חזותי יחיד מולקולת הדנ"א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

בטכניקה זו, פתקי כיסוי זכוכית מתפקדים עם תערובת של מולקולות יתד אינרטיות וביוטין. תא זרימה נוצר עם משטח פונקציונלי זה ומונח על מיקרוסקופ דשא. תבניות מעגל גלגול ביוטיניל מחוברות למשטח באמצעות סטרפטווידין רב-ערכי.

כאשר הסובסטרטים משוכפלים על ידי הוספת חלבונים ונוקלאוטידים של אזור repli, ה-DNA הדו-גדילי שנוצר מורחב בזרימה למינרית ומצולם בזמן אמת באמצעות צבע בין-קולטציה. היי, אני נתן טאנר מהמעבדה של אנטואן ואן איאן במחלקה לכימיה ביולוגית ופרמקולוגיה מולקולרית בבית הספר לרפואה של הרווארד. אני ג'ו לארו, גם הוא ממעבדת ואן נויאן.

היום נראה לכם הליך להדמיה פלואורסצנטית של שכפול DNA בזמן אמת ברמת מולקולה בודדת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פעילויות סינתזת DNA מתואמות של קומפלקסי שכפול בודדים. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, יש להגביר את אוליגו הזנב הביוטינילי ל-DNA החד-גדילי M 13 על ידי הוספת עודף פי עשרה של אוליגו בחימום מאגר TBS ל-65 מעלות צלזיוס, ואז לכבות את גוש החום כדי לאפשר קירור איטי כדי לקלוט כראוי את הפריימר. כעת, כשה-Prime M 13 מוכן, הוסף אותו לתערובת של 64 ננו-מולארי T שבעה DNA פולימראז ו-T 7 מאגר שכפול המכיל D NDPs ומגנזיום כלוריד ודגר את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. בתום הדגירה יש להרוות עם 100 מילימולר EDTA.

לאחר מכן, טהר את ה-DNA הממולא של המוצר עם פנול איזואמיל, אלכוהול, כלורופורם, מיצוי ודיאליזה לתוך מאגר TE או מאגר אחסון מתאים אחר, חלץ בחזרה כל שלב אורגני כדי לשחזר כל שאריות דרוך. M 13 לאחר דיאליזה קובעים את ריכוז ה-DNA עם ספקטרופוטומטר UV vis. איטרציה אחת של הכנת תבנית יכולה לייצר מספיק ריכוז ננו-מולרי של תבנית למאות עד אלפי ניסויים במולקולה בודדת.

כעת, כשה-DNA מוכן, המשך להכין את פתקי הכיסוי המתפקדים. ה-DNA שיש לשכפל מחובר להחלקות כיסוי זכוכית המתפקדות עם Amil Lane, קבוצת האוקסי של ה-Amil נקשרת לזכוכית ומשאירה אמין זמין לקשירת מולקולות peg ביוטיניליות. ציפוי זה מסייע בהפחתת קשירה לא ספציפית למשטח.

כדי לנקות היטב את החלקות כיסוי הזכוכית, הניחו אותן בצנצנות מכתימות ומלאו את הצנצנות באתנול סוניקט. במשך 30 דקות, שטפו את הצנצנות ומלאו באשלגן הידרוקסיד סוניקט טוחנת אחת למשך 30 דקות וחזרו על שתי השטיפות. לצורך תגובת הפונקציונליזציה הראשונה, יש להסיר את כל עקבות המים.

מלאו את צנצנות הצביעה באצטון וסוניקט למשך 10 דקות. מרוקנים את הצנצנות וממלאים שוב באצטון. המשך להוסיף את מגיב הסינוס לצנצנות ולערבב במשך שתי דקות.

ואז להרוות עם עודף גדול של מים. לאחר מכן יבש את החלקות הכיסוי על ידי אפייתם בחום של 110 מעלות צלזיוס בתנור למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו את תערובת ה-PEG בכ-0.2% משקל לנפח על ידי יתד מכוסה, כולל מרווח החלקה לכיסוי זכוכית יאפשר הפרדה של החלקות הכיסוי, פיפטה 100 מיקרוליטר על החלקת כיסוי מבודדת יבשה.

הניחו תלוש כיסוי שני מעל. דגרו את החלקות הכיסוי בתמיסת PEG למשך שלוש שעות. לאחר מכן הפרד כל זוג החלקות כיסוי ושטוף בהרחבה במים.

הקפד לשמור על החלקות הכיסוי מתפקדות כלפי מעלה מכיוון שרק צד אחד יהיה מצופה יתד. לבסוף, יבש את החלקות הכיסוי באוויר דחוס ואחסן אותם תחת ואקום בייבוש, המשטחים נשארים יציבים למשך חודש לפחות. כך שניתן להכין עשרות תלושי כיסוי באצווה ולהשתמש בהם לפי הצורך.

כעת, כשהחלקות הכיסוי מוכנות, אפשר להרכיב את תא הזרימה לניסוי המולקולה הבודדת. התחל בהנחת 20 עד 25 מיליליטר של מאגר חוסם המכיל BSA בחומר ייבוש כדי להסיר בועות אוויר לשלבים מאוחרים יותר. לאחר מכן, יש לדלל 25 מיקרוליטר של סטרפטווידין ב-100 מיקרוליטר PBS ולפזר את התמיסה על פני השטח של יתד פונקציונלי החלקת כיסוי דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לסטרפטווידין להיקשר לביוטין פני השטח תוך הכנת חלקים אחרים של החדר.

בזמן שהחלקת הכיסוי מודגרת, חותכים חתיכת סרט דו צדדי עם גיבוי משני הצדדים כך שתתאים לגודל שקופית הקוורץ המשמשת להרכבת תא הזרימה. סמן את מיקום חורי הצינורות על הקלטת בעיפרון כך שניתן יהיה לצייר מתאר של תא הזרימה על הקלטת. לאחר סימון החורים, צרו מלבן ברוחב שני מילימטר סביב הסימונים.

מלבן זה ישמש כערוץ הזרימה, לכן הקפידו ליצור צדדים ישרים ולהשאיר מקום סביב כניסת ויציאת הצינור. כעת חותכים את הסרט המסומן לאורך קווי המתאר המצוירים, ומבצעים חתכים ישרים ונקיים כדי לוודא ששום דבק לא בולט לתעלה. נקה היטב את שקופית הקוורץ באמצעות אצטון כדי להסיר דבק מבניית תאי הזרימה ששימשה בניסויים קודמים.

מצא את היישור הטוב ביותר של מתאר הערוץ. הסר צד אחד של גב הדבק והנח בזהירות את הסרט על מגלשת המגרש. הקפד ליישר את הסרט כראוי מכיוון שחורי הכניסה והיציאה צריכים להישאר לא חסומים.

לאחר מכן, הכינו את אורכי חיתוך הצינורות של צינורות 0.76 מילימטר לכניסה ויציאה של תא הזרימה. זה עוזר לחתוך את קצה הצינור בזווית של כ -30 מעלות כך שהצינור לא ילחץ שטוח על תחתית החדר. תלו את הצינור על מדפי המבחנה לחיבור קל לתא הזרימה בשלבים הבאים.

בשלב זה הסתיימה הדגירה של החלקת הכיסוי. שטפו היטב את הכיסוי המצופה ENC במים וייבשו באמצעות אוויר דחוס. היזהר לא להפוך את החלקת הכיסוי מכיוון שרק צד אחד מתפקד.

לבסוף, השלם את הרכבת תא הזרימה על ידי הסרת הצד השני של גב הסרט והנחת שקופית הקוורץ על החלקת הכיסוי. לחץ קלות על פתק הכיסוי כדי לדחוף החוצה את כל האוויר הכלוא בדבק. זה יעזור למנוע בועות אוויר להיכנס לתעלת הזרימה.

אטום את דפנות החדר באפוקסי. הכנס את הצינור החתוך לחורי הקוורץ ואוטם במקומו באפוקסי והניח להתייבש מספר דקות. כאשר אטם האפוקסי יבש, התחל לחסום את פני השטח.

בעזרת מחט 21 מד. משוך חלק מהמאגר החוסם של דגה דרך אחד הצינורות. שטפו החוצה כמה פעמים כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר לתא לדגור לפחות חצי שעה לפני שתעברו לשכפול המולקולה הבודדת. ניסוי.

כעת, לאחר שתא הזרימה נחסם, הנח אותו על שלב המיקרוסקופ. החזק את החדר במקומו עם tagקליפסים וודא שתעלת הזרימה מיושרת לאורך ציר ה-y. חבר את צינור יציאת תא הזרימה למשאבת המזרק באמצעות צינור מחבר בקוטר גדול יותר.

הנח את הכניסה במאגר חוסם ומשוך לאחור את המזרק כדי להסיר אוויר בצינור. תנועה עדינה של צינור היציאה תעזור לנקות את כל בועות האוויר הכלואות בתא הזרימה. כעת הוסף את ה-DNA, דלל את תבנית ה-DNA של המלאי ל-25 פיקומולר במיליליטר אחד של זרימת חיץ חוסמת לתוך החדר בקצב זרימה מתון כגון 0.025 מיליליטר לדקה למשך 30 דקות כדי לאפשר כיסוי פני שטח טוב של DNA.

ברגע שה-DNA נמצא בתא, שטפו את עודפי ה-DNA באמצעות שטיפת חיץ חוסמת לפחות 200 נפחי תאי זרימה. כדי להיפטר מכל ה-DNA החופשי, הפעל את הלייזר והמצלמה. ה-CCD המקורר צריך להגיע לטמפרטורה לפני שניתן יהיה להשתמש בו.

לאחר שטיפת עודפי DNA והסרת מאגר השכפול, הכינו את תערובת תגובת השכפול נוקלאוטידים DTT וציטוקסין את מאגר השכפול. לאחר מכן מוסיפים חלבונים ומערבבים בעדינות. לאחר מכן הזרימו את תערובת התגובה לתא הזרימה.

מהירות הזרימה כאן צריכה להספיק כדי למתוח DNA גדילי כפול לרוחב של שני מילימטרים. ערוץ זרימה בגובה 100 מיקרומטר 0.04 מיליליטר לדקה עובד היטב. אפשר זמן לתערובת להיכנס לתא כ -10 דקות.

הזיזו את שדה הראייה לצד התעלה והתמקדו בחומר הדביק כדי להבטיח שהאדם נמצא ליד פני השטח לצורך מיקוד וכדי להתחיל בהדמיה. התאם את מיקוד מיקרוסקופ כוח הלייזר וזווית הדשא. שמור על עוצמה נמוכה כדי למנוע כל מחשוף צילום של ה-DNA המוכתם.

רכוש במהירות של 1 עד 5 פריימים לשנייה למשך מספר דקות בהתאם לקצב שכפול ה-DNA. חזור על הפעולה כדי לקבל מסלולי שכפול ארוכים יותר או עבור לשדה חדש כדי לראות מולקולות נוספות כאשר כמעט כל תערובת התגובה נשאבה לזרימת התא במאגר רב יותר עם ציט כדי לראות שדות ראייה אחרים. צילום תמונות מרובות של מולקולות משוכפלות שונות מספק סטטיסטיקה לקביעת פרודוקטיביות.

במעגל המתגלגל. מבחן שכפול סינתזת חוזק מובילה מרחיבה את הזנב המקשר בין המעגל למשטח, הזנב מומר ל-DNA דו-גדילי על ידי הגדיל המפגר פולימראז ונמתח על ידי זרימה למינרית המוצגת. הנה דוגמה לשדה ראייה עם ציט כתום בעירור של 532 ננומטר.

הכתמים הפלואורסצנטיים הקטנים הם מצעים לא משוכפלים קשורים. שימו לב לאורך הקיצוני של המוצרים ולמספר הגדול של מוצרים בכל שדה. שדה ראייה טיפוסי יראה מולקולות משוכפלות רבות הנראות כקווים בהירים הולכים וגדלים של ניסויי DNA קולי מוכתמים ב-37 מעלות צלזיוס נותנים חמש עד 50 מולקולות לכל שדה בהתאם לצפיפות פני השטח.

אזור ה-T 7 repla מתחיל בצורה יעילה הרבה יותר וישכפל יותר מ-50% מהמולקולות בשדה. עם צפיפות כה גבוהה, קשה לפתור מולקולות בודדות כפי שניתן לראות כאן. אז בצע את ניסוי T 7 בריכוזי חלבון נמוכים יותר או צפיפות פני השטח גרפים של מולקולות משוכפלות טיפוסיות מ-e coli ו-T שבעה ניסויים כוללים מסלולי קצה של מולקולות מ-e coli ו-T שבע משורטטות לעומת הזמן שבו המסלולים מותאמים לרגרסיה ליניארית כדי להשיג שיעורי שכפול, שבדוגמה זו הם 467.1 זוגות בסיסים לשנייה עבור אי קולי ו-99.4 זוגות בסיסים לשנייה.

עבור T 7, התפלגות הקצב של מסלולי מולקולה בודדת המתאימה לגאוס בודד נותנת ממוצע של 535.5 פלוס או מינוס 39 זוגות בסיסים לשנייה עבור אי קולי ו-75.9 פלוס או מינוס 4.8 זוגות בסיסים לשנייה. עבור T שבע, התפלגות האורך של תוצרי השכפול מתאימה לדעיכה מעריכית בודדת כדי להשיג פרודוקטיביות, שהיא 85.3 פלוס או מינוס 6.1 זוגות קילו-בסיס עבור אי קולי ו-25.3 פלוס או מינוס 1.7 קילו-בסיס זוגות עבור G 7. אז זה עתה הראינו לכם כיצד למדוד שכפול DNA מתואם עם מולקולות בודדות.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לתפקד כראוי את החלקות הכיסוי וליצור תעלות זרימה ישרות נקיות. הקפד לשמור על עומס כוח הלייזר ולמזער את מחשוף הצילום של ה-DNA הארוך. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.