חזותי יחיד מולקולת הדנ"א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

בטכניקה זו, כיסויות זכוכית מעובדות עם תערובת של מולקולות PEG אינרטיות ומולקולות PEG עם ביוטין. תא זרימה נוצר עם פני השטח המטופלים הללו ומונח על מיקרוסקופ TIRF. תבניות גלגול מעגלי (rolling circle) עם ביוטין נקשרות לפני השטח באמצעות סטרפטאבידין רב-ערכי.

כאשר הסובסטראטים משוכפלים על ידי הוספת חלבוני אזורי שכפול ונוקלאוטידים, ה-DNA דו-גלולי המתקבל מוארך באמצעות זרימה למינרית ומצולם בזמן אמת באמצעות צבע שזור (intercalating dye). היי, אני נתן טאנר מהמעבדה של אנטואן ואן היאן במחלקה לביוכימיה ופרמקולוגיה מולקולרית בבית הספר לרפואה של הרווארד. אני ג'ו לארו, גם אני מהמעבדה של ואן היאן.

היום נדגים לכם פרוצדורה לדימוי פלואורסצנטי של שכפול DNA בזמן אמת ברמת המולקולה הבודדת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור פעילויות מתואמות של סינתזת DNA של קומפלקס שכפול בודדים. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע היברידציה (annealing) של אוליגו הזנב הביוטינילי ל-DNA גלול אחד של M 13 על ידי הוספת עודף פי עשרה של אוליגו בבופר TBS, חימום ל-65 degrees Celsius, ולאחר מכן כיבוי של בלוק החימום כדי לאפשר קירור איטי להיברידציה תקינה של הפריימר. כעת, כאשר ה-M 13 המופעל (primed) מוכן, הוסיפו אותו לתערובת של 64 nanomolar T seven DNA polymerase ובופר שכפול T seven המכיל dNDPs ומגנזיום כלוריד, והדגירו את התגובה ב-37 degrees Celsius למשך 12 דקות. בסיום ההדגרה, עצרו את התגובה באמצעות 100 millimolar EDTA.

בשלב הבא טהרו את ה-DNA של המוצר הממולא באמצעות חילוץ בפנול, איזואמיל אלכוהול וכלורופורם, ובצעו דיאליזה אל תוך בופר TE או בופר אחסון מתאים אחר; חלצו שוב כל פאזה אורגנית כדי לשחזר שאריות של ראשים (primers). לאחר הדיאליזה, קבעו את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis. סבב אחד של הכנת התבנית יכול להפיק ריכוז ננו-מולרי של תבנית המספיק למאות עד אלפי ניסויי מולקולה בודדת.

כעת, לאחר שה-DNA מוכן, ניתן להמשיך להכנת לוחות הזכוכית הפונקציונליים. ה-DNA המיועד לשכפול נקשר ללוחות זכוכית שטופלו ב-Amil Lane; קבוצת ה-Oxy של ה-Amil נקשרת לזכוכית ומותירה קבוצת אמין פנויה לקישור מולקולות peg ביוטיניליות. ציפוי זה מסייע בהפחתת קישור לא ספציפי לפני השטח.

כדי לנקות ביסודיות את כיסורי הזכוכית, הניחו אותם בצנצנות צביעה ומלאו את הצנצנות באתנול ועבדו באולטרסאונד (sonicate). לאחר 30 דקות, שטפו את הצנצנות ומלאו אותן בקוהידרוקסיד של אשלגן בריכוז one molar ועבדו באולטרסאונד למשך 30 דקות, וחזרו על שני השטיפות. עבור תגובת הפונקציונליזציה הראשונה, יש להסיר את כל שאריות המים.

מלאו את צנכני הצביעה באצטון ובצעו סוניקציה למשך 10 דקות. רוקנו את הצנכנים ומלאו אותם שוב באצטון. המשיכו להוסיף את ריאגנט ה-sine לצנכנים וערבבו במשך שתי דקות.

לאחר מכן, בצעו השהייה (quench) בעזרת עודף גדול של מים. לאחר מכן, ייבשו את לביבות הכיסוי על ידי אפייה בתנור בטמפרטורה של 110 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הכינו תמיסת PEG בריכוז של כ-0.2% weight per volume באמצעות peg שעבר חניטה; שימוש במפריד לביבות כיסוי מזכוכית יאפשר את הפרדת לביבות הכיסוי. העבירו בפיפטה 100 µL על לביבת כיסוי סילילית יבשה.

הניחו כיסוי זכוכית שני מעל. הדגרירו את כיסויי הזכוכית בתמיסת ה-PEG למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הפרידו בין כל זוג כיסויי זכוכית ושטפו היטב במים.

הקפידו להשאיר את כיסויי הזכוכית (cover slips) כאשר הצד הפונקציונלי פונה כלפי מעלה, שכן רק צד אחד יצופה ב-peg. לבסוף, ייבשו את כיסויי הזכוכית באמצעות אוויר דחוס ואחסנו אותם בוואקום בתוך דסיקטור; המשטחים נשארים יציבים למשך חודש אחד לפחות. באופן זה ניתן להכין עשרות כיסויי זכוכית בסבב אחד ולהשתמש בהם לפי הצורך.

כעת, כאשר זכוכיות הכיסוי מוכנות, ניתן להרכיב את תא הזרימה עבור ניסוי המולקולה הבודדת. התחילו בנתינת 20 עד 25 milliliters של תמיסת חסימה המכילה BSA בתוך כלי ייבוש (desiccator) כדי להסיר בועות אוויר עבור השלבים הבאים. לאחר מכן, דללו 25 microliters של streptavidin ב-100 microliters של PBS ופזרו את התמיסה על פני זכוכית כיסוי עם פונקציונליזציית peg; הדגירה תיערך למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ל-streptavidin להיקשר לביוטין שעל פני השטח, בזמן ששאר חלקי התא מוכנים.

בזמן שהזכוכית המצפייה (cover slip) נמצאת באינקובציה, גזרו פיסה של סרט דביק דו-צדדי עם גב משני הצדדים, כך שתתאים לגודלו של נס קוורץ ששימש להרכבת תא הזרימה. סמנו בעפרון על הסרט את מיקומי חורי הצינורות, כדי שניתן יהיה לשרטט על הסרט את מתאר תא הזרימה. לאחר סימון החורים, שרטטו מלבן ברוחב שני מילימטרים מסביב לסימונים.

מלבן זה ישמש כתעלת זרימה, לכן יש לוודא שהדפנות ישרות ולהשאיר מרווח סביב כניסת ויציאת הצינורית. כעת חתכו את הסרט המסומן לאורך קווי המתאר ששורטטו, תוך ביצוע חיתוכים נקיים וישרים כדי להבטיח ששום דבק לא יבלוט אל תוך התעלה. נקו את שקופית הקוורץ ביסודיות באמצעות אצטון כדי להסיר שאריות דבק מהבניית תא הזרימה שנעשתה בניסויים קודמים.

מצא את ההתאמה המיטבית של מתבס התעלה. הסר צד אחד של מדבקת הדבק והנח בזהירות את הסרט על גבי שקופית הבסיס. הקפד ליישר את הסרט כראוי, שכן חורי הכניסה והיציאה חייבים להישאר פתוחים.

בשלב הבא, הכין את קטעי הצינור באורך המתאים, מצינור בקוטר 0.76 מילימטר, עבור הכניסה והיציאה של תא הזרימה. מומלץ לחתוך את קצה הצינור בזווית של כ-30 מעלות, כדי למנוע מהצינור להימעך כנגד תחתית התא. תלה את הצינורות על מעמדי מבחנות כדי להקל על חיבורם לתא הזרימה בשלבים הבאים.

בשלב זה דגירה של לבישCOVER slip הסתיימה. שטפו היטב את ה-cover slip המצופה ב-strep avid ENC במים ויבשו בעזרת אוויר דחוס. היזהרו לא להפוך את ה-cover slip, שכן רק צד אחד שלו פונקציונלי.

לבסוף, השלימו את הרכבת תא הזרימה על ידי הסרת הצד השני של גב הסרט והנחת פלסת הקוורץ על לוכית הכיסוי. לחצו קלות על לוכית הכיסוי כדי לדחוף החוצה אוויר שנלכד בדבק. פעולה זו תסייע במניעת חדירת בועות אוויר לתעלת הזרימה.

אטמו את דפנות התא בעזרת אפוקסי. הכניסו את הפיתול החתוך אל תוך החורים שבקוורץ, אטמו אותו במקומו עם אפוקסי והמתינו מספר דקות לייבוש. לאחר שהאיטום באפוקסי יתייבש, התחילו בחסימת הפני השטח.

השתמשו במחט בכילוי 21. שאבו חלק מה-Degas blocking buffer דרך אחד הצינורות. שטפו את המערכת מספר פעמים כדי להסיר בועות אוויר והמתינו שהתא יודגר למשך חצי שעה לפחות לפני המעבר לניסוי השכפול של מולקולה בודדת.

כעת, לאחר שמרכיב זרימה (flow cell) נחסם, הניחו אותו על במה המיקרוסקופ. קבעו את התא במקומו באמצעות תסמכי הבמה וודאו שערוץ הזרימה מיושר לאורך ציר ה-y. חברו את צינור היציאה של מרכיב הזרימה למשאבת המזרק באמצעות צינור מקשר בעל קוטר גדול יותר.

מקם את פתח הכניסה בתוך תמיסת חסימה (blocking buffer) ומשוך את בוכנת המזרק כדי להוציא אוויר מהצינור. רעידה קלה של צינור היציאה תסייע בפינוי בועות אוויר כלואות בתא הזרימה. כעת הוסף את ה-DNA; דלל את תבנית ה-DNA מהמלאי לריכוז של 25 picomolar בתוך מיליליטר אחד של תמיסת חסימה, והזרם אותה אל תוך התא בקצב זרימה מתון, כגון 0.025 milliliters per minute, למשך 30 דקות כדי לאפשר כיסוי טוב של ה-DNA על פני השטח.

לאחר שה-DNA נמצא בתא, שטפו את עודפי ה-DNA באמצעות שטיפה של חוצץ חסימה (blocking buffer wash) למשך לפחות 200 נפחי תא זרימה. כדי להסיר את כל ה-DNA החופשי, הפעילו את הלייזר ואת המצלמה. ה-CCD המקורר צריך להגיע לטמפרטורה הרצויה לפני שניתן יהיה להשתמש בו.

לאחר שטיפת עודפי DNA וניקוי הגזים מבחלק המאuר (replication buffer), הכין את תערובת תגובת השכפול הכוללת נוקלאוטידים, DTT ו-cytoxin בתוך תמיסת השכפול. לאחר מכן, הוסף את החלבונים וערבב בעדינות. לבסוף, זרימה את תערובת התגובה אל תוך תא הזרימה (flow cell).

מהירות הזרימה כאן צריכה להיות מספקת כדי למתוח DNA דו-גדילי עבור תעלת זרימה ברוחב שני מילימטרים ובגובה 100 µm. קצב של 0.04 mL/min עובד היטב. המתינו כ-10 דקות כדי לאפשר לתערובת להיכנס לתא.

הזיזו את שדה הראייה לצד הערוץ ומקדו את הפוקוס על חומר הדבקה כדי לוודא שאתם קרובים לפני השטח לצורך מיקוד ותחילת הדמיה. כווננו את הספק של הלייזר, את פוקוס המיקרוסקופ ואת זווית ה-turf. שמרו על הספק נמוך כדי למנוע פירוק פוטוכימי (photo cleavage) של ה-DNA הצבוע.

בצע רכישת תמונות בקצב של פריים אחד עד חמישה פריימים לשנייה למשך מספר דקות, בהתאם לקצב השכפול של ה-DNA. חזור על הפעולה כדי לקבל מסלולי שכפול ארוכים יותר, או עבור לשדה ראייה חדש כדי לראות מולקולות נוספות כאשר רוב תערובת התגובה כבר נשאבה לתוך התא; זרימה של בופר נוסף עם cyt תאפשר לראות שדות ראייה אחרים. צילום מספר תמונות של מולקולות משוכפלות שונות מספק נתונים סטטיסטיים לקביעת הפרודוקטיביות.

בבדיקת רפליקציית מעגל גלגול (rolling circle replication assay), סינתזה מובילה מאריכה את הזנב המקשר בין המעגל לפני השטח; הזנב הופך ל-DNA דו-גדילי על ידי הפולימרז של הגדיל המעכב ונמתח על ידי זרימה למינרית כפי שמוצג. להלן דוגמה לשדה ראייה עם צבע כתום בעירור של 532 nanometer.

הנקודות הפלואורסצנטיות הקטנות הן תבניות שאינן משוכפלות המעוגנות לפני השטח. שימו לב לאורכן המהולל של התוצרים ולמספר הרב של התוצרים בכל שדה ראייה. שדה ראייה טיפוסי יציג מולקולות משוכפלות רבות, הנראות כקווים בהירים גדלים של DNA צבוע. ניסויי E Coli בטמפרטורה של 37 °C מניבים בין חמישה ל-50 מולקולות לשדה, בהתאם לצפיפות הפני השטח.

אזור השכפול של T7 מתחיל ביעילות גבוהה בהרבה וישכפל יותר מ-50% מהמולקולות בשדה. בצפיפות גבוהה כזו, קשה להבחין בין מולקולות בודדות כפי שניתן לראות כאן. לכן, בצעו את ניסוי T7 בריכוזי חלבון נמוכים יותר או בצפיפות שטח נמוכה יותר. גרפי Chime של מולקולות משכפלות טיפוסיות מניסויי e coli ו-T7 כוללים מסלולי נקודת סיום של מולקולות מ-e coli ו-T7 הממוקמים מול הזמן; המסלולים הותאמו באמצעות רגרסיה ליניארית כדי לקבל את קצבי השכפול, אשר בדוגמה זו הם 467.1 base pairs לשנייה עבור e coli ו-99.4 base pairs לשנייה עבור T7.

עבור T7, התפלגויות הקצב של מסלולי מולקולה בודדת שהותאמו לגאוסיאנים בודדים הניבו ממוצע של 535.5 פלוס או מינוס 39 זוגות בסיסים לשנייה עבור e coli ו-75.9 פלוס או מינוס 4.8 זוגות בסיסים לשנייה. עבור T7, התפלגויות האורך של תוצרי השכפול הותאמו לדעיכה מעריכית בודדת כדי להפיק את הפרודוקטיביות, שהיא 85.3 פלוס או מינוס 6.1 קילו-זוגות בסיסים עבור e coli ו-25.3 פלוס או מינוס 1.7 קילו-זוגות בסיסים עבור G7. כעת הצגנו בפניכם כיצד למדוד שכפול DNA מתואם באמצעות מולקולות בודדות.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע פונקציונליזציה נכונה של לוחות הכיסוי וליצור תעלות זרימה נקיות וישרות. הקפידו לשמור על עומס נמוך של הספק הלייזר ולמזער פוטו-קיטוע (photo cleavage) של ה-DNA הארוך. וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.