הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע
30 באוקטובר 2009
Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.
פרוטוקול זה מציג את תהליך ההכנה של מאגר גדול של ליזט טבקיות אנושי, החל מפלזמה עשירה בטבקיות. באמצעות ביצוע מחזור אחד של הקפאה והפשרה, הטבקיות עוברות ליזה. לאחר מכן, לפחות 10 יחידות של ליזט טבקיות אנושי מאוחדות למנה אחת של ליזט טבקיות אנושי מאוחד, או PHPL.
נפח זה, של כ-three liters, מחולק להמשך למנות (aliquots) ומוקפא שוב כדי להסיר שרירי טסיות. מנות אלו מופשרות, מועברות למבחנות ועוברות סנטריפוגציה. הנוזל העליון (supernatant) הוא PHPL נקי משרירי טסיות, המכיל גורמי גדילה המופקים מטסיות המשמשים להעשרת תרביות תאים.
את משקע שברי הפלטלטים הנותר משליכים. שלום, אני קדינה שארמו מהמעבדה של ד"ר TRO ביחידה למחקר תאי גזע באוניברסיטה הרפואית של Grads. היום נראה לכם הליך להכנת מאגר של בידודים של פלטלטים אנושיים.
נתחיל עם פלזמה עשירה בטסיות, נבצע מספר מחזורי הקפאה והפשרה, ולאחר מכן נסנן את שרידי הטסיות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להשיג תוסף מספיק עבור תרביות תאים כחלופה לסרום עגל עוברי. אם כן, בואו נתחיל.
פרוטוקול זה מתחיל עם פלזמה עשירה בטסיות, המכונה PRP. פלזמה זו עשויה להיות מוכנה באמצעות Cy Apheresis או נגזרת מ-Buffy coats. אנשים מחוץ לתחום רפואת העירויים צריכים לרכוש PRP מבנק דם מקומי או מספק מורשה אחר.
בדוק את סטריליות יחידת ה-PRP על ידי העברה של 20 milliliters מכל יחידה לשקית קטנה מחוברת, ונתק את השקית באמצעות מכשיר הריתוך. ניתן לשלוח מנה זו למעבדה למיקרוביולוגיה לבדיקת סטריליות מיד לאחר ההכנה. חשוב להקפיא את יחידות ה-PRP לטמפרטורה של לפחות minus 20 degrees בשקית האחסון המקורית.
לאחר שהבדיקות הבקטריאליות שליליות, ניתן לבצע את השלב הבא. תוך הקפדה שהליזאט של טסיות דם אנושיות, אשר ייקרא כעת HPL, לא יתחמם יתר על המידה, יש להניח את יחידות ה-HPL באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C עד להיעלמות קשרי הקרח. יש לבצע ליזה לטסיות לאחר שלב הקפאה-הפשרה זה כדי להכין מוצר סטנדרטי עבור כל מאגר של ליזאט טסיות.
אספו 10 עד 15 יחידות PRP שהופשרו. חברו כל שק HPL עוקב לשק הכפול לאיסוף, ולאחר מכן העבירו את ה-HPL לשני השקים הללו. נתקו את שקי ה-HPL הריקים באמצעות מכשיר הריתוך (welder).
ערבבו את תכולת שני השקים כדי להגיע לנפח סופי של שלושה עד ארבעה ליטרים של תמצית טסיות דם אנושיות מאוגדות. כעת היא תיקרא PHPL. חברו שק קטן והוציאו דגימה של 20 milliliter של PHPL כדי לבדוק את סטריליות המוצר המאוגד.
חלקו את דגימות ה-PHPL לאליקוטים להמשך עיבוד על ידי חיבור שקיות קטנות לשקית הכפולה של האיסוף. העבירו נפחים של כ-250 milliliters לשקיות האחסון הקטנות, ולאחר מכן נתקו את השקיות המלאות באמצעות המלחם. כעת בצעו מחזור הקפאה-הפשרה נוסף כדי להגביר את קצב הפרגמנטציה של הפלטלטים ואת כמות גורמי הגדילה ששוחררו.
בצעו זאת על ידי הקפאת השקיות הקטנות של PHBL המנוחות במינוס 20 מעלות. לאחר מכן, הפשיר את השקיות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות, בתוך מCב זרימה למינרית.
השתמשו במספריים סטריליים כדי לחתוך ולפתוח את הפתח של כל שקית, ולאחר מכן שפכו את ה-PHPL לתוך מבחנות בנפח 50 מיליליטר. לעיתים קרובות שברי טסיות נוטים להצטבר, וטסיות עשויות אף להוביל לאלו-אימוניזציה. כדי למנוע מצבים אלה, הסירו את השברים מה-PHPL באמצעות צנטריפוגציה ב-4,000 GS למשך 15 דקות בצנטריפוגה מקוררת.
בשלב הבא, העבירו בעזרת פיפט את עליון הפלסמה למבחנות האחסון הסופיות והשליכו את משקעי הפלטלטים כדי למנוע נוכחות של שברים בתרביות התאים. הקפיאו מנות של 50 milliliters של PHPL שוב בטמפרטורה של minus 20 degrees עד לשימוש הבא. כעת, לאחר שהופק PHPL דל בשברי פלטלטים, ניתן לנתח את מאפייני הליזאט.
התפקוד והאיכות של הליזט של טבקיות מאוחד (pooled platelet lysate) נבדקו בתרביתי תאים והוכשרו על ידי גירוי יעיל של proliferace של תאים, הרחבה של תאי סטרומה מזנכימליים (mesenchymal stromal cells או MSCs) ושל תאים יוצרי מושבות אנדותליאליות (endothelial colony forming cells, E CFCs) באופן מוצלח תוך שימוש ב-PHPL מרוקן משברי טבקיות. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב שלנו למתכוני המצע כאן. שני יישומים עבור ליזט טבקיות אנושי מאוחד.
בתרביות של תאי סטרומה מזנכימליים מוצגים MSCs מתורם אחד שגודלו עם PHPL או עם PHPL מנוקה משברים של טסיות דם. כפי שצוין, נראה כאן זיהום גבוה יותר של שברים בהשוואה ל-PHPL מנוקה משברים לבדו. שברים של טסיות דם אינם תומכים באופן מספיק בצמיחת MSCs.
כל שלוש התמונות צולמו לאחר 13 ימי תרבית. ה-MSCs מתורם שני תורבדו במשך תשעה ימים ב-PHPL מדול טעמי טסיות במקום בפלסמה עשירה בטסיות. שימו לב ש-PRP ללא ליזיס של טסיות אינו תומך באופן מספיק בצמיחת MSCs.
אנא עיינו גם בפרוטוקול של JoVE מאת Andreas Reish, המתאר את השימוש ב-PHPL דל בפרגמנטים לבידוד וגידול של MSCs המופקים מדם חבל טבורי אנושי. כעת הצגנו בפניכם כיצד להכין PHPL כדי להחליף באופן מלא סרומים מהחי בתרביות התאי הגזע שלכם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר פרגמנטים של טסיות דם לפני הוספת heparin ו-PHPL למצע הגידול שלכם.
זהו הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את תהליך ההכנה של ליזאט טסיות אנושי (HPL) מתוך פלסמה עשירה בטסיות (PRP). התהליך כולל מחזורי הקפאה והפשרה כדי ללוות את הטסיות ולהפיק ליזאט דל בשיירי טסיות ועשיר בגורמי גדילה לתוספת בתרביות תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית תאים
- ביולוגיה של טסיות דם
- מחקר על גורמי גדילה
רקע
- ליזאט טסיות אנושי הוא תוסף רב-עוצמה לתרבית תאים.
- הוא מכיל גורמי גדילה שונים החיוניים לשגשוג ולהבחנה של תאים.
- תהליך ההכנה הוא קריטי להבטחת האיכות והיעילות של הליזאט.
- פלזמה עשירה בטסיות משמשת כחומר המוצא להכנת HPL.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט להכנת ליזט טסיות אנושי (human platelet lysate).
- הבטחת סילוק של שברי טסיות לקבלת ליזט נקי יותר.
- הסלה של השימוש ב-HPL במגוון יישומים של תרביות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התחלה מפלזמה עשירה בטבחים (PRP).
- ביצוע מחזורי הקפאה-הפשרה להlyse של הטבחים.
- הכנת ליזאט של טבחים אנושיים מאוחד (PHPL).
- סנטריפוגציה להסרת שברי טבחים מהעלייה.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של מאגר גדול של ליסאט טבקיות אנושי.
- סלקת שברי טבקיות שהושגה באמצעות סנטריפוגציה.
- תפוקה של כשלשה ליטרים של גורמי גדילה המופקים מטבקיות.
- הכנה המתאימה להעשרה של תרביות תאים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה להכנת ליסאט טבקיות אנושי.
- HPL יכול לשפר משמעותית את תוצאות תרביות תאים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבחון את היישומים של HPL בתחומי מחקר שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מערכות תרבית נטולות סרום מבעלי חיים הן קריטיות לקידום טיפולים בתאי גזע לעבר יישום קליני ועמידה בדרישות רגולטוריות. פרוטוקול זה מאפשר ייצור בר-הרחבה של ליסאט טבקיות אנושי (pHPL) כתוסף מוגדר ונטול תאים זרים (xeno-free), התומך בשגשוג של תאי סטרומה מזכימזליים ובהתרבות של תאים יוצרי מושבות אנדותליאליות. באמצעות סטנדרטיזציה של ליסיס הטבקיות והסרת שברים, הפרוטוקול מפחית שונות בין מנות ומשפר את השחזוריות בתהליכי גילוי מוקדמים ובמסלולי עבודה פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מספק תוסף מוגדר ממקור אנושי התומך במחקרים מכניסטיים של מסלולי שגשוג והבחנה של תאי גזע.
- ערך תפעולי: מאפשר תנאי תרבית עקביים בין ניסויים, ובכך מפחית שונות במבחני תיקוף של מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק מצע סטנדרטי עשיר בגורמי גדילה התומך בקבלת תוצאות אמינות במבחני תפקוד של תאי גזע.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ליזאט דל בפרגמנטים, ובכך מצמצם הפרעות מצמתים של טסיות במישורי סריקה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: תומך בהרחבת תאי גזע רלוונטיים למחלה בתנאים נטולי רכיבים זרים (xeno-free), בהתאם לדרישות של סממנים ביולוגיים תרגומיים ומודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור בר-התרחבות ממקורות תורמים מאוחדים, ובכך תומך בהעברת טכנולוגיה ובפיתוח תהליכים התואמים לתקני GMP.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי באמצעות אספקת תוסף נטול סרום לתרבית תאי גזע, החל משלב תיקוף המטרה המוקדם ועד להרחבה פרה-קלינית, ובכך היא תומכת בזיהוי המולקולה המובילה ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות בנוגע לשכפול והתמיינות של תאי גזע על ידי אספקת מיקרו-סביבה עקבית ומוגדרת.
- סריקה: מאפשרת בדיקה הדירה של תרכובות או תנאים במערכי בדיקה מבוססי תאי גזע, באמצעות ליזט סטנדרטי ומדלדל פגמנטים.
- אנליטיקה: מניבה פלטים כמותיים, כגון שיעורי שכפול תאים ויעילות של יחידות יוצרות מושבות, ובכך מאפשרת ניתוח השוואתי בין תנאי תרביות שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי תמיכה בהרחבה של תאי סטרומה מזנכימליים ותאי מקור אנדותליים תחת תנאים רלוונטיים קלינית וללא רכיבים מבעלי חיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך הדיר וניתן להרחבה לייצור תוסף בדרגה קלינית מפלזמה עשירה בטסיות ממקור שגרתי, ובכך מפחיתה את התלות בסרומים משתנים מבעלי חיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתוצאות של תרביות תאי גזע על ידי סילוק רכיבים לא מוגדרים של סרום בעלי חיים והסדרה של אספקת גורמי גדילה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות עיבוד תורמים מאוחדים ושלבי הקפאה-הפשרה וסנטריפוגציה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון הביולוגי בפיתוח טיפולים תאיים על ידי אספקת חלופה ממקור אנושי, נטולת רכיבי בעלי חיים (xeno-free), לסרום עגל עובי.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי מתן אפשרות ליצירת נתונים פרה-קליניים עקביים במערכות תרבית מוגדרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות סטריליות של תרביות תאים, טיפול בטבקיות ובפרוטוקולי צנטריפוגציה.
- תלוי בגישה לפלזמה עשירה בטבקיות (PRP) מבנקי דם מורשים או משירותי עירוי, ובציוד הלחמה או איטום סטרילי למניפולציה של שקיות.
- מחייב ביצוע בדיקות סטריליות סטנדרטיות ל-PRP המוכנס ולליזט המאוחד לפני ואחרי העיבוד, כדי להבטיח את בטיחות התרבית.
- דורש התאמה של פרוטוקולי התרבית כדי להתחשב בריכוזי גורמי גדילה הספציפיים לכל מנה, למרות אסטרטגיית האיחוד.
- מוגבל בשל הצורך במספר מחזורי הקפאה-הפשרה ובשלבי צנטריפוגציה, המגדילים את זמן העיבוד ומחייבים ציוד ייעודי.
