Name: טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-10T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: למדו את שיטת FACS לבידוד תאי B ו-CD4 T ממושקעי עכברים בתחום האימונולוגיה והביולוגיה התאית. פרוטוקול זה מספק שיעורי החלמה גבוהים של 85-90% ומאפשר ניתוח ביולוגי מדויק של אוכלוסיות תאים טהורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות Cashdollar ד&quot;ר ביל תמיכתו בשימוש Core cytometry הזרימה.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים את התהליך, את הפריטים הבאים צריכים להיות מוכנים אסף: <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל עבור תאים מכתים ו 12 x 75 מ&quot;מ עבור זרימת צינורות מכתים צבע שולט יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים חיץ: פוספט בופר סליין (PBS) + 3% עוברית עגל בסרום (FCS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fc לחסום (אם נדרש) ונוגדנים מכתים. נוגדנים צריך להיות טיטרציה עבור מכתים אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצוי חרוזים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ השעיה: תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypan כחול hemocytometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מסננת (40 ניילון מיקרומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף צינורות: שני סוגים של צינורות איסוף ניתן להשתמש א) 12 x 75 מ&quot;מ צינורות פוליסטירן (המכיל 300 FCS μl ו HEPES 25 מ&quot;מ) או ב) 15 מ&quot;ל צינורות חרוטי (המכיל 1 + 25 מ&quot;ל FCS HEPES mM). כל מדיום עשיר עם ריכוז בסרום גבוהה יכול לשמש אוסף של תאים ממוינים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעיה תא בודד של האוכלוסייה תא ההתחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להעשיר לאוכלוסייה התא הרצוי על ידי שיטה לטיהור בתפזורת כגון דלדול משלימים או מיון מגנטי. היתרון העיקרי של צעד ההעשרה היא שזה מפחית את זמן המיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם תאים מכתים חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend התאים מכתים חיץ בריכוז של עד 50 x 10 6 עבור מכתים יעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: עבור תאים להביע רמות גבוהות של FCR, לחסום את הקולטנים באמצעות שיטה חסימת המתאים. שיטת הבחירה היא השימוש MAB הנקשרת FcγR על קרח למשך 10-15 דקות. נוגדנים אלה זמינים מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מב המתאים (בריכוז קבוע מראש) להכתים את אוכלוסיית התאים הרצויים דגירה של 20-30 דקות על הקרח בחושך, ואחריו שני שוטף עם חיץ מכתים. אופציונלי: צביעה עם צבע חיוניים, כגון יודיד propidium, ניתן לכלול להבחין תאים מתים (5). אם צבע רב מכתים היא לשמש, צבע שולט יחיד נדרשים. אנו משתמשים CompBeads BD להכין צבע שולט יחיד באמצעות פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא באמצעות נוגדנים מצומדות ישירות, חזור על שלב 7 באמצעות נוגדנים משני מתאים או המצומד streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, resuspend התאים בינוני תרבות לקבוע את ריכוז התאים בעזרת צבע חיוניים כגון Trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז התא 15-20 x 10 6 / ml. לגבי אוכלוסיות תא אשכולות טופס, אשר עלול להדביק את המכשיר במהלך מיון, סינון התאים דרך מסננת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת לייעל את סדרן התא. תהליך הגדרת זרימה cytometer מגוונת בהתאם בייצור צריך להיות מבוצע על ידי צוות מיומן כראוי. המלצות כלליות הן כדלקמן: <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את זרבובית המתאים בהתאם לסוג התא להיות מסודר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך מיני סטרילי, לעקר את המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע בקרת איכות מכשיר עם חרוזים לאמת לייזרים מתפקדים, והוא מיון במדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת המכשיר אוסף נדרש להגדיר את הזרמים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תראו לייזר של המכשיר גלאי להגדיר כדי לקבוע את תוויות ניאון כי ניתן להשתמש (BD שלנו FACS Aria יש שלושה לייזרים יכול לזהות עד תשעה צבעים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שזה נקבע מה תוויות ניאון ישמש על סדרן התא, הפיצוי ניתן לבצע (כפי שמוסבר בהמשך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פיצוי באמצעות מדגם שליטה שלילית שולטת חיובית אחת. פיצויים יש צורך להסיר את ספקטרום חפיפה בין שני הגלאים. זה רלוונטי לציין פיצוי שאינו טיפש הוכחה והוא מושפע לרעה כמה סמנים מסוימים כתם בהיר, ועל ידי הקרינה של תאים בעלי autofluorescence נמוך אשר יכול להוביל ברזולוציה נמוכה בין אוכלוסיות עמום שלילית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, העיצוב הניסוי יכלול שימוש fluorochromes בהיר עם סמנים כי יש ביטוי נמוך או שאין להם דפוס מכתים ידוע. סמנים המספקים הפרדה טובה בין אוכלוסיות תאים באים לידי ביטוי מאוד להשתמש עם דימר fluorochromes כגון אלה נרגש לייזרים אדום או סגול. <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיצוי ניתן לבצע עם חרוזים פיצויים, אשר microparticles קלקר, כי כבר מצמידים את נוגדן ספציפי שרשרת האור של איג קאפה מתוך עכבר, חולדה, או חולדה / אוגר. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophore זהה דגימות הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תבנית הכוללת עלילה bivariate לתצוגה פיזור קדימה (FSC) ולפזר צד (SSC), ואחד היסטוגרמה עבורכל fluorochrome אשר ישמשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שפופרת שליטה שלילי ולהתאים את פיזור קדימה (FSC) ולפזר לוואי (SSC) למקום אוכלוסייה של הריבית על קנה מידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדרות PMT הקרינה למקום האוכלוסייה autofluorescence שלילי או בחלק השמאלי המרוחק של ההיסטוגרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את שפופרת שליטה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את צינורות יחיד מלאה חיובי ולהקליט את הנתונים עבור כל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציור השער המרווח סביב החלק החיובי של נתוני היסטוגרמה, ועוד שער מרווח על החלק השלילי של ההיסטוגרמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיצוי נעשה באופן ידני על ידי התאמת הממוצע (חציון הוא להעריך טוב יותר את הנטייה המרכזית מאשר הממוצע בסולם לוגריתמי) של תוצאות חיוביות עד שהוא שווה לחציון של הדברים השליליים. זה חייב להיעשות עבור כל התוויות fluorochrome השתמשו בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתאים את החציון, להתאים את הערכים חפיפה ספקטרלית או גבוה או נמוך עד חציונים עבור כל משחק פרמטר פלורסנט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיצוי יכול להיעשות גם באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח. פיצוי אוטומטי משתמשת בנתונים רשמה שולטת פיצוי לחשב מטריצה ​​אלגברית לכל fluorophores השתמשו בניסוי. ערכים אלה משמשים כדי להפחית את התרומות הלא העיקרי צבעים דימום לתוך גלאי של צבע ראשוני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את מדגם ניסיוני להיות מסודר ולהשתמש בכלים gating ושיטות subsetting להגדיר את האוכלוסיות של עניין. <ol style="list-style-type:lower-roman;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תבנית ניסיונית עם עלילה נקודה המציג FSC מול SSC ו להשתמש בכלי gating, מצולע, מלבן, רווח או ברבע לשער האוכלוסייה של עניין. העלילה פיזור מציג את המאפיינים הפיזיים של התא אשר ברורים לסוג התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדרך הטובה ביותר לקבוע את אסטרטגיית gating הקרינה היא להשתמש פלואורסצנציה מינוס אחד (FMO) שולטת. בתוך שפופרת מלאה FMO ריאגנטים כל המשמשים בניסוי כלולים למעט עניין אחד. FMO מסייע להבחין בין אוכלוסיות מוכתם במעומעם אוכלוסיות שלילית רחבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נתונים רשמה צינורות FMO כדי לקבוע היכן למקם את השערים בתוך שפופרת הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השערים נקבעו, השערים ניתן לבחור למיון לתוך צינורות איסוף חיצוני. עד ארבעה שערים (או אוכלוסיות) ניתן למיין בבת אחת בהתאם המכשור זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שפופרת מדגם ניסיוני 4 ° C, להפעיל צלחות סטיה, ולמיין את המדגם. 5 x 10 x 10 5 -1.5 6 תאים ניתן למיין לתוך צינור 12 מ&quot;מ ו 75 x 1.5 x 10 6-4.5 x 10 6 תאים ניתן למיין לתוך 15 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מספר נדרש של תאים התקבל, באופן ידני להפסיק מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח שלאחר מיון כדי לקבוע את הטוהר של אוכלוסיות תאים ממוינים. </li></ol> נציג תוצאות הראינו כאן תוצאות עבור B עכבר הטחול ואת תא T מסוג CD4 מיון (איור 1). Splenocytes הוכתמו PE טקסס אדום מצומדות אנטי עכבר B220 TCRβ, אנטי עכבר FITC-מצומדות ו Alexafluor-700-מצומדות אנטי עכבר CD4 כדי לזהות תאים B (B220-TCRβ +) ו-T מסוג CD4 תאים (CD4 + + TCRβ ). מיון בוצעה עם מכשיר BD Aria FACS. לאחר מיון על טוהר תא B היה&gt; 97% ואת תא טוהר T מסוג CD4 היה&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. טוהר של תאים B ו-T מסוג CD4 הטחול תאים לאחר FACS. Splenocytes עכבר הוכתמו עכבר אנטי, TCRβ B220 ו נוגדנים CD4. עבור תאים ב FACS בוצעה באמצעות FACS BD Aria gating על ידי B220 + TCRβ תאים (איור 1 א &#39;, הפאנל השמאלי, ברבע הימני התחתון). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של תאים B (איור 1 א &#39;, הפאנל מימין). מכתים B220 מוצג על ציר ה-x ו מכתים TCRβ על ציר ה-Y. FACS עבור תאים מסוג CD4 T בוצעה באמצעות cytometer תזרים אותו על ידי gating על TCRβ + CD4 + תאים (איור 1B, הפאנל השמאלי, ברבע הימני העליון). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של תאים מסוג CD4 T (איור 1B, פאנל מימין). מכתים TCRβ מוצגת על ציר ה-x ו CD4 מכתים על ציר ה-Y. התאים אחוז חיובי ברבע כל מוצג. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. טוהר CD4 ותאי T הטחול לאחר FACS. Murine בתאי T הטחול היו מועשר על ידי הסרת תאים B על ידי panning. כתוצאה מכך, התאים היו מוכתמות אנטי עכבר TCRβ ו CD4 נוגדן (הפאנל השמאלי). FACS בוצעה באמצעות FACS BD gating על ידי Aria TCRβ + CD4 + תאים (הפאנל השמאלי, quadr הימנית העליונהנמלה). ניתוח מין הודעה בוצע על מנת לקבוע את הטוהר של ותאי T, אשר היה גדול מ 99% (פאנל מימין). מכתים TCRβ מוצגת על ציר ה-x ו CD4 מכתים על ציר ה-Y. התאים אחוז חיובי ברבע כל מוצג. -&gt;

<ol><li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+and+the+FACS%3A+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGivan%2C+AL+%22Flow+cytometry+first+principles%22">Flow cytometry first principles</a>. , Wiley-Liss. New York. 273-273 (2001).</li>
<li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li>
<li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li>
<li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li>
<li>Diamond, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiamond%2C+RA+%22In+living+color%3A+Protocols+in+flow+cytometry+and+cell+sorting%22">In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting</a>. DeMaggio, S. , Springer. Berlin. 800-800 (2000).</li>
<li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm%3A+MicroSort+clinical+trial+update%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li>
</ol>

FACS היא טכניקה מתוחכמת ביותר לטיהור אוכלוסיות תאים בעלי עניין, שבה הטוהר גבוהה מאוד (95-100%) של האוכלוסייה מיון ניתן להשיג. לכן, טכניקה זו היא חשובה במיוחד עבור ניסויים, שבהם טוהר גבוהה היא תנאי הכרחי (למשל ניתוח microarray). FACS יתרון במיוחד על השיטות הזמינות האחרות של טיהור, כאשר האוכלוסייה התא צריך להיות מטוהרים מבוסס על סמן משטח השבועית הביע או כאשר שניים או יותר אוכלוסיות צריכים להיות מטוהרים אשר יש רמות שונות של ביטוי סמן את פני השטח אותו. לדוגמה, טיהור אזור שוליים B תאים (B220 + CD21 CD23 היי int / נמוך) ו-B פוליקולרית תאים (B220 + CD21 int / נמוך היי CD23) בהתבסס על רמות ביטוי של CD21 ו - CD23. יישום נוסף הוא גדל והולך של FACS מיון תא יחיד ומאפשר ניתוח של תאים בודדים (3, 4). FACS הוא גם נפוץ בתאי מין הבעת חלבוני ניאון כי הם הביעו גנטית, כגון חלבונים חלבון פלואורסצנטי ירוק מתויג (5). אם מעין סטרילי מתבצע התאים יכול להיות מתורבת. עם זאת, כדאיות התא ואת התשואה אפשר להתפשר במהלך המיון. הכדאיות ניתן לשפר באמצעות תא תלויי טמפרטורה אופטימלית למיון ועל ידי צינורות עיבוד אוסף מיד אחרי שהם מגיעים קיבולת. השחזור ניתן להגדיל באמצעות אוסף צינורות פוליפרופילן, איסוף תאים ממוינים מדיה עשירה בסרום וצינורות אוסף היפוך לסירוגין, שמירה על צינורות אוסף בטמפרטורה אופטימלית centrifuging תאים ממוינים דקות 10 ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). הפיתוח של מהירות גבוהה במיוחד sorters האריך את האפשרות של יישום של מיון תזרים במסגרות קליניות. יישומים קליניים הפוטנציאל של FACS כוללים טיהור בתאי גזע של דם דם אדם למטרות טיפוליות, יישומים בטיפול בסרטן, החלפת בדיקת מי שפיר, מיון זרע אנושי לתגליות המחלה מוקדם (6, 7). עבור מכתים ססגוניות, מבחר נוגדן היא צעד קריטי fluorochromes נבחרים מבוסס על מערכת זיהוי כל מכשיר מסוים. ישנן מספר חברות שמוכרות sorters התא התצורה לייזר משתנה לפי צרכי המשתמש. לכן אי אפשר פשוט להשתמש נוגדנים בדיוק משמש מחקרים שפורסמו ללא אישור תאימות. עבור מבחר נוגדן אופטימלי, יש לשקול את רמת הביטוי של החלבון הנבדק. באופן כללי, נוגדנים הבהיר fluorochrome-tagged זמין צריך לשמש כתם סמנים השטח לידי ביטוי עמום, בעוד fluorochromes עמום יכול לשמש מכתים את פני השטח של סמנים הביע ביותר (8). בנוסף, נוגדנים יש לבחור בצורה כזאת, כי חפיפה בין ספקטרום הפליטה שלהם היא מינימלית. עבור מכתים ססגוניות, קשה מאוד לבחור fluorochrome כי אין חפיפה ספקטרלית. במצב זה, פיצוי מבוצע. פיצויים יש צורך לחסל את מתמטית חפיפה בין ספקטרום הקרינה את פליטות של fluorochromes שונים זה שניתן לכמת ידי גלאי (80-10). במילים אחרות, חופפים את הקרינה מאחד fluorochrome מופחת ספקטרום פליטת אחר fluorochrome. חישוב הפיצוי דורש שליטה בלא כתם בקרות חיובי יחיד לכל fluorochrome המשמש מכתים ססגוניות (9, 10). הפיצוי ניתן לבצע באמצעות תאים או חרוזים. החרוזים קל כתם, יש אות חזקים מספקים דרך קלה להכנת שולטת מוכתם יחיד כי יש fluorophores זהה דגימות הניסוי. חרוזים פיצויים הם יתרון במיוחד כאשר שטח פני התא חלבון עניין מתבטאת ברמה נמוכה וכאשר אוכלוסיית תאים של הריבית הגבלת באוכלוסייה התא הראשוני ההתחלה. לאחר נוגדנים נבחרו, הפעילות שלהם צריך להיות מותאם על ידי ביצוע ניתוח טיטרציה. הדבר חשוב במיוחד אם המכשיר FACS יש לייזרים רבי עוצמה ביותר. השימוש בריכוזים הכי מוצלח של נוגדנים מכתים יכול לגרום ההפרדה עניים האוכלוסייה התא הרצוי מתוך האוכלוסייה תא מוחלט. השימוש ריכוזי נוגדנים גבוה מגביר את הסיכוי מכתים אנטיגן בלתי ספציפי. לכן טיטרציה נוגדן יאפשר את הבחירה של ריכוז הנוגדנים שנותן בהירות מקסימלית של האוכלוסייה חיובית מכתים רקע מינימלי (8). FACS עכשיו היא טכניקה תקן לטיהור של subpopulations של תאים. זה יכול לשמש כדי להפריד כל סוג התא שבו ההשעיה תא בודד ניתן להפיק נוגדנים זמינים כדי לזהות את האוכלוסייה התא הרצוי. FACS היא השיטה של ​​בחירה כאשר highly אוכלוסיות תאים טהור נדרשים.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (facs)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

מחקרים ניסיוניים וקליניים לעיתים קרובות דורשים מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים. FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים של פנוטיפ ידוע. עיקר שיטות אחרות של טיהור כוללות צילום פנורמי, דלדול להשלים חרוז הפרדה מגנטי. עם זאת, FACS יש מספר יתרונות על פני השיטות הזמינות האחרות. FACS היא השיטה המועדפת כאשר הטוהר גבוהה מאוד של האוכלוסייה הרצויה נדרשת, כאשר האוכלוסייה תא היעד מבטא רמה נמוכה מאוד של הסמן, או כאשר זיהוי אוכלוסיות תאים דורשים הפרדה על בסיס צפיפות סמן ההפרש. בנוסף, FACS היא הטכניקה רק טיהור זמין לבודד תאים בהתבסס על מכתים פנימי או ביטוי חלבונים תאיים, כגון סמן מהונדסים גנטית חלבון פלואורסצנטי. FACS מאפשרת טיהור של תאים בודדים גרעיניות על בסיס גודל, פלואורסצנטי. על מנת לטהר את התאים של עניין, הם מוכתמים הראשון עם fluorescently-tagged נוגדנים חד שבטיים (מב), אשר מזהה סמנים ספציפיים על פני האוכלוסייה התא הרצוי (1). סלקציה שלילית של תאים בלא כתם הוא גם אפשרי. טיהור FACS דורש cytometer לזרום עם מיון קיבולת התוכנה המתאים. עבור FACS, תאים ההשעיה מועברים כזרם בטיפות עם שכל אחת מהן מכילה תא בודד מול לייזר. מערכת גילוי הקרינה מזהה תאים של עניין על פי פרמטרים שנקבעו מראש ניאון של התאים. מכשיר חל חיוב אגל המכיל תא עניין ומערכת סטיה אלקטרוסטטי מקלה אוסף של טיפות טעון לתוך צינורות איסוף המתאים (2). ההצלחה של מכתים ובכך מיון תלוי במידה רבה על הבחירה של סמנים לזיהוי הבחירה של MAB. פרמטרים של מיון יכול להיות מותאם בהתאם לדרישה של טוהר ואת התשואה. למרות FACS דורש ציוד מיוחד והכשרה אדם, היא שיטת הבחירה של בידוד מטוהרים מאוד אוכלוסיות תאים.

עבור מחקרים מדעיים רבים הדורשים ניתוח ביולוגי וכימי של אוכלוסיות תאים תאים חייב להיות במצב גבוה של טוהר. תא Fluorescence מיון מופעל (FACS) היא שיטה מעולה בו כדי להשיג אוכלוסיות תאים טהור.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

מחקרים ניסויים וקליניים דורשים לעיתים קרובות אוכלוסיות תאים מטוהרות ברמה גבוהה. FACS היא טכניקה מועדפת לטיהור אוכלוסיות תאים בעלות...

שלום, אני הופ קמפבל, מומחית לציטומטריית זרימה ממכון לחקר הדם במרכז הדם של ויסקונסין. שלום, אני STR Baso, סטודנט לתואר מתקדם במעבדתה של ד"ר בוני דיטר. גם אני ממכון לחקר הדם במרכז הדם של ויסקונסין.היום נבצע הליך לבידוד תאים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescent activated cell sorting). אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור את תפקודם של לימפוציטים ואוכלוסיות של תאי מיאלואיד. בואו נתחיל.בפרוצדורה זו יבצעו הפרדה של תאי B ותאי CD4 T מתוך ספלנוציטים של עכבר. יש לחשב את מספר תאי המטרה ההתחלתי בהתבסס על מספר התאים הדרוש ועל שיעור ההשבה של המכונה בשיטה זו. שיעור ההשבה הטיפוסי עבור תאי B ותאי CD4 T הוא 85% עד 90%. אוכלוסיית הספלנוציטים ההתחלתית מורכבת מכ-60% עד 70% תאי B ומ-20% עד 30% תאי T.לפיכך, אם תתחילו עם 100 × 10⁶ תאים, תוכלו להפיק 50 עד 60 מיליון תאי B ו-20 עד 30 מיליון תאי T לפני תחילת ה-facts. יש להניח את התמיסות והריאגנטים הדרושים לפרוטוקול על קרח. אלו כוללים בופר צביעה המורכב מ-phosphate buffered saline עם 3% fetal calf serum, בופר סספנסיה המורכב מ-25 millimolar HEPs שהוכנה ב-Hank's balanced salt solution או HBSS המכיל 3% fetal calf serum, תמיסת 25 millimolar HEP B שהוכנה ב-fetal calf serum, נוגדני צביעה וחרוזי פיצוי (compensation beads).פרוטוקול זה דורש גם את האספקה והריאגנטים הבאים: מבחנות קוניות של 15 milliliter, מבחנות זרימה מפוליסטירן או פוליפרופילן של 12 על 75 millimeter. מסננת תאים מניילון, trypan blue, והמוציטומטר. יש להכין מראש גם מבחנות איסוף למיון לצורך ביצוע פעולה זו.העבירו 300 µL של תמיסת HEPES FCS למבחנות זרימה או 1 mL של תמיסת HEPES FCS למבחנות קוניות של 15 mL. יש להניחן על קרח עד לתחילת תהליך האיסוף. התחילו ביצירת תליה של תאים בודדים (single cell suspension) של אוכלוסיית התאים הרצויה.אם התאים שהבודדו באמצעות הליך זה יעברו תרבית, יש לבצע את כל תהליך הכנת התאים במנדף לתרביות רקמה. בשימוש בטכניקה סטרילית, יש לשטוף את התאים פעם אחת על ידי הוספת תמיפת צביעה קרה (בטמפרטורת קרח) והשעיה מחדש של התאים על ידי היפוך המבחנה מספר פעמים.לאחר מכן, סנטריפוגו את התאים למשך שבע עד שמונה דקות במהירות של כ-250 ×g בטמפרטורה של 4 °C. תנאי השטיפה עשויים להשתנות בהתאם לסוג התאים ולריכוזם. עבור cytes, שטפו עד 200 × 10⁶ תאים עם 10 milliliters של בופר צביעה.הסר בזהירות את הנוזל העליון באמצעות שאיבה, כך שהמשקע התאי יישאר שלם. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בבפר staining buffer קר בקרח בריכוז של עד 50 × 10⁶ ל-100 µL. השהה מחדש את המשקע התאי על ידי נקישה של המבחנה או ערבוב עדין ב-vortex.לאחר מכן, העבירו מ-0.25 עד 1×10⁶ תאים מששת התאים לשפופרת זרימה חדשה מפוליסטירן או מפוליפרופילן במידות 12×75 מילימטר על קרח. השאירו דגימה זו בצד לשימוש מאוחר יותר כדגימת ביקורת לא צבועה. לשפופרת הראשונה, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לתלי התאים כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי. כאן נעשה שימוש בנוגדנים anti-B220 המשורשריים ל-PE Texas Red לצביעת תאי B, בעוד שנוגדנים anti-TCRβ המשורשריים ל-ZEI ו/או נוגדנים anti-CD4 המשורשריים ל-700 משמשים לצביעת תאי T. ערבבו על ידי נקישה על תחתית השפופרת או בערבוב עדין.ערבוב במכשיר וורטקס (Vortexing), לאחר מכן הנחת התאים על קרח ודגירה בחושך למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את התאים המסומנים באמצעות Resus, על ידי השעייתם ב-10 milliliters של בופר השעיה קר, וסבוב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן, לאחר הסרה זהירה של הנוזל העליון (supernatant). חזרו על שלב זה כדי לשטוף את התאים פעם שנייה.לבסוף, השהו מחדש את התאים בבফার תליה (suspension Buffer) קר בקרח. אם הנוגדנים הראשוניים אינם מצומדים ישירות לפלואורופור, הוסיפו נוגדנים משניים מסומנים או strep AVID בצמידות לתליה של התאים, ושוב, דגרו את התאים בקרח בחשכה למשך 20 עד 30 דקות לאחר הדגירה. שטפו את התאים פעמיים בבפר תליה קר בקרח.לאחר הפשרה, השעו את התאים בבופר השעיה קר (בטמפרטורת קרח). קבעו את ריכוז התאים ואת חיוניותם באמצעות צבע חיוני כגון tripan blue והמוסייטומטר. התאימו את ריכוז התאים ל-10 עד 20 כפול 10⁶ תאים למיליליטר על ידי הוספת בופר השעיה, וזאת כדי למנוע סתימה של מכשיר ה-fax באמצעות צברים של תאים שייתכן ומתו במהלך הבידוד.הליך וצביעה. סננו את התאים דרך מסננת טפטוף מיד לפני תחילת פרוטוקול המיון. יש לבחור את גודל הנקבים של המסננת בהתאם לסוג התאים; עבור ציטים (cytes) נעשה שימוש במסננת עם גודל נקבים של 40 micrometer.אספו את התאים המסוננים לשפופרת קונית של 15 ml או לשפופרות זרימה של 12 על 75 מילימטר, בהתאם לנפח. הניחו את התאים על קרח בזמן שהציטומטר מוגדר להליך המיון. אם משתמשים ב-BD comp beads כביקורות חיוביות של צבע בודד, הכינו שפופרת ביקורת אחת עבור כל צבע שנעשה בו שימוש במבחן, ובנוסף שפופרת ביקורת שלילית ללא צבע.לאחר ערבול יסודי ב-vortex של תרחיפי החרוצים, הוסיפו טיפה אחת מכל אחד מתרחיפי החרוצים השליליים והחיוביים ל-100 µL של בופר תרחיף עבור כל צבע שנעשה בו שימוש ועבור הביקורת השלילית. לאחר מכן, הוסיפו 1 µL של הנוגדן המסומן לכל מבחנה של ביקורת חיובית. בניסוי זה, מבחנה אחת מוכנה באמצעות הנוגדנים PE Texas'Red B two 20.ערבבו נוגדנים מסוג ETCR beta ונוגדנים מסוג lor 700 CD four על ידי נקישה על תחתית המבחנות, והדגירו למשך 15 עד 30 דקות בחושך ובטמפרטורת החדר. שטפו את החרו지를 פעם אחת עם 2 mL של באפר צביעה וסבבו בצנטריפוגה ב-200 Gs למשך 10 דקות. הסירו את העלייה על ידי שאיבה והשביו את משקע החרוזים ב-200 עד 500 µL של תמיסת צביעה.הגדרת הבאפר של ציטומטר הזרימה משתנה בהתאם ליצרן ויש לבצעה אך ורק על ידי כוח אדם שעבר הכשרה מתאימה. הליך מיון התאים כאן יבוצע באמצעות BD defects aria. לפני המיון, יש לבחור את הדיזה המתאימה בהתאם לסוג התאים המיועדים למיון.הגדלים הזמינים עבור אזור העובדות הם 70 micrometers, 100 micrometers ו-130 micrometers. גודל הדיזה צריך להיות לפחות פי שלושה מגודל התא המיועד למיון; עבור לימפוציטים, נבחרת הדיזה בגודל 70 micrometer. ניתן לבצע מיון תאים אספטי באמצעות אפשרות המיון האספטי של המכשיר.בשימוש באפשרות זו, נתיב המעטפת כולו עובר דה-קונטמינציה באמצעות 70% ethanol בהתאם להוראות היצרן. יש להקפיד להחליף את מסנני המעטפת ולהחליף את ה-PBS ב-PBS סטרילי. ברגע שהציטומטר מוכן לפעולה, יש להניח את מבחנות האיסוף שקוללו מראש ומכילות heaps FCS במכשיר האיסוף המתאים.מכשירי איסוף זמינים יכולים להכיל עד שני מבחנות קוניות של 15 milliliter. ארבעה מבחנות של 12 על 75 millimeter או ארבעה מיקרו-מבחנות. השתמשו במבחנות של 12 על 75 millimeter לאיסוף של פחות מ-1.5 × 10⁶ תאים ובמבחנות קוניות של 15 milliliter לאיסוף של 1.5 × 10⁶ עד 4.5 × 10⁶ תאים.הנח את התקן האיסוף המתאים לתוך תא איסוף המיון. עבור מייונים רב-צבעיים, הפנה את זרמי הצד אל התקן האיסוף שהותקן. ראשית, יש לכלול את הציטומטר כדי לפצות על חפיפה ספקטרלית בין הגלאים.הדוגמה המוצגת כאן ממחישה את החפיפה בין ספקטרומי הפליטה של fit E ו-pe. חפיפה זו, המוצגת באזור המוצל כהה, נקראת spillover. במקרה זה, spillover של PE יזוהה בערוץ של fit E, ו-spillover של fit e יזוהה בערוץ של PE.יש לתקן את חפיפת האותים (spillover) זו על מנת לבטל את הפלואורסצנציה השיורית של פלואור אחד בערוץ אחר. התהליך של תיקון חפיפת האותים נקרא קומפנסציה. כדי לבצע קומפנסציה ידנית, השתמש בתוכנת ציטומטריה להגדרת תבנית הכוללת תרשים דו-משתני להצגת פיזור קדמי FSC ופיזור צדי SSC, והיסטוגרמה אחת עבור כל פלואור שבו ייעשה שימוש.השיטה להגדרת תרשימים אלו משתנה בהתאם לתוכנה. הכניסו את מבחנת הבקרת השלילית לפתח הטעינה של הציטומטר והתחילו ברכישת נתונים בזמן הרצת הדגימה. כווננו את ה-FSC וה-SSC כדי למקם את האוכלוסייה המבוקשת בתוך הסקאלה.לאחר מכן, התאימו את הגדרות ה-PMT של הפלואורסצנציה כך שאוכלוסיית השליליים או האוטופלואורסצנציה ימוקמו בחלק השמאלי ביותר של ההיסטוגרמה. רשמו את התוצאות של מבחורת ביקורת השליליים. הוציאו את מבחורת ביקורת השליליים מפתח הטעינה של הציטומטר והחליפו אותה במבחורת ביקורת החיוביים הראשונה.כעת התחילו ברכישת הנתונים. חזרו על תהליך זה עבור כל אחת מבחילות הביקורת החיובית תוך רישום הנתונים עבור כל מבחנה. עבור כל ביקורת חיובית, שרטטו שער מרווח (interval gate) או תיבה סביב האירועים שנרשמו בהיסטוגרמה.לאחר מכן, שרטטו שער מרווח (interval gate) נוסף בחלק השלילי של ההיסטוגרמה. בעת ביצוע פיצוי ידני, התחשבו בכל פלואור ששימש בניסוי על ידי כוונון החציון של הדגימות החיוביות עד שיהיה שווה לחציון של הדגימות השליליות. כדי לכוונן את החציון, שנו את ערכי החפיפה הספקטרלית, כלפי מעלה או מטה, עד שהחציונים עבור כל פרמטר פלואורסצנטי יתאימו ככל הניתן.בעזרת ההגדרות שנקבעו עם דגימות הביקורת החיובית והשלילית, הכינו את תהליך המיון על ידי קביעת הגדרות ה-gait עבור הדגימה הניסויית. הכניסו את מבחנת התאים המיועדים למיון לפתח הטעינה של הציטומטר והתחילו ברכישת נתונים במהירות של 9 עד 10,000 אירועים לשנייה. בחרו בגרף פיזור (dot plot) להצגת פיזור קדמי (forward scatter) לעומת פיזור צדי (side scatter).פיזור קדימה (Forward scatter) מהווה אינדיקטור כללי לגודל התא וממוקם על ציר ה-x, בעוד שפיזור צידי (side scatter) מהווה אינדיקטור לגרנולריות התא וממוקם על ציר ה-Y. כעת הגדירו שער (gate) עבור האוכלוסייה הרצויה. לאחר שנקבעו השערים, ודאו שטמפרטורת פתח הטעינה של הסייטומטר מוגדרת ל-4 °C.לאחר מכן, הכניסו את מבחנת הדגימה הניסויית לפתח הטעינה. לחצו על אפשרות המיון (sort) והתחילו באיסוף; יש להניח את מבחנות האיסוף על קרח תוך כדי מילויין. המשיכו במיון עד לאיסוף המספר הרצוי של תאים או עד שתוכן מבחנת הדגימה יסתיים.לאחר מכן, הפסיקו את המיון על ידי לחיצה שוב על כפתור המיון והוציאו את הדגימה מפתח הטעינה. לאחר מכן, הניחו את מבחנת האיסוף ישירות על פתח הטעינה של הציטומטר ורכשו 500 עד 1000 אירועים. באמצעות אותן הגדרות ששימשו למיון של T cells, תהליך המיון העלה את הטוהר מ-21% ל-99%. עבור B cells, אוכלוסיית ה-B cells התחלתית של 5% עלתה ל-98% לאחר המיון.ראינו כעת כיצד לטהר אוכלוסיות של תאי b ותאי t מתוך לוקוציטים באמצעות fax. זכרו כי ניתן להשתמש ב-facts לטיהור של כל אוכלוסיית תאים, בתנאי שניתן להפיק תרחיף של תאים בודדים ושישנם נוגדנים מתאימים. בנוסף, ניתן לטהר בקלות תאים המסומנים גנטית במדדים פלואורסצנטיים ללא שימוש בנוגדנים.בנוסף, זכרו תמיד להשתמש בביקורות המתאימות לניסוייכם, ובדקו תמיד את תצורת הלייזר של הציטומטריה הזרימתית כדי לוודא שאתם משתמשים בفلואורוכרומים הנכונים, וודאו שאתם משתמשים בשערים (gates) מתאימים כך שהם יקיפו את האוכלוסיות שלכם כראוי. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

purification-specific-cell-population-fluorescence-activated-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת...

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בטכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) כדי למיין סוגים ספציפיים של תאים עצביים לניתוח עוקב של ביטוי גנים ספציפיים לסוג התא, סמנים אפיגנטיים ו/או ביטוי חלבון.

ביטוי גנים מסוג התא ספציפי באמצעות סלולארי קרינה המופעל מיון לבדיקת רקמות במוח החולדה

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

פרוטוקול זה מתאר פונקציונליזציה של פני השטח הניתנת להתאמה אישית של מערכת הדסטיוביוטין, הסטרפטווידין וה-APTES על מנת לבודד סוגי תאים ספציפיים מעניינים. בנוסף, כתב יד זה מכסה את היישומים, האופטימיזציה והאימות של תהליך זה.

שיטה של ​​בידוד תא ממוקד באמצעות Functionalization משטח הזכוכית

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

אנו מדווחים פרוטוקול באמצעות תא קרינת מיון מופעל לבודד תאי דנדריטים plasmacytoid (PDC) עם טוהר גבוה ממח העצם של עכברי זאבת נוטה ללימודי תפקודיים של PDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.

תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

כאן, אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג לאפיון של בידול מגה-קריוציטים, ומראים כיצד אסטרטגיה זו מאפשרת מיון של מגה-קריוציטים בשלבים שונים באמצעות סדרן תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. המתודולוגיה יכולה להיות מיושמת על רקמות ראשוניות אנושיות, אלא גם על מגה-קריוציטים הנוצרים בתרבות במבחנה.

אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים

למדו את שיטת FACS לבידוד תאי B ו-CD4 T ממושקעי עכברים בתחום האימונולוגיה והביולוגיה התאית. פרוטוקול זה מספק שיעורי החלמה גבוהים של 85-90% ומאפשר ניתוח ביולוגי מדויק של אוכלוסיות תאים טהורות.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

גלה סרטונים נוספים