טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

היי, אני הופ קמפבל ממומחית לציטומטריית זרימה מהמכון לחקר הדם במרכז הדם של ויסקונסין. היי, אני STR Baso, סטודנטית לתואר שני במעבדה של ד"ר בוני דיטר. אני גם במכון לחקר הדם של מרכז הדם של ויסקונסין.

היום אנחנו הולכים לעשות הליך של בידוד תאים באמצעות מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי לחקור את תפקודם של לימפוציטים ואוכלוסיות תאים מיאלואידים. בואו נתחיל.

בהליך זה B ו-CD ארבעה תאי T יטוהרו מציטים של עכברים. יש לחשב את המספר ההתחלתי של תאי היעד על סמך מספר התאים הדרושים וקצב ההתאוששות של המכונה בשיטה זו. שיעור ההתאוששות האופייני לתאי B ו-CD הוא 85 עד 90%אוכלוסיית ציטי ה-SP ההתחלתית היא כ-60 עד 70% תאי B ו-20 עד 30% תאי T.

לפיכך, אם תתחיל עם 100 כפול 10 עד שישה תאים, תוכל לשחזר 50 עד 60 מיליון תאי B ו-20 עד 30 מיליון תאי T לפני שתתחיל עובדות. יש להניח את התמיסות והריאגנטים הדרושים לפרוטוקול על קרח. אלה כוללים מאגר צביעה המורכב מתמיסת מלח חוצצת פוספט עם 3% מאגר תרחיף סרום עגל עוברי המורכב מ-25 מילי-מולרי HEPs שהוכנו בתמיסת מלח מאוזנת של האנק או HBSS המכיל 3% סרום עגל עוברי תמיסת 25 מילי-מולרית Hep B שהוכנה בסרום עגל עוברי, נוגדנים מכתימים וחרוזי פיצוי.

פרוטוקול זה דורש גם את האספקה והריאגנטים הבאים. צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר, צינורות זרימה של פוליסטירן או פוליפרופילן בגודל 12 על 75 מילימטר. יש להכין מבעוד מועד מסננת תאי ניילון בצבע כחול, וצינורות איסוף מיון ציטומטר המו לשם כך.

ב-300 מיקרוליטר של תמיסת he's FCS לצינורות זרימה או מיליליטר אחד של תמיסת HEPs FFC S לצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. יש להניח אותם על קרח עד לתחילת תהליך האיסוף. התחל ביצירת תרחיף תא בודד של אוכלוסיית התאים הרצויה.

אם התאים מבודדים, שימוש בהליך זה יתורבת. יש לבצע את כל הכנת התאים במכסה המנוע של תרבית רקמות. בטכניקה סטרילית, שטפו את התאים פעם אחת, הוסיפו מאגר צביעה קר כקרח, והשעתה את התאים על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.

לאחר מכן צנטריפוגה את התאים למשך שבע עד שמונה דקות בטמפרטורה של כ-250 GS ארבע מעלות צלזיוס. תנאי הכביסה עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא והריכוז. עבור ציטים, שטפו עד 200 פעמים 10 עד ששת התאים עם 10 מיליליטר של מאגר מכתים.

הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי שאיפה כך שכדורית התא תישאר שלמה. לאחר מכן השעו מחדש את התאים במאגר צביעה קר כקרח בריכוז של עד 50 פעמים 10 עד השישי לכל 100 מיקרוליטר. השעו מחדש את כדור התא על ידי תנועה או מערבולת עדינה של הצינור.

לאחר מכן העבירו 0.25 לפעם אחת 10 מתוך ששת התאים לצינור זרימה חדש של פוליסטירן או פוליפרופילן בגודל 12 על 75 מילימטר על קרח. והניחו את זה בצד לשימוש מאוחר יותר כדגימת הבקרה הלא מוכתמת לצינור הראשון, הוסיפו נוגדנים ראשוניים לתרחיף התא כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי. כאן, האנטי B המצומד האדום של PE טקסס, שני 20 נוגדנים משמשים לצביעה של תאי B ואילו נוגדנים מצומדים נגד TCR R beta ו-700 מצומדים נגד CD משמשים לצביעה של תאי T מעורבבים על ידי לחיצה על תחתית הצינור או על ידי אור.

לאחר מכן מערבולת מניחה את התאים על קרח ודוגרת בחושך למשך 20 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את התאים המסומנים על ידי Resus, והשעו אותם ב-10 מיליליטר של תרחיף קר כקרח, חיץ וצנטריפוזיה כמו קודם, לאחר הסרה זהירה של הסופרנטנט. חזור על שלב זה כדי לשטוף את התאים בפעם השנייה.

לבסוף, השעו מחדש את התאים במאגר תרחיף קר כקרח. אם הנוגדנים הראשוניים אינם מצומדים ישירות לפלואורו ארבע, הוסף נוגדנים משניים מסומנים או סטרפטוקוס AVID בצמידות לתרחיף התא ושוב, דגר את התאים על קרח בחושך במשך 20 עד 30 דקות לאחר הדגירה. שוטפים את התאים פעמיים עם מאגר מתלה קר כקרח.

לאחר החייאה, השעיית התאים במאגר תרחיף קר כקרח. קבע את ריכוז התאים ואת כדאיות התאים באמצעות צבע חיוני כגון טריאן כחול והמו ציטומטר. התאם את ריכוז התאים ל-10 עד 20 כפול 10 לתאים השישיים למיליליטר על ידי הוספת מאגר תרחיף כדי למנוע סתימת מכשיר הפקס באשכולות תאים שאולי מתו במהלך הבידוד.

נוהל ומכתים. סנן את התאים דרך מסננת טפטוף מיד לפני תחילת פרוטוקול המיון. יש לבחור את גודל הנקבוביות של המסננת בהתאם לסוג התא עבור ציטים משתמשים במסננת בגודל נקבוביות של 40 מיקרומטר.

אסוף את התאים המסוננים בצינור חרוטי של 15 ליטר או צינורות זרימה של 12 על 75 מילימטר בהתאם לנפח. והניחו את התאים על קרח בזמן שהציטומטר מוגדר להליך המיון. אם אתה משתמש בחרוזי BD comp כבקרות חיוביות בצבע יחיד, הכן צינור בקרה אחד לכל צבע המשמש בבדיקה בתוספת צינור בקרה שלילי לא מוכתם.

לאחר מערבולת יסודית של מתלי החרוזים הוסף אחד, שחרר כל אחד ממתלי החרוזים השליליים והחיוביים למאגר מתלים של 100 מיקרוליטר עבור כל צבע בשימוש והבקרה השלילית. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של הנוגדן המסומן לכל צינור בקרה חיובי. בניסוי זה, צינור אחד מוכן באמצעות PE Texas'Red B שני נוגדנים 20.

אחד משתמש בנוגדני בטא ETCR מתאימים ואחד באמצעות lor 700 CD ארבעה נוגדנים מעורבבים על ידי תנועה בתחתית הצינורות ודוגרים במשך 15 עד 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. שוטפים את החרוזים פעם אחת עם שני מיליליטר מכתים, חיץ וצנטריפוגה בחום של 200 גרם למשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט על ידי שאיפה והשהה מחדש את כדור החרוז ב-200 עד 500 מיקרוליטר של צביעה.

הגדרת המאגר של ציטומטר הזרימה משתנה בהתאם ליצרן וצריכה להתבצע רק על ידי צוות מיומן מתאים. הליך מיון התאים כאן יבוצע באמצעות אריית פגמי BD. לפני המיון, בחר את הזרבובית המתאימה בהתאם לסוג התא שיש למיין.

הגדלים הזמינים עבור אריה עובדתית הם 70 מיקרומטר, 100 מיקרומטר ו-130 מיקרומטר. גודל הזרבובית צריך להיות לפחות פי שלושה מגודל התא שיש למיין עבור לימפוציטים, נבחר הזרבובית של 70 מיקרומטר. ניתן לבצע מיון תאים אספטיים באמצעות אפשרות המיון האספטי של המכשיר.

באמצעות אפשרות זו, כל נתיב הנדן מטוהר ב-70% אתנול על פי הוראות היצרן. הקפד להחליף מסנני נדן ולהחליף PBS ב-PBS סטרילי. לאחר שהציטומטר מוכן לפעולה, הנח את צינורות האיסוף המצוננים מראש המכילים ערימות FCS לתוך מכשיר האיסוף המתאים.

התקני איסוף זמינים יכולים להכיל עד שני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר. ארבעה צינורות 12 על 75 מילימטר או ארבעה צינורות מיקרו. השתמש בצינורות בגודל 12 על 75 מילימטר לאיסוף פחות מ-1.5 כפול 10 לתאים השישיים וצינורות חרוטיים של 15 מיליליטר לאיסוף 1.5 כפול 10 עד 6 עד 4.5 כפול 10 לתאים השישיים.

הנח את מכשיר האיסוף המתאים בתא איסוף המיון. כוון את זרמי הצד למכשיר האיסוף המותקן למיון רב צבעוני. הציטומטר מכויל תחילה כדי להסביר חפיפה ספקטרלית בין הגלאים.

הדוגמה המוצגת כאן ממחישה את החפיפה בין ספקטרום הפליטה של התאמה E ו-pe. חפיפה זו המוצגת באזור המוצל הכהה נקראת גלישה. כאן תתגלה זליגת PE בערוץ E המתאים וזליגת E מתאימה תתגלה בערוץ PE.

יש לתקן זליגה זו על מנת למנוע את הקרינה השיורית של קומה אחת ארבע בערוץ אחר. תהליך התיקון לזליגה נקרא פיצוי לביצוע פיצוי ידני. השתמש בתוכנת ציטומטריה כדי להגדיר תבנית הכוללת תרשים דו-משתני להצגת FSC פיזור קדימה ו-SSC פיזור צדדי והיסטוגרמה אחת עבור כל פלורו שישמש.

השיטה להגדרת חלקות אלו משתנה בהתאם לתוכנה. הנח את צינור הבקרה השלילי לתוך יציאת הטעינה של הציטומטר והתחל ברכישת הנתונים בזמן שהדגימה פועלת. התאם את ה-FSC וה-SSC כדי למקם את האוכלוסייה המעניינת בקנה מידה.

לאחר מכן התאם את הגדרות ה-PMT הקרינה כדי למקם את האוכלוסייה השלילית או האוטו-פלואורסצנטית בחלק השמאלי הרחוק של ההיסטוגרמה. הקלט את צינור הבקרה השלילי. הסר את צינור הבקרה השלילי מיציאת הטעינה של הציטומטר והחלף אותו בצינור הבקרה החיובי הראשון.

עכשיו התחל ברכישה. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מצינורות הבקרה החיוביים המתעדים את הנתונים עבור כל צינור. עבור כל בקרה חיובית, צייר שער מרווח או תיבה סביב האירועים שנרשמו בהיסטוגרמה.

לאחר מכן צייר שער מרווח נוסף בחלק השלילי של ההיסטוגרמה. בעת ביצוע פיצוי ידני, קח בחשבון כל fluro המשמש בניסוי על ידי התאמת החציון של החיוביים עד שהוא שווה לחציון השלילי. כדי להתאים את החציון, התאם את ערכי החפיפה הספקטרליים, גבוהים או נמוכים יותר עד שהחציון עבור כל פרמטר פלואורסצנטי יתאים ככל האפשר.

באמצעות ההגדרות שנקבעו עם דגימות הבקרה החיוביות והשליליות, התכוננו להליך המיון על ידי קביעת הגדרות ההליכה עבור דגימת הניסוי. הנח את צינור התאים למיון לתוך יציאת הטעינה הציטומטרית והתחל ברכישה במהירות של תשעה עד 10,000 אירועים בשנייה. בחר תרשים נקודות להצגת פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי.

פיזור קדימה הוא אינדיקטור כללי לגודל התא והוא ממוקם על ציר ה-x בעוד שפיזור צד הוא אינדיקטור לגרעיניות התא וממוקם על ציר ה-Y. עכשיו שער את האוכלוסייה המעניינת. לאחר קביעת השערים, בדוק כדי לוודא שהטמפרטורה של יציאת הטעינה של הציטומטר מוגדרת לארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הנח את צינור הדגימה הניסיוני לתוך יציאת הטעינה. לחץ על אפשרות המיון והתחל ברכישה יש להניח צינורות איסוף על קרח בזמן מילויים. המשך במיון עד לאיסוף מספר התאים הרצוי או עד שצינור הדגימה ריק.

לאחר מכן הפסק את המיון על ידי בחירה נוספת בלחצן המיון והסר את הדגימה מיציאת הטעינה. לאחר מכן, הנח את צינור האיסוף ישירות על יציאת הטעינה של הציטומטר ורכוש 500 עד 1000 אירועים. באמצעות אותן הגדרות המשמשות למיון עבור תאי T, הליך המיון הגדיל את הטוהר מ-21 ל-99%עבור תאי B, אוכלוסיית תאי B ההתחלתית של 5% הוגדלה ל-98% לאחר המיון.

אז זה עתה הראינו לכם כיצד לטהר את אוכלוסיית תאי b ו-t מציטים באמצעות פקס. זכור, ניתן להשתמש בעובדות כדי לטהר כל אוכלוסיית תאים אם ניתן לייצר תרחיף תא בודד ויש נוגדנים מתאימים. בנוסף, ניתן לטהר בקלות תאים שנערמים גנטית עם סמנים פלואורסצנטיים ללא שימוש בנוגדנים.

כמו כן, זכור תמיד להשתמש בפקדים המתאימים לניסויים שלך ובדוק תמיד את תצורת הלייזר של ציטומטריית הזרימה שלך כדי לוודא שאתה משתמש בפלואורוכרומים הנכונים ולהקפיד להשתמש בשערים מתאימים כך שהם יהיו סביב האוכלוסיות שלך כראוי. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.