocalization של להקות אלה עם ה-Z קווי מודגם על ידי השוואת התפלגות EGFP פלואורסצנציה עם SHG (תרשים 2B) ו di-8-ANEPPS (2E איור) תמונות. כפי שמוצג על ידי התמונה כיסוי (איור 2C), α-actinin-EGFP להקות חלופי עם להקות SHG, המציין כי הם נמצאים באמצע הדרך בין שני M-להקות ברציפות, בד בבד עם המיקום של Z-הקווים. בתוך סיבי השריר transfected מוכתם di-8-ANEPPS, α-actinin-EGFP להקות נראים מרוכז בין כל זוג של T-tubules (תרשים 2F) אשר ידועים האגף קווי Z (כלומר מופרדים על ידי מרחק קצר), וכך המציין כי מהונדס α-actinin מיועד קו-Z. הביטוי של DHPRα1s מתויג בתחנה הסופית-N עם EGFP היעילות של transfection שריר עם pEGFPC1.1 DHPR α-1s מאומת בתמונות TPLSM (למשל איור 3A) מראה כי רוב הסיבים להביע EGFP-DHPRα1s (חלבון הטרנסממברני). התכונה הבולטת ביותר של סיבים transfected הוא דפוס פעמיים חברו של EGFP פלואורסצנטי (איורים 3A &amp; 3B) כפי שניתן היה לצפות, אם זה היה ממוקד חלבון ה-T tubules. זה יכול להיות גם ציין באיור 3 כי בעוד סיבים שונים להציג רמות שונות של עוצמת הקרינה, את דפוס הקרינה התאגדו של סיבים בודדים נראה להישמר הומוגנית לאורך הסיב. בהגדלה גבוהה יותר (איור 3 ב), ניתן לראות בבירור כי ריווח אחיד בין להקות דומה לזה שנצפה סיבים מוכתם di-8-ANEPPS (למשל 2E איור). התמונות כיסוי (איור 3B &amp; 3E) להמחיש כי להקות SHG נמצאים בתוך המרווח הגדול בין EGFP-DHPRα1s להקות, אישרו כי החלבון הזה ב-T-tubules. מדידות נוספות סריג עם אניון לא פלורסנט lipophilic-DPA (מידע לא מוצג) נוספים מראים כי מחצית EGFP בתוך ננומטרים ספורים של העלון הפנימי של קרום של T-tubules. לוקליזציה והערכה תפקודית של הביטוי של EYFP-ClC1 סיבים transfected עם pEYFP-ClC1, המקודד לבנות EYFP-tagged (ב-N טרמינל) של ערוץ כלוריד שרירי השלד (ClC1), להציג EYFP להקות פלואורסצנטי (איור 4A) עם דפוס דומה לזה שנצפה עבור EGFP-DHPRα1s &quot;הביטוי (איור 3A) ו המקביל להסדר T-אבובית כמו מאויר עם מכתים di-8-ANEPPS (2E איור). כצפוי, אימפוזיציה של EYFP-ClC1 (איור 4A) ותמונות SHG (איור 4B) כפי שמוצג כיסוי (איור 4C), ממחישות כי להקות SHG מרוכזים על ריווח גדול of בין להקות EYFP פלואורסצנטי. על מנת להעריך האם הבעת EYFP-ClC1 תוצאות לעלייה משמעותית מוליכות המנוחה של סיבי השריר, כצפוי מ overexpression של תעלות כלוריד פונקציונלי, אנו סיבי השריר enzymatically ניתק מן השריר FDB transfected ולמד תכונות אלקטרו שלהם באמצעות שתי microelectrodes ההתקנה הניסוי שתואר לעיל 6,11,13. איור 5 מציג תוצאות משני סיבים: אחד להביע את כמויות גדולות של EYFP-ClC1 כפי שהוערכו מן העולמי מדידות עוצמת הקרינה מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל (לא מוצג), והשני הוא פקד שאינו transfected. שיא המתח באיור 5A (המתקבל סיבי השריר להביע EYFP-ClC1) מוכיח כי בשל מוליכות המנוחה מוגזם, סיבים הוא כמעט ולא להתרגש. פולסים גירוי מקומי של עד 400nA (0.5ms) צריך לשמש כדי לעורר תגובה פעיל מאוד קטנה (לא, להחטיא את המטרה 5A איור). לאחר החלפת הפתרון Tyrode חיצוני אחד המכיל 500 מיקרומטר של חוסם כלוריד ערוץ 9-ACA, 200 פעימות NA הנוכחית הספיקו כדי לעורר פוטנציאל פעולה (איור 5 ב), אם כי איטי יותר ורחב יותר מאלו שנרשמו סיבים הביקורת ( איור 5 ג). כצפוי, תוספת של 9-ACA הייתה השפעה מינימלית על סיבים שליטה זו (איור 5D). <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /> באיור 1. Transfection היעילות של השיטה ב-vivo electroporation. Brightfield (א) ו פלואורסצנטי (ב &#39;) תמונות של שריר FDB transfected עם mCherry-PMR. ימים לאחר פרוטוקול electroporation: 12 ימים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">לחץ כאן</a> עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הביטוי המיקוד של α-actinin-EGFP בסיבים FDB. פאנלים A ו-B הם פלואורסצנציה EGFP ותמונות SHG, בהתאמה, של סיבי להביע α-actinin-EGFP. לוח C הוא סופרפוזיציה של התמונות ב A ו B. פאנלים D ו-E הם תמונות פלואורסצנציה של סיבים אחרת להביע α-actinin-EGFP ומוכתמת עם di-8-ANEPPS, בהתאמה. לוח F היא סופרפוזיציה של תמונות D ו E. ימים לאחר electroporation פרוטוקול: 6 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הביטוי המיקוד של EGFP-DHPRα1s בסיבים FDB. לוח א &#39;, תמונה EGFP הקרינה של קבוצת סיבים להביע EGFP-DHPRα1s. לוח ב &#39;הוא הגדלה של הריבוע בלוח כדי להראות טוב יותר את הדפוס התאגדו ביטוי החלבון. לוח C הוא דמות SHG המתאימים לדימוי בלוח לוח א D הוא כיסוי של תמונות ו-C פאנל E הוא הגדלה של אזור המצוין ימים פאנל ד לאחר פרוטוקול electroporation: 20 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. הביטוי המיקוד של EYFP-ClC1 בסיבים FDB. לוחות A ו-B הם פלואורסצנציה EYFP ותמונות SHG, בהתאמה, של סיבי להביע EYFP-ClC1. לוח C הוא סופרפוזיציה של התמונות לוחות A ו-B פאנל D הוא פרופיל העוצמה נמדדת לאורך קו לבן מסומן בתמונה בימים פאנל C. לאחר פרוטוקול electroporation: 7 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. סיבים אלקטרו להביע הערכה מהונדס EYFP-ClC1. פאנלים A ו-B הן רשומות מתח מ סיבים להביע EYFP-ClC1 בתגובה פולסים הנוכחית לפני ואחרי הטיפול עם 9-ACA, בהתאמה. לוחות C ו-D רשומות מתח (פוטנציאל פעולה) שהושרו בתגובה פולסים הנוכחית סיבים שאינם transfected לפני ואחרי הטיפול עם 9-ACA, בהתאמה.

<ol><li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li>
<li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li>
<li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+%7Balpha%7D1s+and+%7Bbeta%7D1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li>
<li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li>
<li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li>
<li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li>
<li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins%2C+%7B%7Balpha%7D%7D-actinin-2+and+-3%2C+in+different+species%3A+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li>
<li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

אנו מתארים כאן את הצעדים מפורט כי יש לפעול כדי להשיג transfections יעיל של פלסמידים DNA לתוך סיבי שריר השלד על ידי electroporation ב vivo. היתרונות העיקריים של הגישה שלנו הן את הפשטות של היישום, הפולשנות שלו מינימלית שתוצאתה סיכון בריאותי זניח לבעלי החיים. במציאות, פרוטוקולים מעל electroporation תיאר שאינן כרוכות הרבה יותר מאשר שתי זריקות תת עורית למטר, ואחריו פרוטוקול גירוי חשמלי, כל אלה הם נסבל היטב על ידי בעלי חיים תחת הרדמה. במוסד שלנו מניפולציות אלה נקבעים להיות לגמר...

ה-dna transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות in vivo electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

עניין גובר בביולוגיה של התא היא להביע צורות transgenically שונה של חלבונים חיוניים (למשל בונה מתויג fluorescently ו / או וריאנטים מוטנטיים) על מנת לחקור הפצה אנדוגניים שלהם ואת הרלוונטיות תפקודית. גישה מעניינת כי יושם להגשים מטרה זו בתאים הבדיל באופן מלא הוא<em&gt; In vivo</em&gt; Transfection של פלסמידים על ידי שיטות שונות לתוך רקמות ספציפיות כגון הכבד<sup&gt; 1</sup&gt;, שרירי השלד<sup&gt; 2,3</sup&gt;, וגם את המוח<sup&gt; 4</sup&gt;. אנו מציגים כאן תיאור מפורט של הצעדים שיש אחריו על מנת ביעילות transfect החומר הגנטי לתוך סיבי של<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) ו<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) בשרירים של עכברים מבוגרים באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; גישה electroporation. הפרמטרים ניסיוני מוטבו כדי למקסם את מספר סיבי השריר transfected תוך מזעור הנזק לרקמות שעשוי לפגום באיכות וכמות החלבונים המתבטאת סיבים בודדים. יש לנו אומת כי יישום המתודולוגיה המתוארת במאמר זה תוצאות תשואה גבוהה של חלבונים מסיסים, כלומר EGFP ו ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, וכו &#39;; חלבונים מבניים, כלומר minidystrophin ו α-actinin וכן חלבונים בממברנה, כלומר α1s-DHPR, RyR1, לב Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מחליף, NaV1.4 Na הערוץ, SERCA1 וכו &#39;, כשהם מיושמים FDB, IO ושרירים אחרים של עכברים וחולדות. הביטוי יעיל של כמה חלבונים אלה אומת עם ביוכימיים<sup&gt; 3</sup&gt; ופונקציונלי ראיות<sup&gt; 5</sup&gt;. עם זאת, ספק גישה מאשרות הנפוצים ביותר בשימוש על ידי מאיתנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר (TPLSM), המאפשרים לזהות לא רק את הביטוי הכללי, אלא גם לוקליזציה תאיים מפורט, של החלבון בונה מתויג fluorescently. השיטה יכולה לשמש באותה מידה transfect פלסמידים קידוד לביטוי של חלבונים הרלוונטיות פיזיולוגיים (כפי שמוצג כאן), או התערבות RNA (siRNA) במטרה לדכא את הביטוי של חלבונים הביעו בדרך כלל (לא נבדק על ידינו עדיין). יצוין כי transfection של סיבי שריר FDB ו IO רלוונטי במיוחד עבור חקירת הפיזיולוגיה שריר יונקים מאז סיבי enzymatically ניתק מן השרירים הללו כיום אחד הדגמים הכי מתאים לחקור את המנגנונים הבסיסיים של צימוד עירור רגישות ו-התכווצות תחת מהדק התנאים הנוכחיים או מתח<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

עניין גובר בביולוגיה של התא הוא ביטוי של צורות שעברו שינוי טרנסגני של חלבונים חיוניים (למשל, מבנים המסומנים בפלואורסצנציה ו/או מוטנטים...

ניתן לבצע אלקטרופורציה in vivo כדי להחדיר DNA ופלסמידים ולבטא אותם טרנסגנית בשריר ה-flexor digitorum brevis (FDB) ובשרירים הבין-עצמיים (interosseous או IO) של עכבר בוגר. הפרוצדורה מתחילה בהרדמתו של העכבר. פני השטח הפלנטריים (הסוליה) של אחת הרגליים מוכנים להזרקה ראשונה של היאלורונידז על ידי החדרת המחט בעקב והנחייתה תת-עורית לאורך כף הרגל.לאחר שעה, בעל החיים מורדם שוב והפלסמה מוזרקת לאותו אזור תת-עורי של כף הרגל שבו הוזרקה ההיאלורונידאז. לאחר 10 דקות, מחטי דיקור מצופות זהב מוחדרות לתת-העור כפי שמוצג. פולסי האלקטרופורציה מועברים לאחר חיבור המחטים לסטמולטור, במידת הצורך.ניתן לחזור על הפרוצדורה בכף הרגל הנגדית. לאחר תקופה הנעה בין יומיים לשמונה ימים, בעל החיים נקרב, השרירים מופרדים, והטרנספקציה של החלבון הרצוי מאומתת על ידי תצפית בבלימה (פלואורסצנציה) תחת מיקרוסקופ. שלום, אני מרינו דה-פרנקו מהמעבדה של חוליו ורה במחלקת הפיזיולוגיה בבית הספר לרפואה דייבי גפן ב-UCLA.היום נדגים לכם פרוצדורה לטרנספקציית Inbivo של פלסמיד המבטא חלבון טרנסגני לתוך סיבי שריר של עכברים בוגרים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור ביטוי ולוקליזציה של חלבונים טרנסגניים, וכן את ההשפעה של ביטוי יתר של החלבון על פיזיולוגיית סיבי השריר. אז בואו נתחיל.לפני התחלת פרוטוקולי האלקטרופורציה in vivo, יש להגביר פלסמידי ביטוי של יונקים כדי להגיע לריכוזים בטווח של שני עד חמישה מיקרוגרם של פלסמיד למיקרוליטר של TE buffer. אנו משתמשים באופן שגרתי בערכות הגברה של Qiagen ופועלים לפי הוראות היצרן. אנו ממליצים על פלסמידי ביטוי מסחריים הנושאים את מקדם ה-CMV, לדוגמה, EEG FPC one או EEG FPN one מבית in Vitrogen.מאחר ומקדם זה פועל היטב בשריר שלד, נדגים את הפרוצדורה של חיתוך במודל in vivo. באמצעות P EEG FPN one, הכננו מראש תמיסה המכילה 2 mg/mL hyaluronidase ב-tyro סטרילי. תמיסה זו נשמרת בטמפרטורת החדר עד לשימוש בה להכנת בעלי החיים.לצורך טרנספקציה, אנו משתמשים בתיבת הרדמה המחוברת למכונת הרדמה גזית מאושרת ומרדימים את החיה הרדמה עמוקה באמצעות 4% ISO fluorine בחמצן. לאחר ההרדמה, אנו מורחים משחה כדי להגן על עיני העכבר מיובש במהלך הליכי ההרדמה הבאים. מניחים את החיה על פד חימום המכוון ל-37 degrees Celsius ושומרים על ההרדמה באמצעות מסכת פנים אוראלית.יש לנטר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס צביטה של בהונות הרגל. כאשר בעל החיים נמצא תחת הרדמה עמוקה, השתמש במחט סטרילית בקוטר 33 gauge ובאורך של inch 1 כדי להזריק 10 µL של תמיסת UR ריכוז גבוה מתחת לעור של כרית כף הרגל באחת מרגליו של העכבר. תוך כדי תצפית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), חדר דרך העור בנקודה הקרובה לעקב הרגל והעבר את המחט באופן תת-עורי לכיוון בסיס הבהונות.הזריקו את התמיסה בעדינות לאורך של כרבע אינץ', כדי למנוע בליטה מוגברת של העור. חזרו על הפעולה ברגל השנייה. במידת הצורך, האנזים שהוזרק ירכך את רקמת החיבור המקיפה את סיבי השריר על ידי הידרוליזה של hyaluronic acid, תהליך שיימשך כשעה.פעולה זו תקל על הדיפוזיה של פלסמיד ה-DNA שיוזרק לאחר מכן למרווח הבין-תאי (interstitial space) שבין הסיבים. לאחר הזרקת ההיאלורונידאז, נתק את ההרדמה והנח את העכבר בכלוב. בעל החיים יתאושש מההרדמה תוך שלוש עד ארבע דקות.לאחר שעה, הרדם את בעל החיים פעם שנייה. אסוף 10 µL מתמיסת הפלסמיד והנח טיפה על גבו של כלי הגשה קטן ונקי. שאב את הטיפה באמצעות מזרק ההזרקה והזרק אותה לכרית כף הרגל.בהתאם לאותו הליך שתואר עבור תמיסת ההיאלורונידאז עבור חלבונים גדולים יותר, ניתן להזריק כמויות גדולות יותר של פלזמה. אנו ממליצים שלא להזריק יותר מ-20 microliters כאשר נדרש נפח העולה על 15 microliters. אנו ממליצים להשתמש בדבק לרקמות כדי לסגור את העור בנקודת כניסת המחט, על מנת למנוע סיכון לדליפת DNA דרך נקודת הדקירה.נתק את ההרדמה והנח את העכבר בכלוב. אפשר לו להתאושש לחלוטין מההרדמה והמתן 10 עד 15 דקות כדי להתכונן לאלקטרופורציה. הרדם את בעל החיים כפי שבוצע קודם לכן.בחרו אחת מרגלי בעל החיים והניחו מחט דיקור או אלקטרודה מצופת זהב אחת מתחת לעור באזור העקב, ושנייה בבסיס האצבעות. המחטים מונחות במקביל זו לזו ובניצב לציר האורכי של הרגל. מחטי הדיקור הן בקוטר 160 micrometers ובאורך 13 millimeters.הן נמכרות כשהן עטופות בנפרד וסטריליות. בהתאם למרווחי המחטים, התאימו את אמפליטודת הפולס כדי להעביר פולסי מתח, כך שייווצר שדה חשמלי של כ-100 volts per centimeter.כוון את משך הפולס ל-20 milliseconds ואת התדר ל-one hertz. חבר את ראשי האלקטרודות למעורר החשמלי באמצעות מחברי micro clip. עורר את שרירי כף הרגל על ידי הפעלת 20 פולסים חשמליים.עקבו אחר צורת גל המתח באוסצילוסקופ. לא נצפו התכווצויות משמעותיות בתגובה לגירויים. אם רמת ההרדמה מספקת, ניתן לבצע זאת במידת הצורך בעוד הדגימה תחת הרדמה.חזור על הליך האלקטרופורציה לעיל ברגל השנייה. לאחר האלקטרופורציה, החזר את בעל החיים לכלובו והשגח עליו. עד להתאוששות מלאה מההרדמה, על בעל החיים להחזיר את יכולת התנועה המלאה שלו בתוך חמש דקות. אם לא נרשמו תגובות חריגות וההליך עבר כסדרו, כ precaution נוסף, הוסף למי השתייה של בעל החיים carfin בריכוז 0.027 milligrams per milliliter למשך יומיים.ניתן לבחון את ביטוי החלבון כאנלגזיה יומיים עד שמונה ימים לאחר הטרנספקציה. עם זאת, נצפה ביטוי מתמשך של חלבונים רבים במשך חודשים. ניתן להמחיש בקלות את יעילות הטרנספקציה של שריר FDB שעבר אלקטרופורציה עם הפלסמיד המסחרי P EEG FPN one המקודד לחלבון EGFP, באמצעות אור UV המגיע ממנורת UV ידנית או מדיודות UV בעצימות גבוהה.בבחינת כף רגלו של העכבר תחת מיקרוסקופ דיסקציה, ניתן להבחין שמרבית סיבי השריר עברו טרנספקציה באמצעות הפרוטוקול שלנו, כפי שמעידה העובדה שרובם מראים פלואורסצנציה ירוקה. מיקרוסקופ הדיסקציה מציג את תבנית הטרנספקציה הכללית של השריר. חזרה על תצפית זו.שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיפוסקופית מאפשר הדמיה של דפוס הביטוי של EGFP באגודות של סיבי שריר או אפילו בסיבים בודדים. ניתן להעריך את יעילות הביטוי של חלבון mCherry בסיבי שריר FDB על ידי השוואה בין תמונות שדה בהיר (brightfield) לתמונות פלואורסצנציה של השריר. למטרה זו, ניתן להעריך את הלוקליזציה התוך-תאית של החלבונים הטרנסגניים שהובעו de novo באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר דו-פוטונית.תמונות של חלבונים המסומנים פלואורסצנטית ותמונות של סמנים מזוהים היטב של מבנים תאיים נרכשות בו-זמנית. הנפוצים ביותר מבין הסמנים למבנים תאיים הם תמונות של יצירת הרמוניה שנייה (second harmonic generation או SHG), הנובעות מאניזוטרופיית המיוזין של הסרקומרים. פסי A הממוקמים במרכז קווי M וצבע.תמונות פלואורסצנציה של הנספח, שניתן להשיגן על ידי סימון ממברנות הפנימיות של מערכת הצינוריות הרוחביות או ה-t tubule של סיבי השריר בעזרת צבע פוטנציומטרי אימפריאני בתמונות פלואורסצנציה של סיבי שריר שנצבעו בצבע eight anep. ה-T tubules נראים כפסים צרים של פלואורסצנציה המכוונים בצורה כמעט ניצבת לציר האורכי של הסיב. פסים אלו מרוחקים זה מזה במרווחים לא שווים.הם מופרדים על ידי מרחק רב, המשתרע לאורך קווי ה-M, ומרחק קצר המשתרע לאורך קו ה-Z. דוגמה לביטוי של וריאנט מתויג של חלבון השריר המבני alpha actinin מוצגת כאן. חלבון זה הוא מרכיב עיקרי של קו ה-Z ומשמש באופן שגרתי כסמן למבנה זה.ביצענו טרנספקציה לשרירי ה-FDB וה-IO עם הפלסמיד P-E-G-F-P Fpn one alpha actinin, המקודד עבור alpha actinin אנושי שאינו שרירי, המסומן בקצה ה-C באמצעות EGFP. שישה ימים לאחר הטרנספקציה, מצאנו כי alpha actinin מבוטא בעיקר בפסים צרים במרווחים שווים לאורך ציר הסיב. נצפה פס בודד לכל סרקוםר.הקו-לוקליזציה של פסים אלו עם קווי Z מודגמת על ידי השוואת התפלגות הפלואורסצנציה של EGFP עם תמונות ה-SHG או ה-D eight annex, כפי שמוצג בתמונת השכבות (overlay). פסי Alpha Acton ו-EGFP מתחלפים עם פסי ה-SHG, מה שמעיד על כך שהם ממוקמים באמצע הדרך בין שני פסי M עוקבים, במיקום התואם לקווי Z בסיבי שריר שעברו טרנספקציה ונצבעו ב-d an up. פסי Alpha Actinin EGFP נראים כמרכזיים בין כל זוג T tubules, הידועים כסמוכים לקווי Z. דבר זה מראה כי alpha actinin טרנסגני מכוון לקו Z.הביטוי והמיקום של DHPR alpha one s המסומן ב-EGFP בקצה ה-N מוצגים באיור 3. פלורסצנציית EGFP נראית בעיקר כזוגות של פסים המרווחים בתבנית הדומה לזו של T two Es. הבלטת תמונות SHG ו-E-G-F-P-D-H-P-R Alpha one s מדגימה כי קיימים שני פסי פלורסצנציית EGFP בין כל שני פסי SHG עוקבים, מה שמעיד על כך ש-DHPR alpha one s מונה באופן נכון ל-T two ES D eight; צביעה (לא מוצגת) מספקת הוכחה חלוטה למיקום של DHPR Alpha one S בסיבי Tubule שטרנספקטו עם P-E-Y-F-P CLC one, המקודד למבנה מסומן ב-EYFP בקצה ה-Terminus של תעלת הכלוריד של השריר השלדי CLC one; אלו מראים פסי פלורסצנציית EYFP התואמים לסידור של T tubule כפי שהודגם ב-D eight ובצביעה.כצפוי. סמיכת תמונות ה-EYFP CLC one וה-SG, כפי שמוצג בתמונה המשולבת (overlay), ממחישה כי פסי ה-SHG מרוכזים במרווח הגדול שבין פסי הפלואורסצנציה של EYFP. כדי להעריך האם הביטוי של EYFP CLC one מוביל לעלייה משמעותית במוליכות במצב מנוחה של סיבי השריר, כפי שצפוי כתוצאה מביטוי יתר של תעלות כלוריד תפקודיות, ביצענו פירוק אנזימטי של סיבי שריר משריר FDB שעבר טרנספקציה, ובחנו את תכונותיהם האלקטרופיזיולוגיות באמצעות מערך ניסויי של שתי מיקרו-אלקטרודות.תמונה זו מציגה תוצאות משני סיבים. אחד מבטא כמויות גדולים של EYFP clc, כפי שנמדד באמצעות מדידות עוצמת פלואורסצנציה גלובלית במיקרוסקופ פלואורסצנציה סטנדרטי, והשני הוא ביקורת לא טרנספקטלית.רישום המתח התקבל מסיב שריר המבטא EY FP CLC 1. פולס זרם הגדול מזו הדרושה כדי לעורר סיב ביקורת, מעורר תגובה רגנרטיבית קטנה בלבד בסיב שעבר טרנספקציה כאשר תמיסת ה-tyro החיצונית הוחלפה בתמיסה המכילה 500 micromolar של חוסם תעלות הכלוריד 9-anthracene carboxylic acid או 9-ACA. פולס קטן יותר עורר פוטנציאל פעולה, אם כי איטי ורחב בהרבה מאלו שנרשמו בסיב הביקורת, כפי שצפוי.להוספת nine a CA הייתה השפעה מינימלית על סיב הבקרה. אנו מסיקים כי הסיב המבטא את EY FP CLC one הוא כמעט בלתי עביר (non excitable) בשל מוליכות כלוריד מנוחית מוגברת. הראינו לכם כיצד לבצע טרנספקציה של פלסמיד המבטא חלבון טרנסגני לתוך סיב שריר שלד חי באמצעות אלקטרופורציה, וכן כיצד להעריך את יעילות הטרנספקציה ואת הלוקליזציה והתפקוד של החלבונים שעברו טרנספקציה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מעקב דינמיקה של engraftment שריר בבעלי חיים קטנים על ידי In vivo פלורסנט הדמיה

מודל murine של גירוי חשמלי neuromuscular (NMES), שיטת קליני בטוח ולא יקר, אל השרירים תא הקדמי מתואר. מודל זה יש את היתרון של שינוי התקן קליני זמינים לצורך לעורר התכווצויות שרירים ממוקד וספציפי בעכברים.

דגם Murine של אימון שרירים באמצעות גירוי חשמלי neuromuscular

אמצעי לא פולשני להערכת ההצלחה של השתלה והיצמדות מתואר. השיטה מנצלת את גן כתב היתוך מאוחד המורכבים של גנים אשר ביטוי ניתן הדמיה בשיטות הדמיה שונות. הנה, אנחנו עושים שימוש...

מולקולרית והדמיה ליעד בתאים שריר מושתלים

תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

פרוטוקול זה משתמש באלקטרופורציה כדי להציג ולבטא חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית בסיבי שריר עכברים. לאחר ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה, הסיבים מבודדים. לאחר מכן מדמים סיבים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש את מבנה השרירים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

כאן, אנו מציגים טכניקת in vivo להעברת גנים לתאי שוואן (SCs) בעצב הסיאטי של המכרסם. טכניקה פשוטה זו שימושית לחקירת מנגנוני איתות המעורבים בפיתוח ותחזוקה של SCs מיאלינים.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמידי לתוך שרירי השלד היא שיטה בת קיימא לווסת ביטוי גנים מבלי להתפשר על התכווצות השרירים בעכברים.

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר היא שיטה לחקר תנועות תחום החלבונים בזמן אמת. שינוי טכניקה זו ליישומה בתאים מקומיים מאפשר כעת זיהוי ומעקב אחר תנועות חיישן מתח יחיד מתעלות Ca2+ מגודרות מתח בסיבי שריר שלד מבודדים.

פלואורומטריה פונקציונלית מכוונת אתר בתאים מקומיים לחקר עוררות שרירי השלד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב אלקטרופורציה in vivo וניתוק עצבים של שריר levator auris longus (LAL). הליך זה מאפשר לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים שמקורם בשריר בהתחדשות הסינפסה העצבית-שרירית.

משולב באלקטרופורציה של Vivo ועצבוב מחדש לטווח קצר של שריר השלד של שריר השלד Auris longus

למד שיטת טרנספקציה של DNA פלסמיד לשרירי כף הרגל בעכברים חיים באמצעות אלקטרופורציה. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של ביטוי חלבונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי ומסייעת במחקר תרפיית גנים וביולוגיית שריר.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

גלה סרטונים נוספים