Name: אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: למד שיטה לקבלת עקבות FRET ממולקולות DNA בודדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק אוטומטי. השיטה מאפשרת חקר דינמיקת חומצות גרעין ואינטראקציות עם אנזימים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים צ&#39;נדרן Sabanayagam על עזרתו בפיתוח המערכת, יהושע אדל עצה בעיצוב המכשיר microfluidic והצוות במכון רולנד באוניברסיטת הרווארד עבור עיבוד חלקים של ההתקנה. אנו מכירים דיונים מועילים עם חברי הקבוצה של מלר במכון רולנד ואת באוניברסיטת בוסטון, וחברי קבוצת ט &#39;הא&#39; s ב UIUC מידע מועיל. לבסוף, אנו מעריכים את התמיכה הכספית של הקרן הלאומית למדע (PHY-0701207) לבין המכון הלאומי לבריאות (GM075893).

1 - הרכבת תא microfluidic התא microfluidic נעשית על ידי פיוזינג בדוגמת, 2 מ&quot;מ עובי, polydimethylsiloxane (PDMS) דיסק לחמוק נוקה לאחרונה כיסוי קוורץ. הדיסק מכיל ארבעה PDMS 30 חדרי מלבני μl הנגישים מפרצון ו לשקע גמישה נימים מחובר למאגר חיץ ומשאבה מזרק, בהתאמה, עבור זרימה מבוקרת של המאגר. התא זרימה נתמך על הצד האחורי שלה על ידי חלון זכוכית והניחו על בעל מחוייט תא המכיל מים מקורר אלמנט תרמואלקטרי כדי לווסת את הטמפרטורה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את PDMS בדוגמת דיסק, לערבב 10 חלקים אלסטומר בסיס סיליקון עם סוכן 1 לרפא חלק, ומערבבים היטב ולהשאיר degassing שעה 1 בוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות יוצקים את תערובת אלסטומר עובש על התא microfluidic. במקרה שלנו, מדובר 1 &quot;פרוסות סיליקון עם ארבע רצועות (1x10 1x10 4 x 3 x 300 מיקרומטר) עשוי photoresist שלילית. תשאיר את זה לרפא על צלחת חמה ב 70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות מקלפים את הדיסק PDMS נרפא מהתבנית בעזרת סכין גילוח. נתיך את הדיסק על החלון&#39;&#39;1 כוס (המכיל 8 x 2 מ&quot;מ בקוטר טרום קדח חורים בשני הקצוות של הערוצים) על ידי פלזמה חמצון שני משטחים למשך 30 שניות. נתיך חלונות זכוכית על הצד השטוח של הדיסק PDMS (הצד לא המכיל את ערוצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 2 אינץ&#39; בצינור ארוך וגמיש סיליקה התמזגו נימי דרך כל חור בחלון של זכוכית עד שהוא מגיע לערוץ. החדרת מחט הראשון ולאחר מכן הבאים עם נימי עשוי להקל על התהליך הזה. חותם את חלון זכוכית חורים באמצעות יציקת סיליקון ריפוי מהיר תרכובת כגון יצוקה-Kwik. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את ערוצי עם אתנול ומים, פלזמה להפעיל את התא יחד עם תלוש לנקות טרי, מכסים עגולים 1 אינץ&#39; קוורץ למשך 30 שניות. אנו ממליצים לנקות את תלוש לכסות באמצעות פיראניה *. הפתיל להחליק לכסות לצד של התא המכיל את הערוצים, איטום לתאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התא התאספו כדי לרפא לילה בטמפרטורת החדר. </li></ol> * Piranha הוא פתרון של H 2 O 2 ו - H 2 SO 4 ב 1:2.5 הפרופורציות. כדי לנקות את מכסה מחליק, לטבול אותם פיראניה על 90 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. 2 - הפעלת משטח immobilization מולקולה עבור מחקרים חומצות גרעין, immobilization הפשוטה ערכת השטח כוללת ציפוי הראשון זכוכית או להחליק לכסות עם קוורץ biotinylated אלבומין בסרום שור (BSA) ולאחר מכן עם streptavidin. זה מאפשר דגימה biotinylated להיות משותק עם סגוליות גבוהה במשך ימים בטמפרטורת החדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינור גמיש כדי הנימים להזרקה חיץ קל באמצעות מזרק ומחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA biotinylated במאגר (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, מסונן באמצעות מסנן 0.02 מיקרומטר) לתוך הערוץ דגירה של לפחות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 300-500 תזרים μl של חיץ כדי להסיר כל BSA biotinylated בחינם מערוץ, נזהרים שלא מלכודת כל בועות אוויר בתוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​streptavidin במאגר ו דגירה במשך 15 דקות. ואז לחזור על שלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה דרך פתרון 3-5 PM המדגם biotinylated. בצעו סריקה של פני השטח כדי לבדוק את הכיסוי של מולקולות ניאון. אם יש צורך, להגדיל את הריכוז מדגם ולקבל כיסוי טוב יותר. דגירה של 10 דקות ולחזור על שלב 3. </li></ol> התא microfluidic הוא רכוב על הבמה ממונע xy המאפשר תנועה גס (עד 25 מ&quot;מ) באמצעות מקודד אופטית מנועי DC, תנועה קנס (1 ננומטר) באמצעות שני לולאה סגורה מפעילים piezo (פיזיק Instrumente דגם M-014 או דומה). ניתן לעשות זאת לפני או אחרי הפעלת משטח immobilization המדגם. 3 - הכנת מאגר הדמיה (IB) IB מורכב של מערכת החמצן האנזימטית הדחה וכן מרווה משולשת, כגון Trolox. מאז IB הוא הסמיק עד לילה כל הזמן, לפחות 10 מ&quot;ל צריכים להיות מוכנים מראש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 0.8% w / v D-גלוקוז, לפחות 35 מ&quot;מ טריס-HCl pH 8.0 ו - 50 mM NaCl במים deionized. ריכוז גבוה של חיץ חשוב משתי סיבות: Trolox המסת יהיה להפוך לחומצה הפתרון, ואת התגובה האנזימטית יהיה גם להוריד את ה-pH של התמיסה לאורך זמן. מאז הפתרון הזה יש חיי מדף ארוכים זה יכול להיות מאוחסן כפתרון המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג Trolox במאגר שהוכנו על ידי vortexing שלב 1 במשך כמה דקות ולאחר מכן רעד במשך 10 דקות&gt;. Trolox אינו מסיס מאוד במים ב-pH&gt; 7, ולכן לא ממהרים שלב זה. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר לסנן ולהשאיר degassing בוואקום במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון &quot;gloxy&quot; אנזימטית על ידי ערבוב 60 wate μlr, 20 μl של חיץ 5X, 20 μl של Catalase, 1 מ&quot;ג גלוקוז אוקסידאז 100 μl של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA. סנן את הפתרון באמצעות צנטריפוגות לסנן 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבים את החיץ בין שלב 2 עם פתרון &quot;gloxy&quot; מ שלב 3 למנוע את היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים IB דרך ערוץ בקצב קבוע של μl 5 / min באמצעות משאבת מזרק מכני לשלוט על קצב הזרימה. הבועה ארגון גז לתוך המאגר IB למנוע חמצן אטמוספרי מ מחדש מתמוססת לתוך המאגר. </li></ol> סריקת המשטח, לוקליזציה מולקולה ורכישת עקבות עוצמת יחיד מולקולה נשלטת על ידי תוכנית LabVIEW המאפשר איסוף נתונים אוטומטיים 1. התוכנית סורקת 20x20 2 תחומי מיקרומטר ברזולוציה של 0.2 מיקרומטר, עם שיעור של 0.1 מיקרומטר / MS. הנתונים מעובדים מיד בעוצמה תשואה משוקלל מיקומם של כל הפיקסלים מעל ספירות הרקע. לאחר מולקולות משותקת נמצאים, הם עברו אחד אחד לתוך נפח confocal ואת עוצמות של התורם fluorophore acceptor נרשמות כפונקציה של זמן עד photobleach fluorophores שניהם. השלב מתוכנת ואז לעבור מקור חדש 100 מיקרומטר משם, תהליך הסריקה הוא חזר. 4 - תוצאות נציג להלן כמה תמונות מראה את התא microfluidic התאספו לפני הפעלת פני השטח לאחר רכוב על המיקרוסקופ מוכן immobilization מולקולה. אם הערוץ מופעל בהצלחה, סריקות השטח צריך להיות דומה סריקות המתואר להלן מראה פליטה של ​​התורם צבען (ירוק) ו - acceptor (אדום) לאחר עירור התורם ישיר. מולקולות אלו עברו אחד אחד לתוך נפח חיטוט את הקרינה מתועד לאורך זמן עד photobleach צובעת שניהם, כפי שמוצג עקבות מולקולה בודדת. מאת עקבות כמו אלה יכולים להשיג את היעילות סריג אשר מודיע על ההפרדה-acceptor התורם מיידי, אשר בתורו משמש כדי לחקור את המבנה והדינמיקה של מולקולות ביולוגיות של עניין. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /> איור 1: תא Microfluidic עם ארבעה ערוצים, כל אחד עם כניסה / יציאה הנימים. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /> איור 2: תא רכוב על המיקרוסקופ מוכן למדידות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" /> איור 3: תוכנית ההתקנה של SM-סריג מדידות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="איור 5" border="0" /> איורים 4 ו -5: הערוץ האדום והירוק של סריקה של פני השטח משותקת סריג מולקולות נרגש עם לייזר ירוק. אנא לחץ כדי לראות גרסה גדולה יותר של <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">דמות 4</a> , או <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">דמות 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="איור 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="איור 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="איור 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="איור 9" border="0" /> איורים 6, 7, 8 ו 9: מסלולי אינטנסיביות של התורם (ירוק) ו - acceptor (אדום) fluorophores שכותרתו מולקולת הדנ&quot;א 8, 10, 16 ו - 18 basepairs מזה. אנא לחץ כדי לראות גרסה גדולה יותר של <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">6 דמות</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">דמות 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">8 דמות</a> , או <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">דמות 9</a> .

<ol><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Techniques%2C+a+Laboratory+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22CSHL+Press%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Pys.+Letters%22%5BJournal%5D)">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li>
<li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules%3A+Corrections+due+to+nonideal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li>
<li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.</li>
</ol>

אף על פי הפרוטוקול הנ&quot;ל כבר מותאם במיוחד עבור המערכת שלנו עבור בחירה ספציפית של צבעים (ת.מ. ר ו ATTO647N), הוא בהחלט לא השיטה הוכיחה בלבד. לאחרונה, מערכת חמצן חלופי הדחה המורכב של חומצה protocatechuic (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) הוצגה כדי להגדיל את photostability של צבעים מסוימים 4. כמו כן, מדינות אחרות שלישיה quenchers כגון mercaptoethanol-β (BME) יכול לשמש במקום Trolox, אם כי אלה לא יכול לדכא לאורך זמן מצמוץ של צבעים מסוימים, בפרט Cy5 5. למרות immobilization דרך ביוטין-streptavidin-biotinylated אלבומין בסרום שור (BSA) היא הבחירה המועדפת עבור מחקרים חומצות גרעין, פוליאתילן גליקול (PEG) מצופה משטח מתאים יותר מחקרים של חלבונים שכן היא שוללת הלא ספציפית הידבקות 1. בנוסף, תת עקיפה מוגבל שלפוחית ​​בגודל ניתן לתמצת את biomolecule של עניין במקרים שבהם הוא יכול להיות מושפע אינטראקציות פני 6. במאמר זה אנו השתמשו ההתקנה confocal מצויד photodiodes סיליקון מפולת לרכוש את עקבות עוצמת הקרינה. פרוטוקול זה עובד באותה מידה עם סך פנימית הקרינה מיקרוסקופים השתקפות (TIRF) מצויד מצלמות CCD. השתמשו משנה מיקרוסקופיה, SM-סריג יכול להודיע ​​על החלטות מרחביות מתקרב אנגסטרום כאשר התורם אות acceptor מתוקנות כראוי 7.

<table><tbody><tr><td>צינור נימי מסיליקה מותכת</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP150375</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית קוורץ (Fused silica)</td><td>Esco Products</td><td>R425000</td><td></td></tr><tr><td>צינוריות</td><td>Diba Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA ביוטינילי (Biotinylated BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9085</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטאווידין</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>0021122</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לאלסטומר Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td>ערכה לאלסטומר סיליקון</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>קטלז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3155</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>חומר איטום Kwik-Cast</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kwik-Cast</td><td>תרכובת יציקה מסיליקון</td></tr></tbody></table>

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של surface-משותקת ביומולקולות

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

פלואורסצנטי תהודה העברת אנרגיה (סריג) מיקרוסקופיה כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את המבנה והדינמיקה של מולקולות ביולוגיות של עניין, כמו חומצות גרעין וחלבונים. מולקולה בודדת סריג (SM-סריג) מדידות על מולקולות משותקת היתר תצפיות ארוכות של מערכת יעילה עד צובעת הן photobleach, וכתוצאה מכך זמן עקבות כי דיווח על הדינמיקה biomolecular עם מגוון רחב של לוחות הזמנים של אלפיות דקות. כדי להקל על רכישת מספר גדול של עקבות עבור ניתוחים סטטיסטיים, התהליך חייב להיות אוטומטי והסביבה מדגם צריך להיות פיקוח הדוק לאורך זמן המדידה כולו (~ 12 שעות). מטרה זו מושגת באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal המאפשר חקירה של אלפי מולקולות בודדות הלילה, תא microfluidic המאפשר החליפין מבוקר של המאגר, עם תכולת החמצן מוגבלת ושומר על טמפרטורה קבועה לאורך כל תקופת המדידה כולה. כאן אנו מראים כיצד להרכיב את המכשיר microfluidic וכיצד להפעיל פני השטח שלו במשך immobilization DNA. אז אנחנו מסבירים כיצד להכין חיץ על מנת למקסם את photostability ואת משך החיים של fluorophores. לבסוף, אנו מראים את הצעדים מעורבים בהכנת ההתקנה לרכישת אוטומטיות מולקולות הזמן לפתור אחת סריג עקבות של מולקולות דנ&quot;א.

במאמר זה אנו מתארים כיצד נקבל סריג עקבות של מולקולות דנ&quot;א בודדות משותקת על משטח באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

מיקרוסקופיית העברה של אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) נמצאת בשימוש נרחב לחקר המבנה והדינמיקה של מולקולות בעלות עניין ביולוגי, ...

כדי לחקור את הדינמיקה של מולקולות בודדות לאורך פרק זמן ממושך, יש תחילה למקם את המולקולות במרחב. אנו משיגים זאת על ידי קיבוען על פני השטח של תא מיקרופלואידי. ההליך מתחיל בהרכבת התא, המכיל ארבע תאים שבהם יקובעו הביומולקולות.התאים מחוברים לחלק החיצוני באמצעות קפילרות כניסה ויציאה. התא מיוצר על ידי היתוך של דיסկ PDMS בעל תבנית לזכוכית כיסוי מסוג קוורץ. התא המורכב מורכב לאחר מכן על מיקרוסקופ פלואורסצנציה, וצינורות גמישים מחוברים לקפילרות כדי לאפשר החלפה קלה של תמיסות דרך התאים; כדי להפעיל את הפני השטח עבור קיבוע של מולקולות, זרימה ראשונה של תמיסת BSA ביוטינילי מועברת דרך אחד התעלות.BSA ייספח לתא. לאחר מכן, זרימה של תמיסת streptavidin על פני השטח תגרום לקשירתה לביוטין. לבסוף, העבר זרימה של האוליגונוקלאוטיד הביוטינילי, שייקשר ל-streptavidin, ובכך יעגן את המולקולה הנחקרת לפני השטח של כיסוי הקוורץ.במהלך כל תקופת הרכישה, מזרם קבוע של בופר דימוי שנועד למקסם את יציבות אורך החיים ואת העוצמה של הפלואורופורים, זורם דרך התא. המערך האוטומטי סורק מקטעים שונים של הפני השטח כדי לאתר מולקולות בעלות פלואורופורי תורם ומקבל כאחד, ולאחר מכן מעביר אותן אחת אחת אל נפח הבדיקה, תוך השגת עקבה של עוצמת פלואורסצנציה לאורך זמן עבור כל אחת מהן, עד להפוטו-بلیצ'ינג של שני הפלואורופורים. שלום, אני ניקולס דפי מהמעבדה של פרופסור מילר במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת בוסטון.היום נדגים לכם הליך להשגת עקומות F של מולקולה בודדת מחומצות גרעיניות מקובעות באמצעות מערכת קונפוקלית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור דינמיקה של חומצות גרעיניות ואינטראקציות בין חומצות גרעיניות לאנזימים. אז בואו נתחיל.את ה-Microfluid Excel מייצרים על ידי היתוך של דיסק פולי-דימეთיל-סילוקסאן (PDMS) בעובי שני מילימטרים בעל תבנית למשטח כיסוי של קוורץ שנקי טרי. כדי להכין את דיסק ה-PDMS בעל התבנית, ערבבו היטב 10 חלקים של בסיס אלסטומר סיליקון עם חלק אחד של חומר מעקש (curing agent) ובצעו Degas למשך שעה בוואקום. לאחר ביצוע Degas לבסיס האלסטומר, מזגו אותו בעדינות לתבנית התא המיקרופלואידי.השאירו את תערובת האלסטומר להתבשול על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 70 °C למשך שעתיים. לאחר ההבשלה, קלפו בזהירות את דיסק ה-PDMS מהתבנית בעזרת להב תער. דיסק ה-PDMS מכיל ארבע תאים מלבניים בנפח של 30 µL כל אחד.הדביקו את הצד השטוח של דיסקי ה-PDMS, הצד שאינו מכיל את התעלים, לחלונית זכוכית בגודל אינץ' אחד, על ידי חמצון פלסמה של שני השטחים למשך 30 שניות. חלונית הזכוכית מכילה שמונה חורים בקוטר שני מילימטרים בשני קצות התעלים, אשר נקדחו מראש. לאחר מכן, הכניסו צינור קפילרי גמיש מסיליקה מותכת באורך שני אינץ' דרך כל חור בחלונית הזכוכית.על מנת לעשות זאת, הכניסו תחילה מחט ולאחר מכן הכניסו את צינור הנימי עד שיגיע לתעלה. אטמו את החורים בחלון הזכוכית באמצעות תרכובת יציקה של סיליקון בעלת זמן ייבוש מהיר, כגון quick cast. שטפו את התעלות באתנול ובמים לאחר הפעלת פלזמה של התא ושל כיסוי קוורץ מעגלי בן שעה אחת שנקי בשיטת piranha למשך 30 שניות.הדביקו את כיסוי הזכוכית (cover slip) לדופן התא המכיל את התעלות. התאים כעת אטומים. השאירו את התא המורכב להתייבש למשך לילה בטמפרטורת החדר.לאחר שה-microfluid Excel המורכב עבר פילמור למשך הלילה, הוא מונח במחזיק ייעודי ומותקן על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להתחיל בהפעלת פני השטח של התא. לצורך קיבוע מולקולות, חברו צינור גמיש לקפילריות של התא כדי לאפשר הזרקת בופר באמצעות מזרק ומחט. כעת, הזריקו לתעלה תמיסה של 0.1 mg/mL biotinylated BSA בבופר A והדגירו למשך 30 דקות לפחות.לאחר דגירה של 30 דקות, הזרם 300 עד 500 µL של בופר A כדי להסיר BSA ביוטינילי encrypted שלא נספג מהתעלה; יש להקפיד שלא יכלואו בועות אוויר בתא. לאחר מכן, הזרם תמיסה של 0.1 mg/mL STR din בבופר A ודגירה למשך 15 דקות.לאחר דגירה של 15 דקות, העבירו 300 עד 500 µL של בופר A כדי להסיר כל strep din שלא נספג מהתעלה. כפי שנעשה קודם לכן, הימנעו מלכידת בועות אוויר בתא. לבסוף, העבירו תמיסה של 3 עד 5 pM של הדגימה הביוטינילית.כדי לבדוק את הכיסוי של המולקולות הפלואורסצנטיות, יש לבצע סריקה של השטח. דגרו את הדגימה הביוטינילית למשך 10 דקות וחזרו על זרימת הבופר. כפי שהוצג קודם לכן, בופר הדימיג' (Imaging Buffer או IB) מורכב ממערכת אנזימטית לספיחת חמצן וממכבה טריפלט (triplet quencher) כגון trol locks, כדי להמיס תחילה את ה-IB.המסו 5 mg של trol ב-10 mL של בופר גלוקוז באמצעות וורטקס למשך מספר דקות ונעורה למשך 10 דקות לפחות. סננו את התמיסה והשאירו אותה לניקוז גזים בוואקום למשך 10 דקות. ערבבו בעדינות את תמיסת ה-TRO lock עם התמיסה האנזימטית של Glocky, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר.מלאו את המאגר בתמיסת ה-IB. לאחר מכן, השתמשו במשאבת מזריקים מכנית כדי לשלוט בקצב הזרימה; העבירו את ה-IB דרך התעלה בקצב קבוע של 5 µL לדקה, והנפיחו גז ארגון אל מאגר ה-IB כדי למנוע התמוססות של חמצן מהאוויר לתוך התמיסה. סריקת הפני השטח, איתור המולקולות והשגת עקומות עצימות של מולקולה בודדה מבוצעים באמצעות תוכנת LabVIEW, הסורקת שטחים של 20 על 20 µm² ברזולוציה של 0.2 µm ובקצב של 0.1 µm למילישנייה.הנתונים מסריקת הפני השטח מעובדים באופן מיידי כדי להפיק את מיקומי הפיקסלים המשוקללים לפי עוצמה של כל הפיקסלים שמעל רמות הרקע. ברגע שנמצאים המולקולות המקובעות, הן מועברות אחת אחת אל הנפח הקונפוקאלי, ועוצמותי הדיוור (donor) והמקבל (acceptor) נרשמות כפונקציה של זמן עד להלבנה פוטוכימית (photobleaching) של שני הפלואורופורים. לאחר מכן, הבמה מתוכנתת לנוע אל נקודת מוצא חדשה, במרחק של 100 מילימטרים, ותהליך הסריקה חוזר על עצמו.מכשיר ה-MICROFLUID Excel המורכב מוצג כאן. אלו הן סריקות פני שטח המראות מולקולות בודדות בערוצי התורם הירוק והמקבל האדום. מוצגים כאן מספר עקבות טיפוסיים של מולקולות בודדות, המראים את עוצמת המקבל באדום ואת התורם בירוק.הרגע הראינו לכם כיצד להשיג עקבות של מולקולה בודדת ממולקולות ביולוגיות מקובעות באמצעות מערך קונפוקלי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע כל שלב בקפידה ולהקדיש לכך את הזמן הדרוש, שכן זהו ניסוי מאתגר. וזהו זה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

אנו מציגים את הליך ההתקנה והניסוי להשגת נתוני smFRET מרשתות תורמים-מקבלות גדולות עם מיקרוסקופ TIRF. הניתוח שלב אחר שלב של מדידות אלו עם תוכנת ההסקה הבייסיאנית Fast-NPS מניב מידע מבני ברזולוציה גבוהה באמצעות יישום מודלים מותאמים של צבע.

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב לביצוע מדידות FRET מדויקות מתוקנות במלואן על ביומולקולים בודדים, המפזרים בחופשיות באמצעות קוד פתוח, smfBox זול, החל מהפעלת, דרך יישור ומיקוד, לאיסוף וניתוח נתונים.

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לחקר הגמישות והדינמיקה המקומית של ביומולקולות באמצעות אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ברמת מולקולה בודדת במצב מיקרוסקופיה קונפוקלית.

אניזוטרופיה פלואורסצנטית שנפתרה בזמן ממולקולות בודדות לאפיון גמישות מקומית בביו-מולקולות

פרוטוקול זה מתאר סימון נוגדן יחיד (SAL) לפתרון הארגון המרחבי בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה. על ידי ניצול אינטראקציות מצטברות בין נוגדנים לאפיטופים ברמת המולקולה היחידה, SAL ממברנה (mSAL) ממפה התפלגות אפיטופים מקומיות תוך כדי לכידת התנהגות קשירת נוגדנים בסביבה התאית הטבעית.

מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד

למד שיטה לקבלת עקבות FRET ממולקולות DNA בודדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק אוטומטי. השיטה מאפשרת חקר דינמיקת חומצות גרעין ואינטראקציות עם אנזימים בזמן אמת.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

גלה סרטונים נוספים