הכנת lysate משולב טסיות דם האדם (pHPL) כתוסף יעיל עבור בעלי חיים סרום ללא בתרביות תאים האדם גזע
30 באוקטובר 2009
Lysate טסיות הדם האנושי הוא מקור עשיר של גורמי גדילה תוסף חזק בתרבות התא. פרוטוקול זה מציג את תהליך הכנת מאגר גדול של lysate הטסיות על ידי אנוש החל פלזמה עשירה בטסיות, ביצוע מספר להקפיא להפשיר מחזורים depleting שברי הטסיות.
פרוטוקול זה מציג את תהליך ההכנה של מאגר גדול של ליזאט טסיות אנושי, החל מפלזמה עשירה בטסיות. באמצעות ביצוע מחזור אחד של הקפאה והפשרה, הטסיות עוברות ליזיס. לאחר מכן, לפחות 10 יחידות של ליזאט טסיות אנושי נלקחות למאגר אחד של ליזאט טסיות אנושי מאוחד, או PHPL.
נפח זה, המהווה כ-three liters, מחולק למנות (aliquots) ומוקפא שוב כדי להסיר שאריות של שברי טסיות. מנות אלו מופשרות, מועברות למבחנות ועוברות סבוב בצנטריפוגה. הנוזל העליון (supernatant) הוא ה-PHPL נקי משברי טסיות, המכיל גורמי גדילה המופקים מטסיות המשמשים לתוספת לתרביות תאים.
את משקע שברי הפלטלטים הנותר משליכים. שלום, אני קדינה שארמו מהמעבדה של ד"ר TRO ביחידה למחקר תאי גזע באוניברסיטה הרפואית של Grads. היום נראה לכם פרוצדורה להכנה של מאגר בידודים של פלטלטים אנושיים.
נתחיל מפלזמה עשירה בטסיות, נבצע מספר מחזורי הקפאה והפשרה, ולאחר מכן נסנן את שרידי הטסיות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להשיג תוסף מספיק עבור תרביות תאים כחלופה לסרום עגל עוברי. אז בואו נתחיל.
פרוטוקול זה מתחיל עם פלזמה עשירה בטבקיות, המכונה PRP. פלזמה זו עשויה להיות מוכנה באמצעות Cy Apheresis או נגזרת מ-Buffy coats. אנשים מחוץ לתחום רפואת העברות הדם צריכים לרכוש PRP מבנק דם מקומי או מספק מורשה אחר.
בדקו את סטריליות יחידת ה-PRP על ידי העברה של 20 milliliters מכל יחידה לשקית קטנה מחוברת, וניתוק השקית באמצעות מכשיר ההלחמה. ניתן לשלוח מנה זו למעבדה למיקרוביולוגיה לבדיקת סטריליות מיד לאחר ההכנה. חשוב להקפיא את יחידות ה-PRP לטמפרטורה של לפחות minus 20 degrees בשקית האחסון המקורית.
לאחר שהבדיקות הבקטריאליות נמצאו שליליות, ניתן לבצע את השלב הבא. תוך הקפדה שהליזט טסיות אנושי (שכעת יכונה HPL) לא יתחמם יתר על המידה, יש להניח את יחידות ה-HPL באמבט מים של 37 °C עד להמסת קשרי הקרח. יש לבצע ליזיס לטסיות לאחר שלב הקפאה-הפשרה זה, כדי להכין מוצר סטנדרטי עבור כל מאגר ליזט טסיות.
אספו 10 עד 15 יחידות של PRP שהופשרו. חברו כל שק HPL עוקב לשק הכפול לאיסוף, ולאחר מכן העבירו את ה-HPL לשני שקים אלו. נתקו את שקי ה-HPL הריקים באמצעות מכשיר הריתוך.
ערבבו את תכולת שני השקים כדי להגיע לנפח סופי של שלושה עד ארבעה ליטרים של ליזאט טסיות אנושי מאוגד (pooled human platelet lysate). להלן יכונה PHPL. חברו שק קטן והוציאו דגימה של 20 milliliter של PHPL כדי לבדוק את הסטריליות של המוצר המאוגד.
חלקו את דגימות ה-PHPL למנות לצורך עיבוד נוסף על ידי חיבור שקיות קטנות לשקית הכיפוס הכפולה. העבירו נפחים של כ-250 milliliters לשקיות האחסון הקטנות, ולאחר מכן נתקו את השקיות המלאות באמצעות מכשיר הריתוך. כעת בצעו מחזור הקפאה והפשרה נוסף כדי להגביר את קצב פירוק הפלטלטים ואת כמות גורמי הגדילה המשוחררים.
בצעו זאת על ידי הקפאת השקיות הקטנות של ה-PHBL המנונות בטמפרטורה של 20- מעלות. לאחר מכן, הפשיר את השקיות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות, בתוך מ spars של זרימה למינרית.
השתמשו במספריים סטריליים כדי לחתוך ולפתוח את הפיה של כל שקית, ולאחר מכן שפכו את ה-PHPL למבחנות בנפח 50 milliliter. לעיתים קרובות שברי טסיות נוטים להצטבר, וכן עלולים להוביל לאלו-אימוניזציה. כדי למנוע מצבים אלו, הסירו את השברים מה-PHPL באמצעות סבוב במערך צנטריפוגה ב-4,000 GS למשך 15 דקות בצנטריפוגה מקוררת.
בשלב הבא, העבירו באמצעות פיפטה את עליון הפלזמה למבחנות האחסון הסופיות והשליכו את משקעי הפלטלטים כדי למנוע נוכחות של שברים בתרביות התאים שלכם. הקפיאו מנות של 50 milliliter של PHPL פעם נוספת בטמפרטורה של minus 20 degrees עד לשימוש הבא. כעת, לאחר שהופק PHPL דל בשברי פלטלטים, ניתן לנתח את מאפייני הליזט.
התפקוד והאיכות של הליזט של טבקיות מאוחד (pooled platelet lysate) נבדקים בתרביתי תאים ומוכחים על ידי גירוי יעיל של פרוליפרציה של תאים, הרחבה של תאי סטרומה מזנכיים או MSCs ושל תאים יוצרי מושבות אנדותליאליות, E CFCs, אשר מצליחה תוך שימוש ב-PHPL דל בשברים של טבקיות. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב שלנו למתכוני המדיום כאן. שני יישומים עבור ליזט טבקיות אנושי מאוחד.
בתרבית של תאים סטרומליים מזנכיים מוצגים MSCs מתורם אחד שגודלו עם PHPL או עם PHPL דל בפרגמנטים של טבקיות. כפי שניתן לראות, מופיעה כאן זיהום גבוה יותר של פרגמנטים בהשוואה ל-PHPL דל בפרגמנטים לבדו. פרגמנטים של טבקיות אינם תומכים בצמיחת MSCs באופן מספק.
כל שלוש התמונות צולמו לאחר 13 ימים של תרבית. ה-MSCs מתורם שני גודלו במשך תשעה ימים ב-PHPL נטול פרגמנטים של טסיות במקום בפלזמה עשירה בטסיות. שימו לב ש-PRP ללא ליזיס של טסיות אינו תומך באופן מספיק בצמיחת MSCs.
אנא עיינו גם בפרוטוקול של JoVE מאת Andreas Reish, המתאר את השימוש ב-PHPL דל פgmentים לבידוד וגידול של MSCs המופקים מדם חבל טבורי אנושי. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין PHPL כדי להחליף באופן מלא את הסרום החייתי בתרביות תאי הגזע שלכם. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר פרגמנטים של טסיות לפני הוספת heparin ו-PHPL למצע הגידול שלכם.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את תהליך ההכנה של ליזאט טסיות אנושי (HPL) מתוך פלסמה עשירה בטסיות (PRP). התהליך כולל מחזורי הקפאה והפשרה כדי ללוות את הטסיות ולהפיק ליזאט דל בשיירי טסיות ועשיר בגורמי גדילה לתוספת בתרביות תאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית תאים
- ביולוגיה של טסיות דם
- מחקר על גורמי גדילה
רקע
- ליזאט טסיות אנושי הוא תוסף רב-עוצמה לתרבית תאים.
- הוא מכיל גורמי גדילה שונים החיוניים לשגשוג ולהבחנה של תאים.
- תהליך ההכנה הוא קריטי להבטחת האיכות והיעילות של הליזאט.
- פלזמה עשירה בטסיות משמשת כחומר המוצא להכנת HPL.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט להכנת ליזט טסיות אנושי (human platelet lysate).
- הבטחת סילוק של שברי טסיות לקבלת ליזט נקי יותר.
- הסלה של השימוש ב-HPL במגוון יישומים של תרביות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התחלה מפלזמה עשירה בטבחים (PRP).
- ביצוע מחזורי הקפאה-הפשרה להlyse של הטבחים.
- הכנת ליזאט של טבחים אנושיים מאוחד (PHPL).
- סנטריפוגציה להסרת שברי טבחים מהעלייה.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של מאגר גדול של ליסאט טבקיות אנושי.
- סלקת שברי טבקיות שהושגה באמצעות סנטריפוגציה.
- תפוקה של כשלשה ליטרים של גורמי גדילה המופקים מטבקיות.
- הכנה המתאימה להעשרה של תרביות תאים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה להכנת ליסאט טבקיות אנושי.
- HPL יכול לשפר משמעותית את תוצאות תרביות תאים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבחון את היישומים של HPL בתחומי מחקר שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מערכות תרבית נטולות סרום מבעלי חיים הן קריטיות לקידום טיפולים בתאי גזע לעבר יישום קליני ועמידה בדרישות רגולטוריות. פרוטוקול זה מאפשר ייצור בר-הרחבה של ליסאט טבקיות אנושי (pHPL) כתוסף מוגדר ונטול תאים זרים (xeno-free), התומך בשגשוג של תאי סטרומה מזכימזליים ובהתרבות של תאים יוצרי מושבות אנדותליאליות. באמצעות סטנדרטיזציה של ליסיס הטבקיות והסרת שברים, הפרוטוקול מפחית שונות בין מנות ומשפר את השחזוריות בתהליכי גילוי מוקדמים ובמסלולי עבודה פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מספק תוסף מוגדר ממקור אנושי התומך במחקרים מכניסטיים של מסלולי שגשוג והבחנה של תאי גזע.
- ערך תפעולי: מאפשר תנאי תרבית עקביים בין ניסויים, ובכך מפחית שונות במבחני תיקוף של מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק מצע סטנדרטי עשיר בגורמי גדילה התומך בקבלת תוצאות אמינות במבחני תפקוד של תאי גזע.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ליזאט דל בפרגמנטים, ובכך מצמצם הפרעות מצמתים של טסיות במישורי סריקה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: תומך בהרחבת תאי גזע רלוונטיים למחלה בתנאים נטולי רכיבים זרים (xeno-free), בהתאם לדרישות של סממנים ביולוגיים תרגומיים ומודלים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר ייצור בר-התרחבות ממקורות תורמים מאוחדים, ובכך תומך בהעברת טכנולוגיה ובפיתוח תהליכים התואמים לתקני GMP.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי באמצעות אספקת תוסף נטול סרום לתרבית תאי גזע, החל משלב תיקוף המטרה המוקדם ועד להרחבה פרה-קלינית, ובכך היא תומכת בזיהוי המולקולה המובילה ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות בנוגע לשכפול והתמיינות של תאי גזע על ידי אספקת מיקרו-סביבה עקבית ומוגדרת.
- סריקה: מאפשרת בדיקה הדירה של תרכובות או תנאים במערכי בדיקה מבוססי תאי גזע, באמצעות ליזט סטנדרטי ומדלדל פגמנטים.
- אנליטיקה: מניבה פלטים כמותיים, כגון שיעורי שכפול תאים ויעילות של יחידות יוצרות מושבות, ובכך מאפשרת ניתוח השוואתי בין תנאי תרביות שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי תמיכה בהרחבה של תאי סטרומה מזנכימליים ותאי מקור אנדותליים תחת תנאים רלוונטיים קלינית וללא רכיבים מבעלי חיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך הדיר וניתן להרחבה לייצור תוסף בדרגה קלינית מפלזמה עשירה בטסיות ממקור שגרתי, ובכך מפחיתה את התלות בסרומים משתנים מבעלי חיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתוצאות של תרביות תאי גזע על ידי סילוק רכיבים לא מוגדרים של סרום בעלי חיים והסדרה של אספקת גורמי גדילה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות עיבוד תורמים מאוחדים ושלבי הקפאה-הפשרה וסנטריפוגציה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון הביולוגי בפיתוח טיפולים תאיים על ידי אספקת חלופה ממקור אנושי, נטולת רכיבי בעלי חיים (xeno-free), לסרום עגל עובי.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי מתן אפשרות ליצירת נתונים פרה-קליניים עקביים במערכות תרבית מוגדרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות סטריליות של תרביות תאים, טיפול בטבקיות ובפרוטוקולי צנטריפוגציה.
- תלוי בגישה לפלזמה עשירה בטבקיות (PRP) מבנקי דם מורשים או משירותי עירוי, ובציוד הלחמה או איטום סטרילי למניפולציה של שקיות.
- מחייב ביצוע בדיקות סטריליות סטנדרטיות ל-PRP המוכנס ולליזט המאוחד לפני ואחרי העיבוד, כדי להבטיח את בטיחות התרבית.
- דורש התאמה של פרוטוקולי התרבית כדי להתחשב בריכוזי גורמי גדילה הספציפיים לכל מנה, למרות אסטרטגיית האיחוד.
- מוגבל בשל הצורך במספר מחזורי הקפאה-הפשרה ובשלבי צנטריפוגציה, המגדילים את זמן העיבוד ומחייבים ציוד ייעודי.
