אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות
2 בנובמבר 2009
במאמר זה אנו מתארים כיצד נקבל סריג עקבות של מולקולות דנ"א בודדות משותקת על משטח באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal.
כדי לחקור את הדינמיקה של מולקולות בודדות לאורך פרק זמן ממושך, יש תחילה למקם את המולקולות במרחב. אנו משיגים זאת על ידי קיבוען על פני השטח של תא מיקרופלואידי. ההליך מתחיל בהרכבת התא, המכיל ארבע תאים שבהם יקובעו הביומולקולות.
התאים מחוברים לחלק החיצוני באמצעות קפילרות כניסה ויציאה. התא מיוצר על ידי היתוך של דיסկ PDMS בעל תבנית לזכוכית כיסוי מסוג קוורץ. התא המורכב מורכב לאחר מכן על מיקרוסקופ פלואורסצנציה, וצינורות גמישים מחוברים לקפילרות כדי לאפשר החלפה קלה של תמיסות דרך התאים; כדי להפעיל את הפני השטח עבור קיבוע של מולקולות, זרימה ראשונה של תמיסת BSA ביוטינילי מועברת דרך אחד התעלות.
BSA ייספח לתא. לאחר מכן, זרימה של תמיסת streptavidin על פני השטח תגרום לקשירתה לביוטין. לבסוף, העבר זרימה של האוליגונוקלאוטיד הביוטינילי, שייקשר ל-streptavidin, ובכך יעגן את המולקולה הנחקרת לפני השטח של כיסוי הקוורץ.
במהלך כל תקופת הרכישה, מזרם קבוע של בופר דימוי שנועד למקסם את יציבות אורך החיים ואת העוצמה של הפלואורופורים, זורם דרך התא. המערך האוטומטי סורק מקטעים שונים של הפני השטח כדי לאתר מולקולות בעלות פלואורופורי תורם ומקבל כאחד, ולאחר מכן מעביר אותן אחת אחת אל נפח הבדיקה, תוך השגת עקבה של עוצמת פלואורסצנציה לאורך זמן עבור כל אחת מהן, עד להפוטו-بلیצ'ינג של שני הפלואורופורים. שלום, אני ניקולס דפי מהמעבדה של פרופסור מילר במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת בוסטון.
היום נדגים לכם הליך להשגת עקומות F של מולקולה בודדת מחומצות גרעיניות מקובעות באמצעות מערכת קונפוקלית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור דינמיקה של חומצות גרעיניות ואינטראקציות בין חומצות גרעיניות לאנזימים. אז בואו נתחיל.
את ה-Microfluid Excel מייצרים על ידי היתוך של דיסק פולי-דימეთיל-סילוקסאן (PDMS) בעובי שני מילימטרים בעל תבנית למשטח כיסוי של קוורץ שנקי טרי. כדי להכין את דיסק ה-PDMS בעל התבנית, ערבבו היטב 10 חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון עם חלק אחד של חומר מעקש (curing agent) ובצעו Degas למשך שעה בוואקום. לאחר ביצוע Degas לבסיס האלסטומר, מזגו אותו בעדינות לתבנית התא המיקרופלואידי.
השאירו את תערובת האלסטומר להתבשול על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 70 °C למשך שעתיים. לאחר ההבשלה, קלפו בזהירות את דיסק ה-PDMS מהתבנית בעזרת להב תער. דיסק ה-PDMS מכיל ארבע תאים מלבניים בנפח של 30 µL כל אחד.
הדביקו את הצד השטוח של דיסקי ה-PDMS, הצד שאינו מכיל את התעלים, לחלונית זכוכית בגודל אינץ' אחד, על ידי חמצון פלסמה של שני השטחים למשך 30 שניות. חלונית הזכוכית מכילה שמונה חורים בקוטר שני מילימטרים בשני קצות התעלים, אשר נקדחו מראש. לאחר מכן, הכניסו צינור קפילרי גמיש מסיליקה מותכת באורך שני אינץ' דרך כל חור בחלונית הזכוכית.
על מנת לעשות זאת, הכניסו תחילה מחט ולאחר מכן הכניסו את צינור הנימי עד שיגיע לתעלה. אטמו את החורים בחלון הזכוכית באמצעות תרכובת יציקה של סיליקון בעלת זמן ייבוש מהיר, כגון quick cast. שטפו את התעלות באתנול ובמים לאחר הפעלת פלזמה של התא ושל כיסוי קוורץ מעגלי בן שעה אחת שנקי בשיטת piranha למשך 30 שניות.
הדביקו את כיסוי הזכוכית (cover slip) לדופן התא המכיל את התעלות. התאים כעת אטומים. השאירו את התא המורכב להתייבש למשך לילה בטמפרטורת החדר.
לאחר שה-microfluid Excel המורכב עבר פילמור למשך הלילה, הוא מונח במחזיק ייעודי ומותקן על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להתחיל בהפעלת פני השטח של התא. לצורך קיבוע מולקולות, חברו צינור גמיש לקפילריות של התא כדי לאפשר הזרקת בופר באמצעות מזרק ומחט. כעת, הזריקו לתעלה תמיסה של 0.1 mg/mL biotinylated BSA בבופר A והדגירו למשך 30 דקות לפחות.
לאחר דגירה של 30 דקות, הזרם 300 עד 500 µL של בופר A כדי להסיר BSA ביוטינילי encrypted שלא נספג מהתעלה; יש להקפיד שלא יכלואו בועות אוויר בתא. לאחר מכן, הזרם תמיסה של 0.1 mg/mL STR din בבופר A ודגירה למשך 15 דקות.
לאחר דגירה של 15 דקות, העבירו 300 עד 500 µL של בופר A כדי להסיר כל strep din שלא נספג מהתעלה. כפי שנעשה קודם לכן, הימנעו מלכידת בועות אוויר בתא. לבסוף, העבירו תמיסה של 3 עד 5 pM של הדגימה הביוטינילית.
כדי לבדוק את הכיסוי של המולקולות הפלואורסצנטיות, יש לבצע סריקה של השטח. דגרו את הדגימה הביוטינילית למשך 10 דקות וחזרו על זרימת הבופר. כפי שהוצג קודם לכן, בופר הדימיג' (Imaging Buffer או IB) מורכב ממערכת אנזימטית לספיחת חמצן וממכבה טריפלט (triplet quencher) כגון trol locks, כדי להמיס תחילה את ה-IB.
המסו 5 mg של trol ב-10 mL של בופר גלוקוז באמצעות וורטקס למשך מספר דקות ונעורה למשך 10 דקות לפחות. סננו את התמיסה והשאירו אותה לניקוז גזים בוואקום למשך 10 דקות. ערבבו בעדינות את תמיסת ה-TRO lock עם התמיסה האנזימטית של Glocky, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר.
מלאו את המאגר בתמיסת ה-IB. לאחר מכן, השתמשו במשאבת מזריקים מכנית כדי לשלוט בקצב הזרימה; העבירו את ה-IB דרך התעלה בקצב קבוע של 5 µL לדקה, והנפיחו גז ארגון אל מאגר ה-IB כדי למנוע התמוססות של חמצן מהאוויר לתוך התמיסה. סריקת הפני השטח, איתור המולקולות והשגת עקומות עצימות של מולקולה בודדה מבוצעים באמצעות תוכנת LabVIEW, הסורקת שטחים של 20 על 20 µm² ברזולוציה של 0.2 µm ובקצב של 0.1 µm למילישנייה.
הנתונים מסריקת הפני השטח מעובדים באופן מיידי כדי להפיק את מיקומי הפיקסלים המשוקללים לפי עוצמה של כל הפיקסלים שמעל רמות הרקע. ברגע שנמצאים המולקולות המקובעות, הן מועברות אחת אחת אל הנפח הקונפוקאלי, ועוצמותי הדיוור (donor) והמקבל (acceptor) נרשמות כפונקציה של זמן עד להלבנה פוטוכימית (photobleaching) של שני הפלואורופורים. לאחר מכן, הבמה מתוכנתת לנוע אל נקודת מוצא חדשה, במרחק של 100 מילימטרים, ותהליך הסריקה חוזר על עצמו.
מכשיר ה-MICROFLUID Excel המורכב מוצג כאן. אלו הן סריקות פני שטח המראות מולקולות בודדות בערוצי התורם הירוק והמקבל האדום. מוצגים כאן מספר עקבות טיפוסיים של מולקולות בודדות, המראים את עוצמת המקבל באדום ואת התורם בירוק.
הרגע הראינו לכם כיצד להשיג עקבות של מולקולה בודדת ממולקולות ביולוגיות מקובעות באמצעות מערך קונפוקלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב בקפידה ולהקדיש לכך את הזמן הדרוש, שכן זהו ניסוי מאתגר. וזהו זה.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לקבלת עקבות FRET ממולקולות DNA בודדות המקובעות למשטח, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק אוטומטי. התהליך כולל לוקליזציה וקיבוע של ביו-מולקולות בתוך תא מיקרופלואידי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביופיזיקה
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- חקר של מולקולות בודדות דורש לוקליזציה מדויקת.
- תאי מיקרופלואידיקה מקלים על קיבוע (immobilization) של ביו-מולקולות.
- FRET (Förster Resonance Energy Transfer) היא טכניקה המשמשת לחקר אינטראקציות מולקולריות.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקה אוטומטית מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להשגת עקומות FRET של מולקולה בודדת.
- חקירת הדינמיקה של חומצות גרעיניות ואינטראקציות שלהן עם אנזימים.
- העמקת ההבנה של התנהגות מולקולרית לאורך זמן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבה של תא מיקרופלואידי בעל תאים מרובים.
- אימוביליזציה של מולקולות ביוטיניליות על זכוכית כיסוי קוורץ.
- זרימה של באפר דימוג לשמירה על יציבות הפלואורסצנציה.
- סריקה אוטומטית של פני השטח לרכישת עקומות של עוצמת פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- קיבוע מוצלח של חומצות גרעיניות על פני השטח.
- השגת עקומות זמן של עוצמת פלואורסצנציה עבור מולקולות בודדות.
- הדגמת יעילות השיטה בחקר דינמיקה מולקולרית.
- תובנות לגבי האינטראקציות בין חומצות גרעיניות לאנזימים.
מסקנות
- השיטה הפיתוחה מספקת גישה חסונה לחקר דינמיקה של מולקולות בודדות.
- היא מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות מולקולריות בזמן אמת.
- ניתן ליישם טכניקה זו בתחומי מחקר ביולוגיים מגוונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מדידות FRET אוטומטיות של מולקולה בודדת מאפשרות רכישה של נתוני דינמיקה ביו-מולקולרית בסביבת תפוקה גבוהה, ובכך תומכות בתיקוף המטרה באמצעות ניתוח אינטראקציות כמותי בעל רזולוציית זמן. גישה זו מפחיתה את חוסר הוודאות המכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת עקבות (traces) חזקים סטטיסטית תחת תנאים מבוקרים, ומספקת בסיס לקבלת החלטות go/no-go עבור תרפיה המכוונת לחומצות גרעין. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (lead identification) על ידי קישור התנהגות מולקולרית לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות קינטיקת קישור ושינויים קונפורמציוניים של חומצות גרעיניות מקובעות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפיות ארוכות טווח ויציבות פוטו-כימית של אינטראקציות של מולקולה בודדת.
- ערך ניבוי: מייצר עקומות זמן כמותיות המנחות את רמת הביטחון במטרה ואת מיון הפורטפוליו בהתבסס על יציבות האינטראקציה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מאושרות המקובעות לפני השטח לצורך סריקת תרכובות בהמשך, עם פלטי פלואורסצנציה עקביים.
- שחזוריות: הבטחת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות החלפת בופר מיקרו-פלואידית וסביבות עם בקרה על רמת החמצן בין חזרות שונות.
- מדרגיות: מאפשרת בדיקה אוטומטית של אלפי מולקולות במהלך הלילה, ובכך תומכת במערכי סריקה בעלי תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת נתוני אינטראקציה משלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי שמירה על תנאי באפר רלוונטיים למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה מנגנוני אינטראקציה בין חומצות גרעין לאנזימים, ובכך מפחיתה עמימות באסטרטגיות של מודולציית מטרה.
- קידום מותאם סיכונים: תומכת בהחלטות go/no-go באמצעות אספקת פרופילי אינטראקציה בעלי מובהקות סטטיסטית תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומאפשרת הערכה כמותית של אינטראקציות ביו-מולקולריות לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיית גילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי פיתרון של דינמיקה בזמן אמת של חומצות גרעיים מקובעות.
- סריקה: מספקת פלטפורמות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה, עם פלטים של פלורסצנציה כמותית להערכה אמינה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת לוקליזציה המשוקללת לפי עוצמה ועקבות של תורם/מקבל בפתרון זמן המאפשרים ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: שומרת על בקרת סביבה (חמצן, טמפרטורה) כדי לתמוך ברציפות מהשלב הגילוי ועד לתיקוף של אינטראקציות פרה-קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת אוטומטית וניתנת לשימוש חוזר לניתוח מתמשך של מולקולה בודדת על פני מספר מטרות ופרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות תצפית ישירה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות בקרה מיקרופלואידית וסריקה אוטומטית.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go), מעלה את יעילות ההון ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות לחומצות גרעין.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכון והחלטות קידום המבוססות על מדדי יציבות אינטראקציה כמותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבה מיקרופלואידית, כימיה של פני שטח והפעלה של מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי במכשור הכולל מערכות סריקה קונפוקליות, משאבות מזרק ויחידות בקרה סביבתית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להכנת בופר, פסיבציה של פני השטח וניתוח נתונים.
- כולל שיקולי התאמה לסוגים שונים של ביו-מולקולות ולכימיות של קיבוע פני שטח.
- כולל מגבלות מעשיות כגון נקודות סיום של דה-פגמנטציה פוטו-כימית (photobleaching) ויעילות פסיבציה של פני השטח המשפיעה על צפיפות המולקולות ועל איכות העקבות.
