בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

חבל הטבור האנושי הוא מקור נגיש לתאי אב. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והרחבה לאחר מכן של אבות אנדותל e CFCs, תת-אוכלוסייה של תאים בתוך דופן כלי הדם ותאי אב מזנכימליים. MSCs שמקורם בחבל טבור אנושי יחיד.

תחילה באמצעות מספריים לאורך, חתכו לאורך וריד הטבור האנושי וגירדו את התאים משטח הכלי הפנימי. העבירו את התאים מהמגרד לבקבוק והמתינו לצמיחת המושבה. חלק מהתאים המגורדים יציגו פנוטיפ אב ויתרבו בכבדות ליצירת מושבות גדולות.

לאחר שהתאים האלה התרבו, ניתן להרחיב את ה-e CFCs בצלוחיות חדשות. לצורך ניתוח נוסף, ניתן לבודד אוכלוסיית תאים מזנכימליים גם מחבל הטבור האנושי. חותכים חלקים מהחוט לחתיכות קטנות ומעבירים אותם לצלחת תרבות סטרילית.

לאחר מספר ימים, צמיחת תאי הסטרומה תהיה גלויה סביב חלקי רקמת החבל הבין-וסקולרית. העבירו תאים אלה לצלוחיות חדשות והרחיבו אותם להמשך ניתוח. פרוטוקול זה מאפשר לך להשיג שני סוגים של שושלות של תאי אב מחוט חומר התחלתי יחיד תוך שלושה עד ארבעה שבועות.

היי, אני אנדראס דניש מהמעבדה של ד"ר טי סטרונג ביחידה לחקר תאי גזע באוניברסיטה הרפואית של גראדס באוסטריה. היום נראה לכם נוהל לבידוד, הרחבה וניתוח של תאי תעלות מזנכימליות ואנדותל אנושיות מקוד טבורי אחד. רק הערה אחת לגבי הטרמינולוגיה.

התאים שלנו נקראים תאי סטרומה רב-פוטנטיים, מזנכימליים, או MSEs ותאי מעי גס אנדותליים היוצרים תאי פרו או e CSCs. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור תפקוד וביולוגיה של תאי אב שאינם המטיים. אז בואו נתחיל.

לפני שלבי בידוד התאים, נגב את מכסה המנוע של תרבית רקמת הזרימה הלמינרית עם אינדין ואסוף צלחות תרבית תאים סטריליות. צלוחיות תרבית תאים, מכשירי ניתוח מעוקרים PBS, מגרדי תאים, מחזיק צינורות, חיות מחמד רצועות של 25 מיליליטר ומזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט קצה קהה. זכור לחמם מראש את מדיום תרבית התאים אלפא MEM ו- EGM באמבט מים של 37 מעלות.

כעת העבירו את חבל הטבור לזרימה הלמינרית ושטפו אותו פעמיים ב- PBS. כדי להסיר דם מזהם, השתמש במזרק סטרילי של חמישה מיליליטר כדי לשרוף את וריד חבל הטבור בצד אחד. כעת שטפו את וריד הטבור עם PBS עד שהנוזל יזרום החוצה.

הקצה השני של החוט הופך לשקוף לחלוטין ללא גוון אדום. התחל במושבת אנדותל היוצרת בידוד תאי אב על ידי מילוי בקבוק של 75 סנטימטר רבוע ב-15 עד 20 מיליליטר EGM חם מראש שני בינוני. הנח את הכבל בצלחת חדשה מלאה ב-PBS סטרילי והשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את החוט לשני חלקים שכל אחד מהם באורך של כחמישה סנטימטרים.

כעת הכנס להב אחד של המספריים הכירורגיים וחתוך את הווריד לאורך. בשלב זה, עוזר יכול להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את הווריד בזמן שמבצעים חתכים נוספים. הנח את הכבל עם הווריד הפתוח לצלחת חדשה.

ללא PBS, השתמש במגרד תאים כדי לשפשף את המשטח הפנימי של הווריד על שטח של סנטימטר אחד לפחות. שטפו את המגרד במדיום EGM שני כדי לשחרר את תאי הכלי המשופשפים לתוך הבקבוק. יהיה צורך לחזור על הליך זה עד 10 פעמים.

סגור את הבקבוק והכניס אותו לחממה המכוונת ל-37 מעלות, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. כעת, לאחר ש-e CFCs בודדו, בואו נעבור ל-MSC. כעת, לאחר ששכבת האנדותל נשרטה, השתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך את החוט לחתיכות קטנות מאוד.

מילימטר עד שניים. השתמש מקסימום במלקחיים סטריליים כדי להעביר את החלקים הללו לצלחת תרבית מסומנת מראש. השאירו את הצלחת פתוחה לפחות חמש דקות לפני שממלאים אותה במדיום כדי לאפשר לחלקים להיצמד למשטח הפלסטיק.

באמצעות המהירות הנמוכה ביותר האפשרית הוסף בעדינות 30 עד 35 מיליליטר של MEM שעבר שינוי אלפא חם מראש. סוגרים את הצלחת ומניחים אותה באינקובטור המוגדר על 37 מעלות עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. צמיחה של תאי סטרומה מזנכימליים מחלקי החבל תארך שלושה עד שבעה ימים ולאחר מכן ניתן יהיה להרחיב את התאים.

בינתיים, ניתן להרחיב את ECFC, שיראה לך בשלב הבא. למחרת, השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבחון את התאים. אם הליך הגירוד נעשה כראוי, אשכולות התאים המתרבים הראשונים יהיו גלויים לחלוטין.

החלף את ה-E GM שני בינוניים כדי להסיר את כל התאים והחלקיקים שאינם מחוברים. המשך להרחיב את התאים ולהחליף שליש מהמדיום פעמיים בשבוע. לאחר 10 עד 12 יום נצפו באופן קבוע מושבות אנדותל גדולות מאוד.

כעת, הסר את המדיום ושטוף עם PBS כדי להיפטר מהשימוש בחלבון שנותר. 0.05% טריפסין 0.7 מילי-מולרי EDTA לניתוק התאים. בעת העברת תאים לכלי תרבית חדשים, הקפד לבחור צלוחיות בגודל מתאים כדי להשיג צפיפות זריעה נמוכה.

זה יסייע בהתרחבות נוספת. המעבדה שלנו בדרך כלל מסירה צאצאים מיותר מ-20 מושבות גדולות ל-425 צלוחיות של 25 סנטימטרים רבועים. אל תשכח להחליף שליש מהמדיום פעמיים בשבוע.

פרוטוקול דומה משמש להרחבת MSC בסעיף הבא. לאחר שחלפו שלושה עד שבעה ימים, השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את הופעתם של תאים בצורת ציר ליד הרקמה המחוברת. כאשר יש צמיחה מספקת של תאים, החלקים נוטים להיצמד מכיוון שהם מאבדים מגע עם הפלסטיק.

לאחר 10 עד 12 יום, הסר את חתיכות הרקמה. נתק את ה-MSCs מהפלסטיק באמצעות תמיסת טריפסין EDTA ולהעביר את התאים לצלוחיות תרבית חדשות ממולאות מראש בגודל ובמספר המתאימים כדי להבטיח צפיפות זריעה נמוכה במהלך התרחבות התא. יהיה צורך להחליף שליש מהמדיום פעמיים בשבוע לאחר הרחבת שני סוגי התאים.

ניתן לבצע צביעה ואחריה זרימה ציטומטרית כדי לזהות ביטוי סמן פני התא המעיד על פנוטיפים של אב ולקבוע שאין זיהום בתאים המטופויאטיים. זרעו את ה-e CFCs הטהורים שנקטפו בצפיפות ציפוי נמוכה מאוד של שלושה או 10 תאים לסנטימטר רבוע בצלחות תרבית תאים כדי להבטיח צמיחה של מושבה בודדת החליפו שליש מהמדיום פעמיים בשבוע לאחר 14 יום. קץ התרבות.

הסר בינוני. שוטפים פעמיים עם PBS ומקבעים את המושבות בתמיסת קיבוע קרה כקרח למשך 15 דקות במקרר, השליכו את תמיסת הקיבוע והשאירו את הצלחות פתוחות לייבוש למשך 10 דקות. הרטיבו את התאים במים מזוקקים למשך 10 דקות.

מוסיפים תמיסת האריס המטין ומכתימים את המושבות הקבועות למשך 12 דקות. הסר את תמיסת ההמטין ושטוף את הצלחות במי ברז. כדי להיפטר מתמיסת הצביעה שנותרה.

צלם תמונות של כל מושבה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו וייבא קבצים בפורמט jpeg או TIFF למחשב שלך. פתח את התמונות עם תוכנת image J ונתח את מספר התא המדויק של כל מושבה כמתואר באנימציה הבאה. פתח את תוכנת image J וייבא תמונת מושבה באמצעות פונקציית פתיחת הקובץ בתפריט הנפתח.

המשך באמצעות התהליך. הפחת פונקציית רקע. השתמש בפונקציית הבחירה האליפטית או המברשת בתפריט תמונה J כדי לסמן את שולי המושבה.

נקה את התמונה שמסביב באמצעות פונקציית העריכה נקה חיצונית וחתוך את התמונה על ידי בחירת חיתוך תמונה. כוונן את הסף באופן ידני באמצעות פונקציית סף התאמת התמונה כך שכל התאים ייצבעו לחלוטין. אדום. ספור את מספר התא של המושבה על ידי בחירה.

לנתח, לנתח חלקיקים. בחר הגדרות מתאימות הממוטבות עבור כל סוג תא ובחר בסדר אם בוצע כהלכה. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של אוכלוסייה כמעט טהורה של תאים החולקים את המאפיינים של תאי אב אנדותל ומזנכימליים אנושיים, שהם אוטולוגיים זה לזה מכיוון שהם נגזרים מאותו חוט.

החל מהיום החמישי, תאים מזנכימליים בצורת ציר יופיעו מתחת לחתיכת החוט המחוברת לצלחת התרבית. לאחר יום עד יומיים, האשכולות הראשונים של מושבת אנדותל היוצרים תאי אב או e CFCs יהיו גלויים במיקרוסקופ הפוך. מושבה ענקית זו שגדלה במהירות של e CFCs נוצרה לאחר 11 ימים.

ניתן להעביר גם את ה-MSCs וגם את ה-E CFC ולהרחיב עוד יותר. אנו ממליצים על ניתוח עוקב של כל מוצרי התרבות באמצעות זרימה ציטומטרית כדי לאשר את הפנוטיפ המתאים. אנא זכור שגם שושלת האנדותל וגם שושלת המזנכימה מגיבות לנוגדנים ספציפיים ל-CD 73, CD 1 46, CD 29 ו-CD 1 0 5.

שימו לב שה-MSCs ביטאו ירך אחת, שזוהתה באמצעות נוגדן נגד CD 90. ה-E CFCs חיוביים ל-CD 31, הנקרא גם מולקולת הידבקות של תאי אנדותל טסיות דם או PCAM. זה מבוסס היטב שניתן להפחית את ביטוי התגובתיות החיסונית של CD 34 בחבל הטבור על ידי E CFCs באמצעות תרבית חוזרת.

סמני תאי דם כגון CD 45, H-L-A-D-R ו-CD 14 נותרו שליליים עבור שני סוגי התאים. ניתן להעריך את היררכיית תאי האב בין E CFCs באמצעות תוכנת Image J על ידי ספירת מספרי תאים מדויקים של כל מושבה בודדת. זה עתה הראינו לך כיצד לבודד, להרחיב ולנתח מקלות ו-ECEs מקוד טבורי אנושי בעת ביצוע הליך זה.

חשוב לעבוד בתנאים סטריליים ולבדוק פנוטיפ וטוהר לפני השימוש בתאים במחקרים הבאים. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.