Name: חזותי יחיד מולקולת הדנא שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: למדו לדמות שכפול DNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. הפרוטוקול משתמש בתבניות rolling circle וזרימה למינרית לצפייה בדינמיקת רפליסומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

סמיר חמדאן סייעו בפיתוח טכניקה זו. E. חלבונים הם coli מהמעבדה של פרופ &#39;ניק דיקסון, חלבונים אוניברסיטת Wollongong, ו T7 הם מן פרופ&#39; צ&#39;רלס ריצ&#39;רדסון, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד. העבודה נתמכת על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (GM077248 כדי AMvO) ואת קופין ג&#39;יין צ&#39;יילדס קרן (JJL).

לפני ביצוע ניסוי יחיד מולקולה שכפול, כמה חומרים צריכים להיות מוכנים מראש. 1. שכפול ה-DNA תבנית המצע עבור התגובה שכפול הוא biotinylated, מעגל זנב M13 מתגלגל מוכן באמצעות תקן 1,2 טכניקות לביולוגיה מולקולרית. חומרים: M13mp18 גדילי דנ&quot;א יחיד, תחל Biotinylated oligonucleotide הזנב (5&#39;-ביוטין-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &quot;), T7-DNA פולימראז, גוש חום, פנול / Isoamyl אלכוהול / כלורופורם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשל אוליגו זנב biotinylated ל M13 על ידי הוספת יתר של פי 10 של אוליגו ב TBS חיץ (330 nM זנב אוליגו, 33 nM M13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את התערובת ל 65 ° C בבלוק חום. מחומם פעם, להפוך את חום לחסום את ולאפשר קירור איטי שצריך לחשל תחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את M13 דרוך אל תערובת של 64 nM DNA פולימראז T7 ו חיץ T7 שכפול המכיל dNTPs ו MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות להרוות עם 100 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מלא ב-DNA מוצר עם מיצוי פנול / כלורופורם / isoamyl אלכוהול dialyze למאגר TE או אחסון אחר חיץ מתאים לקבוע ריכוז ה-DNA (Back-תמצית כל שלב אורגני לשחזר שום שיורית דרוך M13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איטרציה אחת של הכנת תבנית יכול בקלות להפוך כמה מיליליטרים של תבנית ריכוז nanomolar, מספיק מאות עד אלפי ניסויים-מולקולה בודדת. </li></ol> 2. פונקציונליות Coverslips לחיבור ה-DNA כדי coverslip הזכוכית, הזכוכית היא פונקציונליות הראשון עם aminosilane, אשר יחד ואז מולקולות PEG biotinylated. ציפוי זה עוזר להפחית את האינטראקציות ספציפי של דנ&quot;א וחלבונים שכפול עם המשטח 1,3. חומרים: coverslips זכוכית, צנצנות מכתים, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k-NHS אסתר, ביוטין, PEG5k-NHSester, אצטון, 1M KOH, אתנול תנור, sonicator Bath <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקיון יסודי של coverslips זכוכית על ידי הצבת אותם מכתים צנצנות ממלאים את הצנצנות עם אתנול. Sonicate במשך 30 דקות ולשטוף את הצנצנות מתמלאות 1 M KOH. Sonicate במשך 30 דקות הן חזרו שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התגובה functionalization הראשון, כל עקבות מים צורך להסיר. ממלאים את הצנצנות עם אצטון sonicate במשך 10 דקות. שוטפים את הצנצנות שוב עם אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2% v / v פתרון של מגיב silane ב אצטון. הוסף את הצנצנות מכתים ו להתסיס במשך 2 דקות. תגובה זו זוגות הקבוצה alkoxy של aminosilane כדי זכוכית, משאיר אמין תגובתי לשלב הבא צימוד. להרוות את התגובה עם עודף גדול של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש coverslips ידי אפייה אותם 110 מעלות בתנור למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן methoxy 50:1: תערובת ביוטין PEG ב 100 pH 8.2 mM NaHCO 3. כוון PEG w / v סביב 0.2% biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μL של התערובת PEG על coverslip מקום silanized יבש אחר coverslip על העליונה. כולל spacer coverslip זכוכית תאפשר הפרדת coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips בפתרון PEG במשך 3 שעות, ואז נפרד כל זוג coverslips בהרחבה ולשטוף עם מים. הקפד לשמור coverslips פונקציונליות כלפי מעלה כמו פעם רק צד יהיה מצופה PEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש coverslips ולאחסן תחת ואקום. משטחים להישאר יציב למשך חודש לפחות, כך עשרות coverslips ניתן לבצע אצווה בשימוש לפי הצורך. </li></ol> חומרים אלה צריכים להיעשות מבעוד מועד, ולאחר מכן השתמשו עבור כל ניסוי. כדי להתחיל בניסוי כל מולקולה בודדת, להתחיל בהרכבת תא הזרימה. 3. לשכת תזרים הכנה הניסוי מבוצע באמצעות תא זרימה פשוט בנוי עם coverslip פונקציונליות, פעמיים צדדי קלטת, שקופיות קוורץ צינורות. אחת קאמרית תזרים מוכן לכל מולקולה בודדת 1,4 הניסוי. חומרים: פעמיים צדדי קלטת, סכין גילוח, שקופיות קוורץ עם חורים אפוקסי, מהירה יבש צינורות, coverslip פונקציונליות (ראה לעיל), פתרון streptavidin (25 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל PBS), צינורות, חיץ חסימה (20 mM טריס pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA, 0.005% Tween-20) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין על ידי הנחת 20-25 מ&quot;ל של חיץ חסימת ייבוש להסיר בועות אוויר עבור צעדים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו coverslip PEG-פונקציונליות ולהפיץ 125 של פתרון PBS-בדילול streptavidin על פני השטח. תשאיר את זה דגירה במשך 20 דקות תוך כדי הכנת חלקים אחרים של התא, ומאפשר streptavidin להיקשר biotins פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פיסת פעמיים בצדקלטת ד כדי להתאים את גודל השקופית קוורץ. סמן את המיקום של החורים בצינור בקלטת בעיפרון כך קווי המתאר של החדר תזרים ניתן להסיק בקלטת (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;מ רחב מלבן סביב החורים. זה ישמש ערוץ הזרימה, כדי להיות בטוח כדי להפוך את הצדדים ישר להשאיר מקום סביב כניסת צינורות מוצא. אם תרצה, או ערוצים מרובים בגדלים שונים ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לאורך קו המתאר נמשך, מה שהופך ישר, חתכים נקיים כדי לוודא שלא דבק הבולטת לתוך התעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את אצטון ביסודיות באמצעות קוורץ או אתנול להסיר דבק מן הבנייה תזרים הקודם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את ההיערכות הטובה ביותר המתאר את הערוץ, להסיר צד אחד של גיבוי דבק בזהירות במקום קלטת לשקופית קוורץ. היזהר ליישר את הקלטת כראוי, כמו החורים מפרצון ו לשקע צריכים להישאר חסומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור אורכי צינורות עבור כניסת ו לשקע של התא זרימה. זה עוזר לחתוך את הקצה של הצינור על כ 30 ° זווית כך הצינור לא לחוצים אל תחתית החדר. מניחים את הצינורות על איזה תמיכה להשעות אותם מצורף קל התא זרימה בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את coverslip streptavidin מצופים היטב במים ולייבש באמצעות אוויר דחוס. זכרו כי רק צד אחד הוא פונקציונליות; להיזהר לא להפוך את coverslip נגמר. הסר את הצד השני של קלטת גיבוי במקום שקופיות קוורץ על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ קלות על coverslip כדי לדחוף את כל האוויר שנלכד דבק. זה יעזור למנוע בועות אוויר להיכנס לערוץ הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצדדים של החדר עם אפוקסי. הכנס את צינורות לחתוך לתוך החורים של קוורץ ו חותם במקום עם אפוקסי. זה צריך להתייבש במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש פעם, להתחיל לחסום את פני השטח על ידי משיכת חלק למאגר חסימת degassed דרך אחד הצינורות. מחט מד 21-מתאים באופן מושלם בתוך צינורות 0.76 מ&quot;מ. פלאש כמה פעמים כדי להסיר בועות אוויר, ולאפשר החדר כדי לדגור במשך שעה לפחות חצי. </li></ol> 4. Single-מולקולה שכפול ניסוי חומרים: תא תזרים הוכן, SYTOX אורנג&#39;, מיקרוסקופ TIRF, 532 ננומטר לייזר, מצלמת CCD, מחשב עם תוכנת רכישת התמונה, הרולינג מעגל המצע דנ&quot;א, חלבונים שכפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התא זרימה נחסם, הכל מוכן להתחיל את הניסוי יחיד מולקולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התא זרימה ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ. החזק את תא במקום עם קליפים הבמה להיות בטוח כי ערוץ זרימה ממוקם ישר לאורך ציר ה-Y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את התא זרימה מוצא הצינור לשאוב את המזרק באמצעות מחבר צינורות בקוטר גדול יותר או מחט. מניחים את כניסת בחסימת המאגר ולמשוך את הבוכנה כדי להסיר כל האוויר בצינור. קפיצי עדין של הצינור לשקע יעזור ברור כל בועות אוויר שנלכדו בתוך התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תבנית ה-DNA המניות PM ב 25 מ&quot;ל 1 של חיץ חסימה. תזרים לתוך תא בקצב הזרימה מתונה לאפשר כיסוי השטח טוב של ה-DNA. 0.025 מ&quot;ל / דקה במשך 30 דקות פועלת היטב. זו יכולה להיות מגוונת המבוססת על כמה מולקולות הדנ&quot;א הן על פני השטח עבור כל אצווה של coverslips או כמה הם הרצויה עבור הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ה-DNA הוא, לשטוף את ה-DNA העודף באמצעות חסימת חיץ. לשטוף לפחות 200 תזרים תאים כרכים להיפטר מה-DNA של כל תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין degassing החיץ שכפול. עבור א שכפול ניסויים coli, לעשות את זה ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית את הסיכון של בועות בחדר מחומם לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הלייזר ואת המצלמה. CCD מקורר צריך להגיע לטמפרטורת לפני שניתן יהיה להשתמש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע הניסוי 37 ° C, להפעיל את החימום. הקפד המטרה היא במגע עם התא זרימה או שזה יהיה גוף הקירור מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כביסה degassing, התגובה יכולה להיות מוכנים. מערבבים נוקלאוטידים, DTT, ו SYTOX במאגר שכפול. לאחר מכן להוסיף החלבונים ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים את תערובת התגובה לתוך התא זרימה. זו מהירות הזרימה צריך להיות מספיק כדי למתוח dsDNA. עבור ערוץ 2 מ&quot;מ רוחב 100 מיקרומטר, תזרים גבוה 0.04 mL / min עובד היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זמן התערובת להיכנס לחדר ולהתחיל הדמיה. עצה טובה היא להעביר את שדה הראיה לצד הערוץ ולהתמקד בחומר דביק. פעולה זו תבטיח שאתה קרוב לפני השטח למיקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת כוח לייזר, להתמקד מיקרוסקופ, וזווית TIRF. שמור על צריכת חשמל נמוכה, כדי למנוע כל photocleavage של ה-DNA מוכתם. רוכשת ב 1-5 מסגרות / שנייה למשך מספר דקות, תלוי בקצב של שכפול הדנ&quot;א. אם תרצה, לחזור כדי לקבל עוד מסלולי שכפול או לעבור לתחום חדש כדי לראות מולקולות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התגובה תערובת כמעט ריק, זה רעיון טוב לזרום חיץ יותר עם SYTOX לראות בתחומים אחרים של התצוגה. לוקח מספר תמונות של מולקולות שונות משוכפל מספק נתונים סטטיסטיים לקביעת processivity. </li></ol> 5. נציג תוצאות מולקולות שכפול פעיל נתפסים בקלות כקווים הגוברת של ה-DNA מוכתם. בניסויים שלנו, זורם 25 PM המצע M13 נותן 100-1000 מולקולות 60x, בשדה 125 מיקרומטר x 125 מיקרומטר מבט (איור 1). ביצוע ניסויים שכפול באמצעות E. חלבונים coli replisome ב 37 ° C (ראה חומרים לפרטים נוספים) נותן מולקולות 5-50 שכפול לכל שדה הראיה. בריכוזים המקבילה של replisome T7, אשר יוזם על פני המצע ביעילות רבה יותר, אנו צופים&gt; 70% של מולקולות בתוך לשכפל שדה. תנאים אלה תשואה צפיפות מוצר כל כך גבוה מולקולות בודדות שקשה לפתור ולנתח, אז הניסויים T7 מבוצעים בריכוזים חלבון נמוכה יותר. ניתוח נתונים: כדי לקבל קצב נתונים, פשוט העלילה את נקודת הסיום של ה-DNA לעומת זמן לחשב את המדרון (איור 2). עבור processivity, לקבוע את האורך הכולל של ה-DNA. שני המספרים האלה יהיה צורך להמיר זוגות בסיסים. לפני ביצוע הניסוי, אתה צריך לדעת את גודל פיקסל של המצלמה בהגדלה הנכונה. עבור המרה basepair, אמידה טובה היא פשוט המרת מבוסס על אורך קריסטלוגרפיים של ה-DNA, 2.9 נ&quot;ב / ננומטר. עם זאת, זרימה למינרית לא לגמרי למתוח את ה-DNA, כך כיול אורך ה-DNA יבוצעו על ידי לקיחת דנ&quot;א באורך ידוע, למשל 48,502 bp λ DNA, הצמדתו התא זרימה עם אוליגו biotinylated ומדידת אורך SYTOX המוכתמת שלה את קצב הזרימה משמש הניסוי שכפול. קביעת מספר זוגות בסיסים / פיקסל יאפשר חישוב מדויק של שיעור שכפול processivities. לקיחת תמונות וסרטים רבים תספק מספר גדול של מולקולת המוצר, דבר המאפשר לתכנן של הפצות קצב processivity (איור 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: (מתוך המשחק 1.) קריקטורה) של assay מתגלגל מעגל השכפול. (SA, streptavidin). מובילים גדיל סינתזה מרחיב את הזנב המקשר את מעגל פני השטח. הזנב מומר dsDNA ידי פולימראז גדיל מפגרת ומתח על ידי זרימה למינרית. ב) דוגמה שדה הראיה עם SYTOX כתום עירור 532 ננומטר. כתמים ניאון קטנים הם קשורים, שאינם משוכפלים מצעים. הערה אורך קיצונית של המוצרים ואת מספר גדול של מוצרים לכל שדה (כל תא מכיל זרימת&gt; 5000 שדות כאלה). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: (עיבוד שופט 1.) A, b) Kymographs של מולקולות שכפול אופייני T7 (א) ו - E. (ב) coli ניסויים. ג) מסלולי Endpoint של מולקולות מ) A ו-B) זממו נגד הזמן. המסלולים מצוידים רגרסיה ליניארית כדי לקבל שיעורי שכפול. דוגמאות המוצגים הם 99.4 נ&quot;ב s -1 ו - 467.1 bp s -1. ד) הפצות אורך שכפול של מוצרים, שיתאים עם דעיכה מעריכית יחיד להשיג processivity: 25.3 ± 1.7 kbp (T7), 85.3 ± 6.1 kbp (E. coli). ה) הפצות שיעור מסלולי מולקולה בודדת, מתאים עם Gaussians יחיד. אמצעי: 75.9 ± 4.8 נ&quot;ב s -1 (T7), 535.5 ± 39 נ&quot;ב s -1 (E. coli).

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

אחת מלאה קריטי בוחנת את ההשפעה של הכתם, SYTOX אורנג&#39;, על חלבונים שכפול של עניין. דרך פשוטה לעשות זאת היא לבצע את הניסוי שכפול התא זרימה כמתואר אבל עם השמטה של ​​SYTOX. לאחר תערובת תגובה יש זרמו החדר, להוסיף למאגר עם SYTOX להכתים דנ&quot;א לבחון את חלוקת האורך של מולקולות משוכפל. לחלופין, תגובות בתפזורת סטנדרטי יכול לשמש כדי לבדוק השפעה כלשהי על שיעור של SYTOX שכפול ויעילות. הניסוי המתואר כאן משתמשת רק ערוץ זרימה אחת. ניתן לשנות זאת בקלות על ידי יצירת רב ערוצי הזרימה לתאי או באמצעות PDMS או מכשירים microfluidic דומה. הגדלת מספר ערוצי מאוד מקל ההקרנה של ריכוזי חלבון, מוטציות, או מולקולות מעכב ומגבירה את המהירות של אוסף שכפול נתונים. כאמור, אנו מבצעים את ה שכפול coli ניסויים ב 37 ° C באמצעות בית בנוי תזרים אלומיניום תא החימום, גוף חימום התנגדות (דוד מחסנית) ואת אספקת החשמל משתנה. זה נותן יציבות טמפרטורה טובה ומונע את רכישת מחמם אובייקטיבי. כדי לכייל את דוד, אנחנו פשוט קדח חור במרכז התא העליון תזרים קוורץ, תרמי מוכנס לתוך התעלה תזרים זרמו חיץ כרגיל. מדידת טמפרטורת התא זרימה חיץ במתח הגובר מאפשר חימום מדויק.

שכפול T7: 40 מ&quot;מ טריס pH 7.5, גלוטמט אשלגן 50 מ&quot;מ, 10 מגנזיום כלוריד מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל BSA, עם 5 מ&quot;מ dithiothreitol, dNTPs 600 מיקרומטר, 300 מיקרומטר ATP, CTP 300 מיקרומטר ו 15 ננומטר SYTOX אורנג&#39; הוסיף מיד לפני השימוש. חלבונים מוסף כמו: nM 5 gp4 (hexamer), 40 פולימראז ננומטר (01:01 gp5: thioredoxin), 360 ננומטר gp2.5 1,5. E. coli שכפול: 50 mM HEPES pH 7.9, 12 מגנזיום אצטט mM, אשלגן כלוריד 80 מ&quot;מ, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל BSA עם 10 mM dithiothreitol, dNTPs 40 מיקרומטר, 200 rNTPs מיקרומטר ו 15 ננומטר SYTOX אורנג&#39; הוסיף מיד לפני השימוש. חלבונים מוסף כמו: 30 nM DnaB (hexamer), 180 nM DnaC (מונומר), 30 nM αεθ, 15 ננומטר τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ או τ 3 δδ&#39;χψ, β 30 ננומטר (דימר), 300 ננומטר DnaG, 250 nM SSB (tetramer), 20 ננומטר PriA, 40 nM PriB, 320 nM pric, 480 nM DnaT 1,6

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

אנו מתארים פשוטה מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוססי בזמן אמת על קיום שיטת שכפול ה-DNA ברמה מולקולה בודדת. תבנית עגולה, DNA מפוצל מחובר coverslip כוס פונקציונליות ו משוכפל בהרחבה לאחר המבוא של חלבונים שכפול נוקלאוטידים (איור 1). גדל פעמיים גדיל DNA מוצר (dsDNA) מתרחבת עם זרימה למינרית ו דמיינו באמצעות צבע intercalating. מדידת המיקום של סוף DNA גדל בזמן אמת מאפשר קביעה מדויקת של קצב שכפול (איור 2). יתר על כן, אורך של מוצרי ה-DNA השלימה דיווחים על processivity של שכפול. ניסוי זה יכול להתבצע בקלות ובמהירות דורש רק מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמה רגישה למדי.

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

אנו מתארים שיטה פשוטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית למעקב בזמן אמת אחר רפליקציית DNA ברמת המולקולה הבודדת. DNA מעגלי ומסועף...

בטכניקה זו, כיסויות זכוכית מעובדות עם תערובת של מולקולות PEG אינרטיות ומולקולות PEG עם ביוטין. תא זרימה נוצר עם פני השטח המטופלים הללו ומונח על מיקרוסקופ TIRF. תבניות גלגול מעגלי (rolling circle) עם ביוטין נקשרות לפני השטח באמצעות סטרפטאבידין רב-ערכי.כאשר הסובסטראטים משוכפלים על ידי הוספת חלבוני אזורי שכפול ונוקלאוטידים, ה-DNA דו-גלולי המתקבל מוארך באמצעות זרימה למינרית ומצולם בזמן אמת באמצעות צבע שזור (intercalating dye). היי, אני נתן טאנר מהמעבדה של אנטואן ואן היאן במחלקה לביוכימיה ופרמקולוגיה מולקולרית בבית הספר לרפואה של הרווארד. אני ג'ו לארו, גם אני מהמעבדה של ואן היאן.היום נדגים לכם פרוצדורה לדימוי פלואורסצנטי של שכפול DNA בזמן אמת ברמת המולקולה הבודדת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור פעילויות מתואמות של סינתזת DNA של קומפלקס שכפול בודדים. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע היברידציה (annealing) של אוליגו הזנב הביוטינילי ל-DNA גלול אחד של M 13 על ידי הוספת עודף פי עשרה של אוליגו בבופר TBS, חימום ל-65 degrees Celsius, ולאחר מכן כיבוי של בלוק החימום כדי לאפשר קירור איטי להיברידציה תקינה של הפריימר. כעת, כאשר ה-M 13 המופעל (primed) מוכן, הוסיפו אותו לתערובת של 64 nanomolar T seven DNA polymerase ובופר שכפול T seven המכיל dNDPs ומגנזיום כלוריד, והדגירו את התגובה ב-37 degrees Celsius למשך 12 דקות. בסיום ההדגרה, עצרו את התגובה באמצעות 100 millimolar EDTA.בשלב הבא טהרו את ה-DNA של המוצר הממולא באמצעות חילוץ בפנול, איזואמיל אלכוהול וכלורופורם, ובצעו דיאליזה אל תוך בופר TE או בופר אחסון מתאים אחר; חלצו שוב כל פאזה אורגנית כדי לשחזר שאריות של ראשים (primers). לאחר הדיאליזה, קבעו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis. סבב אחד של הכנת התבנית יכול להפיק ריכוז ננו-מולרי של תבנית המספיק למאות עד אלפי ניסויי מולקולה בודדת.כעת, לאחר שה-DNA מוכן, ניתן להמשיך להכנת לוחות הזכוכית הפונקציונליים. ה-DNA המיועד לשכפול נקשר ללוחות זכוכית שטופלו ב-Amil Lane; קבוצת ה-Oxy של ה-Amil נקשרת לזכוכית ומותירה קבוצת אמין פנויה לקישור מולקולות peg ביוטיניליות. ציפוי זה מסייע בהפחתת קישור לא ספציפי לפני השטח.כדי לנקות ביסודיות את כיסורי הזכוכית, הניחו אותם בצנצנות צביעה ומלאו את הצנצנות באתנול ועבדו באולטרסאונד (sonicate). לאחר 30 דקות, שטפו את הצנצנות ומלאו אותן בקוהידרוקסיד של אשלגן בריכוז one molar ועבדו באולטרסאונד למשך 30 דקות, וחזרו על שני השטיפות. עבור תגובת הפונקציונליזציה הראשונה, יש להסיר את כל שאריות המים.מלאו את צנכני הצביעה באצטון ובצעו סוניקציה למשך 10 דקות. רוקנו את הצנכנים ומלאו אותם שוב באצטון. המשיכו להוסיף את ריאגנט ה-sine לצנכנים וערבבו במשך שתי דקות.לאחר מכן, בצעו השהייה (quench) בעזרת עודף גדול של מים. לאחר מכן, ייבשו את לביבות הכיסוי על ידי אפייה בתנור בטמפרטורה של 110 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו תמיסת PEG בריכוז של כ-0.2% weight per volume באמצעות peg שעבר חניטה; שימוש במפריד לביבות כיסוי מזכוכית יאפשר את הפרדת לביבות הכיסוי. העבירו בפיפטה 100 µL על לביבת כיסוי סילילית יבשה.הניחו כיסוי זכוכית שני מעל. הדגרירו את כיסויי הזכוכית בתמיסת ה-PEG למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הפרידו בין כל זוג כיסויי זכוכית ושטפו היטב במים.הקפידו להשאיר את כיסויי הזכוכית (cover slips) כאשר הצד הפונקציונלי פונה כלפי מעלה, שכן רק צד אחד יצופה ב-peg. לבסוף, ייבשו את כיסויי הזכוכית באמצעות אוויר דחוס ואחסנו אותם בוואקום בתוך דסיקטור; המשטחים נשארים יציבים למשך חודש אחד לפחות. באופן זה ניתן להכין עשרות כיסויי זכוכית בסבב אחד ולהשתמש בהם לפי הצורך.כעת, כאשר זכוכיות הכיסוי מוכנות, ניתן להרכיב את תא הזרימה עבור ניסוי המולקולה הבודדת. התחילו בנתינת 20 עד 25 milliliters של תמיסת חסימה המכילה BSA בתוך כלי ייבוש (desiccator) כדי להסיר בועות אוויר עבור השלבים הבאים. לאחר מכן, דללו 25 microliters של streptavidin ב-100 microliters של PBS ופזרו את התמיסה על פני זכוכית כיסוי עם פונקציונליזציית peg; הדגירה תיערך למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ל-streptavidin להיקשר לביוטין שעל פני השטח, בזמן ששאר חלקי התא מוכנים.בזמן שהזכוכית המצפייה (cover slip) נמצאת באינקובציה, גזרו פיסה של סרט דביק דו-צדדי עם גב משני הצדדים, כך שתתאים לגודלו של נס קוורץ ששימש להרכבת תא הזרימה. סמנו בעפרון על הסרט את מיקומי חורי הצינורות, כדי שניתן יהיה לשרטט על הסרט את מתאר תא הזרימה. לאחר סימון החורים, שרטטו מלבן ברוחב שני מילימטרים מסביב לסימונים.מלבן זה ישמש כתעלת זרימה, לכן יש לוודא שהדפנות ישרות ולהשאיר מרווח סביב כניסת ויציאת הצינורית. כעת חתכו את הסרט המסומן לאורך קווי המתאר ששורטטו, תוך ביצוע חיתוכים נקיים וישרים כדי להבטיח ששום דבק לא יבלוט אל תוך התעלה. נקו את שקופית הקוורץ ביסודיות באמצעות אצטון כדי להסיר שאריות דבק מהבניית תא הזרימה שנעשתה בניסויים קודמים.מצא את ההתאמה המיטבית של מתבס התעלה. הסר צד אחד של מדבקת הדבק והנח בזהירות את הסרט על גבי שקופית הבסיס. הקפד ליישר את הסרט כראוי, שכן חורי הכניסה והיציאה חייבים להישאר פתוחים.בשלב הבא, הכין את קטעי הצינור באורך המתאים, מצינור בקוטר 0.76 מילימטר, עבור הכניסה והיציאה של תא הזרימה. מומלץ לחתוך את קצה הצינור בזווית של כ-30 מעלות, כדי למנוע מהצינור להימעך כנגד תחתית התא. תלה את הצינורות על מעמדי מבחנות כדי להקל על חיבורם לתא הזרימה בשלבים הבאים.בשלב זה דגירה של לבישCOVER slip הסתיימה. שטפו היטב את ה-cover slip המצופה ב-strep avid ENC במים ויבשו בעזרת אוויר דחוס. היזהרו לא להפוך את ה-cover slip, שכן רק צד אחד שלו פונקציונלי.לבסוף, השלימו את הרכבת תא הזרימה על ידי הסרת הצד השני של גב הסרט והנחת פלסת הקוורץ על לוכית הכיסוי. לחצו קלות על לוכית הכיסוי כדי לדחוף החוצה אוויר שנלכד בדבק. פעולה זו תסייע במניעת חדירת בועות אוויר לתעלת הזרימה.אטמו את דפנות התא בעזרת אפוקסי. הכניסו את הפיתול החתוך אל תוך החורים שבקוורץ, אטמו אותו במקומו עם אפוקסי והמתינו מספר דקות לייבוש. לאחר שהאיטום באפוקסי יתייבש, התחילו בחסימת הפני השטח.השתמשו במחט בכילוי 21. שאבו חלק מה-Degas blocking buffer דרך אחד הצינורות. שטפו את המערכת מספר פעמים כדי להסיר בועות אוויר והמתינו שהתא יודגר למשך חצי שעה לפחות לפני המעבר לניסוי השכפול של מולקולה בודדת.כעת, לאחר שמרכיב זרימה (flow cell) נחסם, הניחו אותו על במה המיקרוסקופ. קבעו את התא במקומו באמצעות תסמכי הבמה וודאו שערוץ הזרימה מיושר לאורך ציר ה-y. חברו את צינור היציאה של מרכיב הזרימה למשאבת המזרק באמצעות צינור מקשר בעל קוטר גדול יותר.מקם את פתח הכניסה בתוך תמיסת חסימה (blocking buffer) ומשוך את בוכנת המזרק כדי להוציא אוויר מהצינור. רעידה קלה של צינור היציאה תסייע בפינוי בועות אוויר כלואות בתא הזרימה. כעת הוסף את ה-DNA; דלל את תבנית ה-DNA מהמלאי לריכוז של 25 picomolar בתוך מיליליטר אחד של תמיסת חסימה, והזרם אותה אל תוך התא בקצב זרימה מתון, כגון 0.025 milliliters per minute, למשך 30 דקות כדי לאפשר כיסוי טוב של ה-DNA על פני השטח.לאחר שה-DNA נמצא בתא, שטפו את עודפי ה-DNA באמצעות שטיפה של חוצץ חסימה (blocking buffer wash) למשך לפחות 200 נפחי תא זרימה. כדי להסיר את כל ה-DNA החופשי, הפעילו את הלייזר ואת המצלמה. ה-CCD המקורר צריך להגיע לטמפרטורה הרצויה לפני שניתן יהיה להשתמש בו.לאחר שטיפת עודפי DNA וניקוי הגזים מבחלק המאuר (replication buffer), הכין את תערובת תגובת השכפול הכוללת נוקלאוטידים, DTT ו-cytoxin בתוך תמיסת השכפול. לאחר מכן, הוסף את החלבונים וערבב בעדינות. לבסוף, זרימה את תערובת התגובה אל תוך תא הזרימה (flow cell).מהירות הזרימה כאן צריכה להיות מספקת כדי למתוח DNA דו-גדילי עבור תעלת זרימה ברוחב שני מילימטרים ובגובה 100 µm. קצב של 0.04 mL/min עובד היטב. המתינו כ-10 דקות כדי לאפשר לתערובת להיכנס לתא.הזיזו את שדה הראייה לצד הערוץ ומקדו את הפוקוס על חומר הדבקה כדי לוודא שאתם קרובים לפני השטח לצורך מיקוד ותחילת הדמיה. כווננו את הספק של הלייזר, את פוקוס המיקרוסקופ ואת זווית ה-turf. שמרו על הספק נמוך כדי למנוע פירוק פוטוכימי (photo cleavage) של ה-DNA הצבוע.בצע רכישת תמונות בקצב של פריים אחד עד חמישה פריימים לשנייה למשך מספר דקות, בהתאם לקצב השכפול של ה-DNA. חזור על הפעולה כדי לקבל מסלולי שכפול ארוכים יותר, או עבור לשדה ראייה חדש כדי לראות מולקולות נוספות כאשר רוב תערובת התגובה כבר נשאבה לתוך התא; זרימה של בופר נוסף עם cyt תאפשר לראות שדות ראייה אחרים. צילום מספר תמונות של מולקולות משוכפלות שונות מספק נתונים סטטיסטיים לקביעת הפרודוקטיביות.בבדיקת רפליקציית מעגל גלגול (rolling circle replication assay), סינתזה מובילה מאריכה את הזנב המקשר בין המעגל לפני השטח; הזנב הופך ל-DNA דו-גדילי על ידי הפולימרז של הגדיל המעכב ונמתח על ידי זרימה למינרית כפי שמוצג. להלן דוגמה לשדה ראייה עם צבע כתום בעירור של 532 nanometer.הנקודות הפלואורסצנטיות הקטנות הן תבניות שאינן משוכפלות המעוגנות לפני השטח. שימו לב לאורכן המהולל של התוצרים ולמספר הרב של התוצרים בכל שדה ראייה. שדה ראייה טיפוסי יציג מולקולות משוכפלות רבות, הנראות כקווים בהירים גדלים של DNA צבוע. ניסויי E Coli בטמפרטורה של 37 °C מניבים בין חמישה ל-50 מולקולות לשדה, בהתאם לצפיפות הפני השטח.אזור השכפול של T7 מתחיל ביעילות גבוהה בהרבה וישכפל יותר מ-50% מהמולקולות בשדה. בצפיפות גבוהה כזו, קשה להבחין בין מולקולות בודדות כפי שניתן לראות כאן. לכן, בצעו את ניסוי T7 בריכוזי חלבון נמוכים יותר או בצפיפות שטח נמוכה יותר. גרפי Chime של מולקולות משכפלות טיפוסיות מניסויי e coli ו-T7 כוללים מסלולי נקודת סיום של מולקולות מ-e coli ו-T7 הממוקמים מול הזמן; המסלולים הותאמו באמצעות רגרסיה ליניארית כדי לקבל את קצבי השכפול, אשר בדוגמה זו הם 467.1 base pairs לשנייה עבור e coli ו-99.4 base pairs לשנייה עבור T7.עבור T7, התפלגויות הקצב של מסלולי מולקולה בודדת שהותאמו לגאוסיאנים בודדים הניבו ממוצע של 535.5 פלוס או מינוס 39 זוגות בסיסים לשנייה עבור e coli ו-75.9 פלוס או מינוס 4.8 זוגות בסיסים לשנייה. עבור T7, התפלגויות האורך של תוצרי השכפול הותאמו לדעיכה מעריכית בודדת כדי להפיק את הפרודוקטיביות, שהיא 85.3 פלוס או מינוס 6.1 קילו-זוגות בסיסים עבור e coli ו-25.3 פלוס או מינוס 1.7 קילו-זוגות בסיסים עבור G7. כעת הצגנו בפניכם כיצד למדוד שכפול DNA מתואם באמצעות מולקולות בודדות.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע פונקציונליזציה נכונה של לוחות הכיסוי וליצור תעלות זרימה נקיות וישרות. הקפידו לשמור על עומס נמוך של הספק הלייזר ולמזער פוטו-קיטוע (photo cleavage) של ה-DNA הארוך. וזהו.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

סרטון וידאו זה מתאר שיטה להמחשת הרכבה של חלבון היתוך מעובה על מולקולות DNA באתרים ספציפיים באמצעות הדמיה של מולקולה יחידה. עיבויים אלה נוצרים כתוצאה מאינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, המאפשרות גיוס של RNA פולימראז II ושעתוק גנים משופר.

הדמיה של מולקולה בודדת להדמיית חלבון היתוך מעבה הרכבה על וילונות DNA

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

מחקר זה מציג הליך ניסיון מפורט כדי למדוד דינמיקת לולאות של גדילי הדנ"א כפול באמצעות פלואורסצנטי התהודה העברת אנרגיה מולקולה בודדת (סריג). הפרוטוקול מתאר גם כיצד לחלץ את צפיפות הסתברות הלולאה נקראת גורם J.

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

פרוטוקול זה מספק פעולות מפורטות על הכנת דגימות, איסוף נתונים וניתוח ספקטרום פלואורסצנציה פנימי של DNA.

הדמיה סופר-רזולוציה ספקטרוסקופית של מולקולות DNA באמצעות ניגוד פנימי

למדו לדמות שכפול DNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. הפרוטוקול משתמש בתבניות rolling circle וזרימה למינרית לצפייה בדינמיקת רפליסומים.

חזותי יחיד מולקולת הדנ"א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים