Name: הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-30T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: למדו הכנת lysate משולב טסיות דם אנושי (pHPL) כתוסף לתרביות תאי גזע ללא שימוש בסרום בעלי חיים. השיטה כוללת מחזורי הקפאה-הפשרה וסינון שיירי טסיות לייצור תוסף עשיר בגורמי צמיחה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר האוסטרי (FWF, מענק N211-NAN ל DS) לבין מחקר אוסטרי קידום הסוכנות (FFG, מענק N200 ל DS). המחברים מודים Url קלאודיה לקבלת סיוע טכני מעולה מוניקה פארל לעריכה לשונית.

1. החל החומר התחל עם טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) שהוכן על ידי יחידות cytapheresis או נגזר באפי מעילים. 2. עקרות לבדוק במשך עקרות לבדוק לקחת דגימה של 20 מ&quot;ל של כל יחידה PRP ידי העברת נפח שקית קטנה מחוברת (Baxter). נתק את התיק הזה על ידי ריתוך. 3. הקפאה של יחידות PRP מיד לאחר ההכנה, להקפיא את יחידות PRP עד לפחות -20 ° C בשקית אחסון המקורי ללא מניפולציה נוספת. 4. הפשרת יחידות HPL כאשר בדיקות חיידקים שליליים, להפשיר האנושי יחידות lysate טסיות דם, הנקרא כיום יחידות HPL ב 37 ° C (אמבט מים) עד קרישי קרח להיעלם. אין לחמם את HPL. 5. איגום של יחידות HPL קח לפחות 10-15 יחידות HPL מופשר במשך בשלולית lysate טסיות להכין מוצר סטנדרטי. חבר את שקיות HPL ברציפות לשקית כפולה איגום (MacoPharma) ולהעביר את HPL לתוך שתי שקיות. נתק את שקיות HPL ריק על ידי ריתוך. קבל נפח הסופי של L 3-4 של lysate ונקווה טסיות הדם האנושי (pHPL) על ידי ערבוב את התוכן של שתי שקיות. חבר תיק קטן (Baxter) ולקחת מדגם של 20 מ&quot;ל pHPL לבדיקה סטריליות המוצר ונקווה. נתק את התיק הזה על ידי ריתוך. 6. Portioning של pHPL PHPL פרשת לקבל aliquots מתאים לעיבוד נוסף. חבר בשקיות קטנות (Baxter) לשקית איגום כפול (Macopharma) ולהעביר כמויות של עד 250 מ&quot;ל של שקיות אחסון קטן (Baxter). נתק את שקיות מלאות על ידי ריתוך. 7. Re-הקפאה של aliquots pHPL הגדלת שיעור הפיצול הטסיות וכמות גורמי גדילה שפורסמו על ידי צעד הקפאה / הפשרה נוספת. להקפיא את שקיות קטנות של pHPL במנות שוב לפחות -20 ° C. 8. Re-מפשיר portioning של aliquots pHPL ההפשרה שקיות pHPL ב 37 ° C (אמבט מים). מעבירים את תוכן לתוך צלוחיות 50 מ&quot;ל (פלקונס BD) על ידי חיתוך הצינור של התיק באמצעות מספריים סטרילית לשפוך את pHPL לתוך צלוחיות. בצע פעולה זו על ספסל זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום חיידקי או פטרייתי. 9. הסרת שברי טסיות כמו שברי טסיות נוטים לצבור ועלול לגרום alloimmunization, להסיר אותם מן pHPL. צנטריפוגה צלוחיות pHPL ולכן ב 4000 גרם (15 דקות, 4 ° C). ב פיפטה זרימה למינרית הספסל פלזמה supernatant לתוך צלוחיות אחסון הסופי (פלקונס BD) וזורקים את כדורי טסיות הדם, כדי למנוע שברים בתרבות התא. 10. אחסון של pHPL הקפאת aliquots של 50 בקבוקונים מ&quot;ל pHPL שוב לפחות-20 ° C ולאחסן אותם לשימוש ניסיוני. 11. השימוש pHPL בתרבות התא בתחילה להוסיף הפרין ללא חומר משמר עד בינוני, כדי למנוע היווצרות קריש. הפשרה aliquot pHPL ב 37 ° C ו מוסף התרבות בינוני על ידי תוספת של 8 - 10%. מדיומים MSC-בינונית: השתמש ב 500 מ&quot;ל של-ממ, להוסיף 56 מ&quot;ל של pHPL מופשר (ראה גם התייחסות 1 לפרטים נוספים) ו 2 IU / mL (= 224 μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם (מונע קרישה של המדיום דרך ובהצטברויות פיברינוגן של פלזמה) להגיע הריכוז הסופי של pHPL 10%. בנוסף להוסיף פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100μg/mL) פתרון של 2 מ&quot;מ L-Glutamin (הן סיגמא). סינון בינוני באמצעות מסנן 20 מיקרומטר, גודל הנקבוביות ואקום (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן). ECFC-בינונית: השתמש בקבוק אחד (500 מ&quot;ל) של EBM, מוסיפים את ציטוקינים-aliquots, 56 מ&quot;ל של pHPL, 10 IU / מ&quot;ל ​​(= 1120μl של פתרון המניות) של הפארין, חומר משמר בחינם, פניצילין (100U/mL) / סטרפטומיצין (100 גר &#39;/ מ&quot;ל) פתרון של 2 מ&quot;מ L-Glutamin עד בינוני המסנן הבסיס, עם 20 μl-נקבוביות ואקום גודל המסנן (Millipore). תווית הבקבוק כיאות (תאריך, תוכן). <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: הכנת פלזמה טסיות דם עשיר מתרומת דם כל מבנק הדם המקומית או כל ספקית אחרת שאושרה. לאחר צנטריפוגה לדם ניתן לחלק פלזמה, באפי מעיל כדוריות דם אדומות. ארבע יחידות באפי מעיל, דם O קבוצה אחת קבוצה דם AB פלזמה ניתן ונקווה לפני צנטריפוגה להפריד את הפלזמה העשירה בטסיות. איכות רגילה טסיות עשיר פלזמה יחידה של כ 300 מ&quot;ל יכילו 1x10 9 טסיות לכל מ&quot;ל או 3x10 11 platelets מוחלט. <img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig2.jpg" alt="איור 2" /><img src="/files/ftp_upload/1523/1523fig3.jpg" alt="איור 3" />

<ol><li>Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Platelets and wound healing.</a> Front Biosci. 13, 3532-3548 (2008).</li>
<li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound Repair Regen. 16, 585-601 (2008).</li>
<li>Giacco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin-activated+platelets+induce+proliferation+of+human+skin+fibroblasts+by+stimulating+autocrine+production+of+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Thrombin-activated platelets induce proliferation of human skin fibroblasts by stimulating autocrine production of insulin-like growth factor-1.</a> FASEB J. 20, 2402-2404 (2006).</li>
<li>Kocaoemer, A., Kern, S., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+AB+serum+and+thrombin-activated+platelet-rich+plasma+are+suitable+alternatives+to+fetal+calf+serum+for+the+expansion+of+mesenchymal+stem+cells+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue.</a> Stem Cells. 25, 1270-1278 (2007).</li>
<li>Kakudo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation-promoting+effect+of+platelet-rich+plasma+on+human+adipose-derived+stem+cells+and+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 122, 1352-1360 (2008).</li>
<li>Doucet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysates+promote+mesenchymal+stem+cell+expansion%3A+A+safety+substitute+for+animal+serum+in+cell-based+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: A safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications.</a> J Cell Physiol. 205, 228-236 (2005).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+large-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+unmanipulated+bone+marrow+without+animal+serum+Tissue+Eng+Part%5BTitle%5D)+AND+%22C+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum Tissue Eng Part.</a> C Methods. 14, 185-196 (2008).</li>
<li>Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+and+safe+expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+in+animal+serum-free+medium+for+transplantation+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine.</a> J Cell Physiol. 213, 18-26 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li>
<li>Bernardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+in+vitro+expansion+of+human+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+cell-therapy+approaches%3A+further+insights+in+the+search+for+a+fetal+calf+serum+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute.</a> J Cell Physiol. 211, 121-130 (2007).</li>
<li>Carrancio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mesenchymal+stem+cell+expansion+procedures+by+cell+separation+and+culture+conditions+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Optimization of mesenchymal stem cell expansion procedures by cell separation and culture conditions modification.</a> Exp Hematol. 36, 1014-1021 (2008).</li>
<li>Muller, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+as+a+serum+substitute+for+2D+static+and+3D+perfusion+culture+of+stromal+vascular+fraction+cells+from+human+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate as a serum substitute for 2D static and 3D perfusion culture of stromal vascular fraction cells from human adipose tissue.</a> Tissue Eng Part A. 15, 869-875 (2009).</li>
<li>Anitua, E., Sanchez, M., Orive, G., Andia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+impact+of+the+preparation+rich+in+growth+factors+%28PRGF%29+in+different+medical+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential impact of the preparation rich in growth factors (PRGF) in different medical fields.</a> Biomaterials. 28, 4551-4560 (2007).</li>
<li>Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+and+novel+applications+for+platelet-rich+fibrin+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">New insights into and novel applications for platelet-rich fibrin therapies.</a> Trends Biotechnol. 24, 227-234 (2006).</li>
<li>Martinez-Zapata, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+the+use+of+autologous+plasma+rich+in+platelets+for+tissue+regeneration%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of the use of autologous plasma rich in platelets for tissue regeneration: a systematic review.</a> Transfusion. 49, 44-56 (2009).</li>
<li>Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+levels+in+platelet-rich+plasma+and+correlations+with+donor+age%2C+sex%2C+and+platelet+count%5BTitle%5D)+AND+%22J+Craniomaxillofac+Surg%22%5BJournal%5D)">Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count.</a> J Craniomaxillofac Surg. 30, 97-102 (2002).</li>
<li>Frechette, J. P., Martineau, I. &amp, Gagnon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasmas%3A+growth+factor+content+and+roles+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasmas: growth factor content and roles in wound healing.</a> J Dent Res. 84, 434-439 (2005).</li>
<li>Seghatchian, J., Krailadsiri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet+storage+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The platelet storage lesion.</a> Transfus Med Rev. 11, 130-144 (1997).</li>
<li>Selvaggi, T. A., Walker, R. E., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+antibodies+to+fetal+calf+serum+with+arthus-like+reactions+in+human+immunodeficiency+virus-infected+patients+given+syngeneic+lymphocyte+infusions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of antibodies to fetal calf serum with arthus-like reactions in human immunodeficiency virus-infected patients given syngeneic lymphocyte infusions.</a> Blood. 89, 776-779 (1997).</li>
<li>Tonti, G. A., Mannello, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bone+marrow+to+therapeutic+applications%3A+different+behaviour+and+genetic%2Fepigenetic+stability+during+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+autologous+and+foetal+bovine+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From bone marrow to therapeutic applications: different behaviour and genetic/epigenetic stability during mesenchymal stem cell expansion in autologous and foetal bovine sera.</a> Int J Dev Biol. 52, 1023-1032 (2008).</li>
<li>Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Alternatives+to+Fetal+Bovine+Serum+for+the+Expansion+of+Mesenchymal+Stromal+Cells+from+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Alternatives to Fetal Bovine Serum for the Expansion of Mesenchymal Stromal Cells from Bone Marrow.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
<li>Rohde, E., Schallmoser, K., Bartmann, C., Reinisch, A. GMP-Compliant Propagation of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRohde%2C+E+%22Pharmaceutical+Manufacturing+Handbook%3A+Regulations+and+Quality%22">Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Regulations and Quality</a>. Gad, S. C. , John Wiley and Sons, Inc. 97-115 (2008).</li>
</ol>

באזורים מסוימים טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) ניתן לקבל אצל באפי, מעילים אחרת שהוא תוצר פסולת של ארז ייצור תאים דם אדומים מתרומות דם שנבדקו (איור 1). באופן אופטימלי, PRP משמש מיד להכנת נוספת של pHPL, כמו טסיות מיושן מרכזת את הזמינות של גורמי גדילה עשוי להיות מופחת בשל נגעים אחסון טסיות השפלה 20. מומלץ להמשיך לייצר PRP ידי התאמת טסיות דם O עם קבוצת פלזמה דם AB הקבוצה כדי למנוע השפעות האפשריות של אנטיגנים ו isoagglutinins ABH. עד עכשיו, תרביות תאים השתמשו בעיקר בסרום שור העוב...

<table><tbody><tr><td>שקיות כפולות (2 x 3.5L)</td><td>MacoPharma</td><td>VDL 8000XQ</td><td>מיועד במקור לניקור נוזל בטן (ascites puncture)</td></tr><tr><td>מבחורת פלקון 50 mL</td><td>Falcon BD</td><td>2098</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פלסטיק (Stripettes) 50 mL</td><td>Costar</td><td>4501</td><td></td></tr><tr><td>שקיות פלסמה (600mL)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>R4R2021</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר הלחמה סטרילי לצינורות</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>TSCD-II</td><td></td></tr><tr><td>ציוד הלחמה</td><td>Fresenius Kabi</td><td>Compo Seal</td><td></td></tr><tr><td>בן-מരിയ (Water bath)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים סטריליים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תפסנים (Clamps)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (phpl) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

טסיות דם גורמי גדילה שמקורם הוכחו לעורר התפשטות תאים ביעילות<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 1,2</sup&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt;. השפעה זו דווחה עבור תאים סטרומה mesenchymal (MSCs), fibroblasts ו אנדותל מושבת תאים יוצרי עם טסיות מופעל על ידי תרומבין<sup&gt; 3-5</sup&gt; או lysed על ידי הקפאה / הפשרה מחזורי<sup&gt; 6-14</sup&gt; לפני releasate טסיות מתווסף במדיום תרבית תאים. האפקט trophic של טסיות גורמי גדילה נגזר כבר נוסתה בניסויים מספר הנדסת רקמות וטיפול רגנרטיבית.<sup&gt; 1,15-17</sup&gt; יעילות משתנה נחשב לפחות בחלקה בשל ריכוזי מסתעף פרטני של גורמי גדילה<sup&gt; 18,19</sup&gt; וחוסר הנוכחי של פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת טסיות.<sup&gt; 15,16</sup&gt; פרוטוקול זה מציג תהליך מעשי לייצר מאגר של lysate טסיות הדם האנושי (pHPL) נגזר פלזמה המיוצר באופן שגרתי עשיר בטסיות (PRP) של 40-50 תרומות דם אחת. על ידי הקפאה / הפשרה מחזורים כמה ממברנות טסיות ניזוקים גורמי גדילה משתחררים ביעילות לתוך הפלזמה. לבסוף, שברי טסיות יוסרו על ידי צנטריפוגה כדי למנוע היווצרות מצטבר רב לרוקן אנטיגנים פוטנציאליים. יישום pHPL לתוך תרבות פרוטוקולים סטנדרטיים מהווה כלי מבטיח עבור פיתוח נוסף של הרפוי תא מופצות בבעל חיים חלבון ללא המערכת.

Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

הוכח כי גורמי גדילה ממקור טסיות (Platelet derived growth factors) מעוררים פרוליפרציה של תאים ביעילות in vivo1,2 ו-in vitro. השפעה זו דווחה עבור...

פרוטוקול זה מציג את תהליך ההכנה של מאגר גדול של ליזאט טסיות אנושי, החל מפלזמה עשירה בטסיות. באמצעות ביצוע מחזור אחד של הקפאה והפשרה, הטסיות עוברות ליזיס. לאחר מכן, לפחות 10 יחידות של ליזאט טסיות אנושי נלקחות למאגר אחד של ליזאט טסיות אנושי מאוחד, או PHPL.נפח זה, המהווה כ-three liters, מחולק למנות (aliquots) ומוקפא שוב כדי להסיר שאריות של שברי טסיות. מנות אלו מופשרות, מועברות למבחנות ועוברות סבוב בצנטריפוגה. הנוזל העליון (supernatant) הוא ה-PHPL נקי משברי טסיות, המכיל גורמי גדילה המופקים מטסיות המשמשים לתוספת לתרביות תאים.את משקע שברי הפלטלטים הנותר משליכים. שלום, אני קדינה שארמו מהמעבדה של ד"ר TRO ביחידה למחקר תאי גזע באוניברסיטה הרפואית של Grads. היום נראה לכם פרוצדורה להכנה של מאגר בידודים של פלטלטים אנושיים.נתחיל מפלזמה עשירה בטסיות, נבצע מספר מחזורי הקפאה והפשרה, ולאחר מכן נסנן את שרידי הטסיות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להשיג תוסף מספיק עבור תרביות תאים כחלופה לסרום עגל עוברי. אז בואו נתחיל.פרוטוקול זה מתחיל עם פלזמה עשירה בטבקיות, המכונה PRP. פלזמה זו עשויה להיות מוכנה באמצעות Cy Apheresis או נגזרת מ-Buffy coats. אנשים מחוץ לתחום רפואת העברות הדם צריכים לרכוש PRP מבנק דם מקומי או מספק מורשה אחר.בדקו את סטריליות יחידת ה-PRP על ידי העברה של 20 milliliters מכל יחידה לשקית קטנה מחוברת, וניתוק השקית באמצעות מכשיר ההלחמה. ניתן לשלוח מנה זו למעבדה למיקרוביולוגיה לבדיקת סטריליות מיד לאחר ההכנה. חשוב להקפיא את יחידות ה-PRP לטמפרטורה של לפחות minus 20 degrees בשקית האחסון המקורית.לאחר שהבדיקות הבקטריאליות נמצאו שליליות, ניתן לבצע את השלב הבא. תוך הקפדה שהליזט טסיות אנושי (שכעת יכונה HPL) לא יתחמם יתר על המידה, יש להניח את יחידות ה-HPL באמבט מים של 37 °C עד להמסת קשרי הקרח. יש לבצע ליזיס לטסיות לאחר שלב הקפאה-הפשרה זה, כדי להכין מוצר סטנדרטי עבור כל מאגר ליזט טסיות.אספו 10 עד 15 יחידות של PRP שהופשרו. חברו כל שק HPL עוקב לשק הכפול לאיסוף, ולאחר מכן העבירו את ה-HPL לשני שקים אלו. נתקו את שקי ה-HPL הריקים באמצעות מכשיר הריתוך.ערבבו את תכולת שני השקים כדי להגיע לנפח סופי של שלושה עד ארבעה ליטרים של ליזאט טסיות אנושי מאוגד (pooled human platelet lysate). להלן יכונה PHPL. חברו שק קטן והוציאו דגימה של 20 milliliter של PHPL כדי לבדוק את הסטריליות של המוצר המאוגד.חלקו את דגימות ה-PHPL למנות לצורך עיבוד נוסף על ידי חיבור שקיות קטנות לשקית הכיפוס הכפולה. העבירו נפחים של כ-250 milliliters לשקיות האחסון הקטנות, ולאחר מכן נתקו את השקיות המלאות באמצעות מכשיר הריתוך. כעת בצעו מחזור הקפאה והפשרה נוסף כדי להגביר את קצב פירוק הפלטלטים ואת כמות גורמי הגדילה המשוחררים.בצעו זאת על ידי הקפאת השקיות הקטנות של ה-PHBL המנונות בטמפרטורה של 20- מעלות. לאחר מכן, הפשיר את השקיות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות, בתוך מ spars של זרימה למינרית.השתמשו במספריים סטריליים כדי לחתוך ולפתוח את הפיה של כל שקית, ולאחר מכן שפכו את ה-PHPL למבחנות בנפח 50 milliliter. לעיתים קרובות שברי טסיות נוטים להצטבר, וכן עלולים להוביל לאלו-אימוניזציה. כדי למנוע מצבים אלו, הסירו את השברים מה-PHPL באמצעות סבוב במערך צנטריפוגה ב-4,000 GS למשך 15 דקות בצנטריפוגה מקוררת.בשלב הבא, העבירו באמצעות פיפטה את עליון הפלזמה למבחנות האחסון הסופיות והשליכו את משקעי הפלטלטים כדי למנוע נוכחות של שברים בתרביות התאים שלכם. הקפיאו מנות של 50 milliliter של PHPL פעם נוספת בטמפרטורה של minus 20 degrees עד לשימוש הבא. כעת, לאחר שהופק PHPL דל בשברי פלטלטים, ניתן לנתח את מאפייני הליזט.התפקוד והאיכות של הליזט של טבקיות מאוחד (pooled platelet lysate) נבדקים בתרביתי תאים ומוכחים על ידי גירוי יעיל של פרוליפרציה של תאים, הרחבה של תאי סטרומה מזנכיים או MSCs ושל תאים יוצרי מושבות אנדותליאליות, E CFCs, אשר מצליחה תוך שימוש ב-PHPL דל בשברים של טבקיות. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב שלנו למתכוני המדיום כאן. שני יישומים עבור ליזט טבקיות אנושי מאוחד.בתרבית של תאים סטרומליים מזנכיים מוצגים MSCs מתורם אחד שגודלו עם PHPL או עם PHPL דל בפרגמנטים של טבקיות. כפי שניתן לראות, מופיעה כאן זיהום גבוה יותר של פרגמנטים בהשוואה ל-PHPL דל בפרגמנטים לבדו. פרגמנטים של טבקיות אינם תומכים בצמיחת MSCs באופן מספק.כל שלוש התמונות צולמו לאחר 13 ימים של תרבית. ה-MSCs מתורם שני גודלו במשך תשעה ימים ב-PHPL נטול פרגמנטים של טסיות במקום בפלזמה עשירה בטסיות. שימו לב ש-PRP ללא ליזיס של טסיות אינו תומך באופן מספיק בצמיחת MSCs.אנא עיינו גם בפרוטוקול של JoVE מאת Andreas Reish, המתאר את השימוש ב-PHPL דל פgmentים לבידוד וגידול של MSCs המופקים מדם חבל טבורי אנושי. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין PHPL כדי להחליף באופן מלא את הסרום החייתי בתרביות תאי הגזע שלכם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר פרגמנטים של טסיות לפני הוספת heparin ו-PHPL למצע הגידול שלכם.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

preparation-pooled-human-platelet-lysate-phpl-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים למעבדות לבצע תרבית תאי גזע ניתנת להרחבה בתפוקה גבוהה עם עלות השקעה מינימלית של עבודה, ניסיון וציוד באמצעות רובוט טיפול בנוזלים הניתן לתכנות וצלחות של 96 בארות.  iPSCs שעברו יותר מ-20 פעמים במערכת זו שמרו על פלוריפוטנטיות, קריוטיפים נורמליים והתמיינו לקרדיומיוציטים.

פלייט מדרגי 96-גם בהתבסס iPSC תרבות וייצור באמצעות מערכת רובוטית טיפול נוזל

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

פרוטוקול זה מתאר גישה אוטומטית למחצה כדי לייצר hepatocyte כמו תאים מתאי גזע pluripotent אנושי בתבנית 96 צלחת טוב. תהליך זה הוא מהירה וחסכונית, המאפשר שהייצור של איכות מובטחת אצוות של תאים hepatocyte דמוי למחקר אנושי בסיסי ויישומי.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

פרוטוקול זה מתאר גישה להפקת hepatospheres של תאי גזע האדם בעלי עוצמה באמצעות מערכת התרבות המוגדרת הרכבה עצמית תא. פרוטוקול זה מתוכנת במספר קווי תאים, העלות האפקטיבית ומאפשרת ייצור של כדורי גוף האדם יציבים עבור יישומים ביו-רפואיים.

סרום חינם הפקת מימדים תלת-ממדיים של האדם בתאי גזע חזקים

פרוטוקול זה מציג מכשיר המייצר PRP כדי להגביר את ההתרחבות במבחנה של תאים במערכת תרבית פיברובלסטים אוטולוגית 100%.

ייצור פלזמה אוטולוגית עשירה בטסיות דם להגברת הרחבת פיברובלסטים אנושיים במבחנה

כדי להימנע מהמגבלות הקשורות למעבר אנזימטי או מכני של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) בתרבית על תאי הזנה, ביססנו שיטה מהירה, יעילה, חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לקצירת מושבות hESC או hiPSC המתוחזקות על שכבת תאי הזנה של פיברובלסטים אנושיים של עורלה באמצעות דיס-הדבקה בתיווך EDTA.

העברה מהירה, חסכונית ונטולת אנזימים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על תאי הזנה על ידי דיס-היצמדות בתיווך חומצה אתילאנדיאנטית

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של כלי דם המארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטים. רשתות כלי דם אלה מציגות רשת אנדותל נרחבת ומחוברת המוקפת בפריציטים, אקטין שריר חלק וקרום מרתף רציף.

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

מוצרים קסנוגניים (כימיים או מן החי) שהוכנסו בשלבי ההכנה/מניפולציה של הטיפול התא קשורים לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית ולהעברה פתוגנית בחולים מארחים. כאן מתוארת שיטה שלמה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי.

בידוד ותרבית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי בשיטה חדשנית נטולת קסנוגניות לטיפול בבני אדם

ההתקדמות הטכנית האחרונה אפשרה ייצור בקנה מידה גדול של פלטפורמת מבחנה עבור מטבוליזם של תרופות ויישומי רעילות. מערכת כבד דו-ממדית + אנושית (TV2D+) מספקת תוצאות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית באמצעות שיטות תרבית דו-ממדיות מסורתיות. פרוטוקול זה יתמוך במשתמשי קצה בהגדרה, תחזוקה ויישום של המערכת.

מערכת כל-אנושית של תרביות כבד ליישומים לפיתוח תרופות

למדו הכנת lysate משולב טסיות דם אנושי (pHPL) כתוסף לתרביות תאי גזע ללא שימוש בסרום בעלי חיים. השיטה כוללת מחזורי הקפאה-הפשרה וסינון שיירי טסיות לייצור תוסף עשיר בגורמי צמיחה.

הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע

גלה סרטונים נוספים