Name: השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למדו כיצד לתמוך בהתחדשות עצמית של תאי גזע עובריים בעכברים באמצעות המולקולה הקטנה SC1 ללא LIF. שיטה זו מציעה חלופה חסכונית לתרבות תאים עם ביטוי סמני רב-התאיות דומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר שנג דינג של המחקר סקריפס המכון וד&quot;ר Hongkui דנג של אוניברסיטת פקין עזרתם ואת הכיוון.

1. הכנת צלחות MEF מזין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני תאים ES culturing, אחד להפשיר בקבוקון של מוקרן E14.5 CF-1 תאים MEF מזין (ראה נוהל שלנו על איך להפשיר תאים ES). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט מזין תאים MEF בצפיפות של 10,000 תאים / גם בצלחת 12 באר. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. MEF תא התקשורת: DMEM בתוספת 10% ES-PBS, 1X גלוטמין ו 1X שאינם חיוניים חומצות אמינו. </li></ol> 2. תחזוקה של התחדשות עצמית של תאים עכבר ES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק בתאי גזע עובריים באמצעות טריפסין. זרעים התאים בצפיפות של 50,000 תאים / מזין היטב על לוחות מוכן בעבר MEF בתקשורת צמיחה (ממ נוק KSR בתוספת 15%, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין, 0.1 mM שאינם חיוניים חומצות אמינו 1X BME) בתוספת sc1 בריכוז הרצוי (השתמשנו 100 ננומטר, 300 ננומטר, ו 1 מיקרומטר). אנחנו גם הוסיף לשלוט חיובי היטב כי היה להשלים עם 1000 μ / ml של LIF. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 ימים 3-4 בקטע זה. רענן התקשורת כל 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 1:10-1:15 עם טריפסין לשמור על צפיפות דומה לזו של צפיפות זריעה הראשונית. לאחר 5 קטעים, התאים ניתן לבדוק ביטוי של סמנים pluripotency טיפוסי באמצעות immunocytochemistry. </li></ol> 3. בחינת Immunocytochemical של סמנים pluripotency <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 500 μl של מקבע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 500 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 250 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי (השתמשנו Nanog, Sox2, SSEA1 ו Oct4 על דילולים הבאים: 1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 ו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 250 μl של נוגדנים משני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, שמירה מן האור (השתמשנו חמור נגד עכבר מצומדות עם אלקסה פלואוריד ® 555 ב ו - 1:2000 חמור ארנבת אנטי מצומדות עם אלקסה פלואוריד ® 488 ב 1 : 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI (הריכוז הסופי 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לשטוף האחרון דגירה 5 דקות כדי להמחיש גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 4. נציג תוצאות: 1. מורפולוגיה התוצאות: עכבר לתאי גזע עובריים (ESC R1) היו גדולים על תאים MEF מזין בנוכחות או LIF או sc1 לקיים עצמית והתחדשות בכל מדינה מובחן. אחרי הקטע השני, בידול יכול להיבחן בתאים ללא LIF או sc1 (שליטה שלילי) ואחרי 5 קטעים בעצם לא נצפו מושבות מובחן. LIF (בקרה חיובית) מושבות טופלו נותרו במצב מובחן לאורך 5 קטעים התא. תאים שטופלו sc1 בריכוזים של 300 ננומטר או 100 ננומטר גם נשאר מובחן לאחר 5 קטעים, לעומת זאת, בתאים שטופלו 1 sc1 מוות מיקרומטר תא מנוסה לאחר המעבר הרביעי. (איור 2 של פתק App) טבלה 1 מסכמת את התצפיות מורפולוגיים. 2. הביטוי של סמנים pluripotency עכבר לתאי גזע עובריים לשמור על 5 קטעים היו קבועים נבדק על ידי immunocytochemistry עבור SSEA1, Oct4, Nanog ו Sox2. הביטוי מרקר היה דומה התאים נשמר LIF. (איור 3 ו -4 של פתק App) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: השוואה מורפולוגיה של תאים נשמר LIF או sc1. אין הבדל במורפולוגיה נצפתה. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="איור 2 ו -3" /> איור 2 ו איור 3: Nanog, SSEA1, Sox2, ו Oct4 מכתים של תאים ES נשמר עם sc1 או LIF (איור 4 לציין האפליקציה). תאים נשמר sc1 להראות סמן דומה ביטוי pluripotency לתאי נשמר LIF. טבלה 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> בקרה שלילית </td><td> LIF חיובית שליטה </td><td> Sc1 1uM </td><td> Sc1 300 nM </td><td> Sc1 100 ננומטר </td></tr><tr><td> 1 המעבר </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 2 המעבר </td><td> מורפולוגיה חלק מובחן </td><td> דואר רגילS מורפולוגיה תא </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 3 המעבר </td><td> רוב התאים הבדיל </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 4 המעבר </td><td> אין ESC המושבות </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> מוות של תאים שנצפו </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 5 המעבר </td><td> הבדיל </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> מוות של תאים שנצפו </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li>
<li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acat.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li>
</ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי Stemgent המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

Sc1 מולקולה קטנה ניתן להשתמש כדי לשמור על התחדשות עצמית עם מדינה שלא עברו התמיינות בתאי עכבר ES. לפני השימוש בקו תא נבדק, לעומת זאת, זה צריך להיות טיטרציה כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי. לדוגמה, בדקנו בשלושה ריכוזים על ES העכבר התא קו ESC R1. 100 ננומטר 300 ריכוזים nM היו מסוגלים לקיים ES תאים העכבר, לעומת זאת, ריכוז 1 מיקרומטר היה רעיל. Sc1 יכול לשמש גם תחת מזין ללא תנאים.

<table><tbody><tr><td>SC1</td><td>Stemgent</td><td>04-0011</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>21702</td><td></td></tr><tr><td>Nanog antibody</td><td>Abcam</td><td>ab21603</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 antibody</td><td>Chemicon International</td><td>Ab5603</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

השימוש sc1 (pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר lif

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

עכבר גזע עובריים (ES) התאים בתרבית כמקובל עם פקטור מעכבות לוקמיה (LIF) כדי לשמור על התחדשות עצמית.<sup&gt; 1</sup&gt; עם זאת, LIF יקר הפעלה של מסלול LIF/JAK/STAT3 אינו נדרש לחלוטין כדי לשמור על המדינה עצמית והתחדשות.<sup&gt; 2</sup&gt; Sc1 מולקולה קטנה יכולה להיות חלופה חסכונית LIF. Sc1 פונקציות על ידי עיכוב כפול של ראס-GAP ו ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; איור של מנגנון הפעולה שלה עושה את זה כלי שימושי ללמוד את המנגנון המולקולרי היסוד של התחדשות עצמית. כאן אנו מדגימים את הליך עכבר לתאי גזע עובריים culturing בנוכחות sc1 ולהראות שהם מסוגלים לשמור על התחדשות עצמית בהעדר LIF. תאים בתרבית עם sc1 הראו מורפולוגיה דומה בהשוואה לתאי שמר עם LIF. שניהם הציגו מורפולוגיה טיפוסית ES העכבר לאחר חמישה קטעים. הביטוי של סמנים pluripotency טיפוסי (Oct4, Sox2, Nanog, ו SSEA1) נצפתה לאחר חמישה קטעים בנוכחות sc1. יתר על כן, לא נגרם sc1 רעילות גלויה על תאים עובריים בעכבר.

Sc1 פונקציות על ידי עיכוב כפול של ראס-GAP ו ERK1. בדקנו את תפקוד sc1 בתמיכה ES העכבר תא עצמית חידוש בהעדר LIF והראה כי sc1 הוא מסוגל לשמור על התחדשות עצמית של ES תרבויות עכבר התא.

השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

תאי גזע עובריים (ES) של עכבר גודלים באופן קונבנציונלי עם גורם עיכוב לוקמיה (LIF) כדי לשמר את תכונת החידוש העצמי.1 עם זאת, LIF הוא יקר ו...

שלום, אני שרה NAU ממעבדת STEM Gen בבוסטון. היום נראה לכם הליך לשמירה על התחדשות עצמית של תאי גזע עובריים של עכבר בנוכחות המולקולה הקטנה C one. תאי גזע עובריים מגדלים בדרך כלל בנוכחות leukemia inhibitory factor כדי לשמר את ההתחדשות העצמית.עם זאת, L הוא יקר. לכן, נספק כאן חלופה חסכונית, המולקולה הקטנה SC one. בחלק האחרון של הסרטון, נראה השוואה של ביטוי סמני פלוריפוטנציות בין תאים שהוצמחו ב-L לבין תאים שהוצמחו ב-SC one.אם כן, בואו נתחיל. יום אחד לפני תרבית תאי הגזע העובריים, הפשיר מבחנה של תאי מאכלה (feeder cells) שהוקרנו. זרע את תאי המאכלה בצפיפות של 10,000 תאים לכל באער.בפלטה עם 12 בארות, דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. למחרת, זרעו את תאי ה-ES על שכבת התמיכה של MEF בצפיפות של 50,000 תאים לבערה על פלטות התמיכה שהוכנו, במצע גידול המועשר ב-SC one בריכוזים הרצויים; השתמשנו ב-100 nano molar, 300 nano molar ו-1 micromolar.כביקורת, נוסיף באר שהועשרה ב-1000 µg/mL של LIF. כעת הדגרו את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide.למחרת, רעננו את המצע לצורך תרבית רציפה. רעננו את המצע מדי 48 שעות ובצעו מעבר תאים (passage) ביחס של 1 ל-10 כל שלושה עד ארבעה ימים, כדי לשמור על צפיפות דומה לצפיפות הזריעה הראשונית. לאחר חמישה מעברים, ניתן כעת לבדוק את הביטוי של סמני פלוריפוטנציה טיפוסיים באמצעות אימונוכימיה, כדי להתחיל את תהליך האימונוכימיה של תאי הגזע.התחילו בשטיפה עדינה של התאים שלוש פעמים ב-PBS. קבעו את התאים באמצעות 500 µL של 4% para formaldehyde למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים ב-PBS, שלוש פעמים נוספות, חסמו קישור לא ספציפי באמצעות 500 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, הוסיפו 250 µL של הנוגדן הראשוני לתאים והניחו להם להדגיר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה. בניסוי זה, אנו מדגירים עם נוגדנים ל-nano SOX2, SSEA1 ו-OCT4. לאחר סבב שטיפות נוסף, הדגירו את התאים עם 250 µL של נוגדן משני המצומד לצבע פלואורסצנטי למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, תוך שמירה עליהם הרחק מאור; שטפו את התאים פעם אחרונה והוסיפו DAPI בריכוז סופי של 1 µg/mL לשטיפה האחרונה.לאחר מכן, דגרו את התאים למשך חמש דקות כדי לצבוע את הגרעינים. לבסוף, נתחו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מוצגים כאן תמונות בשדה בהיר (brightfield) של תאי ES של עכבר שגודלו על תאי מזינים (feeder cells) בנוכחות של LIF או SC one כדי לשמר את התחדשות העצמית במצב לא מובחן.כאן מוצגים תאי ES של עכבר, אשר תוחזקו למשך חמישה מעברים. התאים קובעו ונבחנו באמצעות אימונו-ציטוכימיה עבור SSEA one, OCT four, nano ו-SOX two. ביטוי הסמנים בתאים שתוחזקו ב-C one היה דומה לזה של תאים שתוחזקו ב-LIF.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשתמש במולקולה הקטנה SC one כדי לשמר התחדשות עצמית בתאי גזע עובריים של עכבר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שיש לבצע תיתור של SC one כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לפני השימוש בקו תאים שלא נבדק. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

the-use-sc1-pluripotin-to-support-mesc-self-renewal-absence

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

ניתן לתכנת מחדש פיברובלסטים עובריים של עכבר לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ביעילות נמוכה על ידי ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. המתווכים הנדירים של תגובת התכנות מחדש מבודדים FACS באמצעות תיוג עם נוגדנים כנגד יצרני פני התא Thy-1.2, Ssea-1 ו-Epcam.

טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.

שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C

אנו מציגים עבור יעיל בתפזורת, מהירה כימי לדוגמות של תאי גזע pluripotent האנושי שושלת היוחסין-איפה זה מונח קונבנציונאלי (hPSC) לתוך מצב של epiblast דמוי pluripotent יציב epigenomically תמים פרוטוקול. שיטה זו התוצאה ביטוי גנים שושלת היוחסין-איפה זה מונח ירד שיפור ניכר תוך בידול multilineage מכוונת על-פני רפרטואר רחב של קווי hPSC המקובלת.

לדוגמות כימיים בתאי גזע Pluripotent האנושית המקובלת למצב תמים כמו עם העוצמה התמיינות משופרת Multilineage

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

למדו כיצד לתמוך בהתחדשות עצמית של תאי גזע עובריים בעכברים באמצעות המולקולה הקטנה SC1 ללא LIF. שיטה זו מציעה חלופה חסכונית לתרבות תאים עם ביטוי סמני רב-התאיות דומה.

השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

גלה סרטונים נוספים