הדור של גזע תאים מושרה pluripotent על ידי תכנות מחדש Fibroblasts האדם עם Lentivirus Stemgent TF האדם הגדר

היי, שמי בראד המילטון. אני מדען כאן במחלקת המחקר והפיתוח כאן ב-STEM Gen. היום נראה לכם נוהל כיצד לתכנת מחדש פיברובלסטים אנושיים באמצעות גורמי תכנות מחדש המועברים על ידי לנטי-ויראלי.

ניתן להשתמש בהליך זה הן ליצירת תאי IPS והן ללימוד תהליך התכנות מחדש. תאי IPS דומים לתאי ES במורפולוגיה, בהתפשטות וביכולת ההתמיינות ולכל סוגי הרקמות בגוף. לתאי IPS אנושיים יש יתרון מובהק על פני תאי ES מכיוון שהם מציגים תכונות מפתח של תאי ES ללא הדילמה האתית של השמדת עובר כדי להשיג את התאים.

יצירת תאי IPS ספציפיים לחולה עוקפת מחסום חשוב לטיפולי רפואה רגנרטיבית מותאמים אישית על ידי ביטול הפוטנציאל לדחייה חיסונית של תאים מושתלים שאינם אוטולוגיים. אז בואו נתחיל. בכמה נקודות בפרוטוקול זה, אתה מחליף את המדיום של ה-IPSC המתפתח או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במדיום מותנה מת'.

הכנת מדיום זה אורכת שישה ימים. אז התחל לפחות שבוע לפני שאתה רוצה להתחיל את הניסוי שלך. כדי להתחיל לזרוע כל באר של שש.

צלחת באר עם פעמיים כפול 10 לחמישית cf אחד תאי הזנה של מת' בשני מיליליטר של גידול מת'. דגירה בינונית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, החלף את המדיום לתרבית תאי E-S-I-P-S אנושיים.

דגירה בינונית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. אוספים את הסופרנטנט ומחליפים במדיום טרי כל 24 שעות למשך ארבעה ימים. מסננים את הסופרנטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר.

השלם את הסופרנטנט שנאסף עם 15 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי BFGF. בסופו של דבר תקבל כ-16 מיליליטר של מדיום ממוזג מת' בכל יום שנאסף בנפרד בארבע מעלות SIU. ניתן לאחסן מדיום מותנה של מת' למשך שבוע עד שבועיים בארבע מעלות צלזיוס או למשך מספר חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס.

עכשיו לאחר שהבטחת שהמדיום המותנה במת' שלך יהיה מוכן כשתצטרך אותו, בוא נדבר על הכנת התאים. המשימה הראשונה ביצירת IPSC היא להשתמש ב-lentiviruses כדי לתמר, תאי פיברובלסטים של עורלה אנושית, או תאי BJ עם ארבעה שעתוק האופייניים לתאי גזע. כדי להתכונן לתמרה תאי BJ זרעים בצפיפות של אחד כפול 10 עד חמישית תאים לבאר של צלחת ותרבית של שש בארות.

התאים בשני מיליליטר של גדילה, בינוני בן לילה ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני באותו יום. התחל להכין צלחות הזנה של מת' על ידי הוספת שני מיליליטר של 0.1% ג'לטין מדולל במים לצלחת של שש בארות ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. הג'לטין מצפה את הבארות ומשמש כמטריצה לבארות אלה.

כעת תאי ה-BJ מוכנים להתמרה לנטי-ויראלית כדי להכין את הנגיף להתמרה. תוסף שני מיליליטר של מדיום טרי עם שישה מיקרוגרם למיליליטר של פולי מוח וארבעה לנטי-וירוסים שכל אחד מהם מבטא את אחד מגורמי השעתוק האנושיים. T 4, SO 2 nanog ו-lin 28, כך שכל אחד מהם נמצא באותו ריבוי של זיהום או MOI.

הלנטי-וירוסים הללו כלולים כולם בערכת ה-lentivirus של גורם התכנות מחדש האנושי. כדי לבצע את ההעברה, פשוט החלף את מדיום הגידול של תאי BJ במדיום המכיל את הנגיף. נדנד בעדינות את הצלחת כך שהמדיום יצפה את התחתית באופן שווה.

דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני באותו היום. הסר בקבוקון אחד של תאי הזנה של מת' אחד מחנקן נוזלי והפשיר. הסר את תמיסת הג'לטין מלוחות מזין המת', שכעת מצופים ג'לטין לכל אחד מהם.

ובכן, הוסף 0.2 כפול 10 לתאים החמישיים בשני מיליליטר של גידול מת'. בינוני. דגרו את ה-MES למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, נתק את תאי ה-BJ עם 0.05% טריפסין EDTA וצנטריפוגה ב-200 Gs למשך חמש דקות.

לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במדיום הגידול. הסר את המדיום מלוח מזין המת' והוסף שני מיליליטר לבאר של תרחיף תאי BJ. ריכוז תאי ה- BJ צריך להיות בערך פי חמישה פי 10 לתאים הרביעיים לבאר.

דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. 24 שעות לאחר הנסיגה, תאי ה-BJ על צלחת ההזנה של המת' החליפו את המדיום ב-E-S-I-P-S אנושי, כלומר גזע עוברי או תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. בינוני. המשך לשנות את המדיום כל 24 שעות במשך שבעה ימים.

ביום השביעי, החלף את מדיום תרבית תאי ה-ES בשני מיליליטר של מדיום מותנה מת'. תאי ההזנה של המת' סיפקו את הגורמים המסיסים הדרושים לגידול תאי IPS. אבל עכשיו אנחנו צריכים להוסיף עוד מהגורמים האלה כדי לשמור על התרבות בריאה.

מדיום מותנה של מת' מכיל את כל הגורמים המסיסים המופרשים על ידי תאי הזנה של מת' שדוגרים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. במבט דרך ההיקף, בחר מושבת תאים. נבדל על ידי מראה דמוי כיפה קטנה וקומפקטית בצלחת טרייה של 24 בארות שקדמת 24 שעות קודם לכן עם ccf תאי הזנה מת' אחד נסוגים מהמושבה הנבחרת בתרבית E-S-I-P-S אנושית.

מדיום בתוספת 10 מולקולת גזע מיקרומולרית Y 2 7 6 3 2. מעכב קינאז תלוי. שנה את מצע התרבית מבלי להשלים את מולקולת הגזע Y 2 7 6 3 2 כל 24 שעות במשך שבעת הימים הראשונים.

לאחר שבעה ימים החלף מדיום למת'. ממצב לבינוני ממשיכים לעבור את התאים עד שהם מראים מורפולוגיה טיפוסית של תאי ES אנושיים. חפש כיפה קטנה וקומפקטית כמו מושבות בעלות קצה חד.

מושבות צריכות להיות אחידות ובעלות יחס גבוה של גרעין לציטופלזמה. בשלב זה, פיתחתם מושבות שיש להן מורפולוגיה של תאי גזע גזעיים, אך האם הן מבטאות גם גנים האופייניים לתאי גזע גזעיים? כדי לגלות את המושבות מכתים סמנים של פלוריפוטנטיות כגון TRA 180 1 TRA אחד 60 SSEA ארבע s, SE, a 3 T ארבע sox, שני ננוג ו- SSEA אחד כדי להתחיל לשטוף בעדינות את התאים שלוש פעמים עם PBS.

לאחר מכן, תקן את התאים עם 500 מיקרוליטר של 4% פרפורם, אלדהיד או מקבע אחר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות יש לשטוף את התאים עם PB S3 פעמים נוספות כדי להסיר עודף קיבוע. לאחר מכן, חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר חוסם לבאר למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר שלב החסימה, הוסף 250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל אחד עד 100 במאגר חוסם לכל אחד.

ובכן לדגור את התאים בנוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת. שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים. דגרו את התאים עם 250 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל אחד עד 300 וחסימת חיץ למשך שעה בטמפרטורת החדר, תוך התרחקות מאור כדי למנוע פוטוהלבנה לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני.

שוטפים את התאים שלוש פעמים עם PBS לכביסה השלישית. הוסף DPI במיקרוגרם אחד למיליליטר כדי להכתים את הגרעינים. לבסוף, הנה, נתח את ביטוי הגנים של תאי ה-IPS שלך.

תחת תוצאות המורפולוגיה של המיקרוסקופ, ארבעה תאי פיברבלסט עור אנושיים שבהם cot התמרו עם T 4 SOX, 2 nanog ו-lin 28 נצפו שינויים מורפולוגיים כבר ביום הרביעי לאחר ההתמרה ואשכול התאים נעשה צפוף יותר ביום 17, ביטוי של סמני עוצמה רבים. כדי לאפיין עוד יותר את מושבות תאי ה-IPS המבודדות, חיפשנו נוכחות של סמני פלוריפוטנטיות נפוצים המתבטאים בתאי ES. המושבות הפגינו פעילות פוספטאז אלקליין חזקה.

בנוסף, אימונוכימיה או ICC בוצעה על מושבות תאי ה-IPS עם פאנל של נוגדנים ספציפיים לסמן פלוריפוטנטיות כולל סמני פני השטח TA 180 1 TRA אחד 60 SSEA 4 ו-SS EEA 3, כמו גם סמנים גרעיניים, T 4, SOX 2 ו-Nanog. מושבות ה-IPS המבודדות היו חיוביות לכל הסמנים. תוצאות ה-ICC מראות שתאי ה-IPS הציגו את דפוס הביטוי המתאים של סמן פלוריפוטנטיות, מה שמדגים שתאי IPS אלה דומים מאוד לתאי E es אנושיים לא מובחנים.

זה עתה הראינו לכם כיצד לייצר תאי IPS על ידי תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים עם גזע. תכנות מחדש של גורם אנושי lentivirus סט. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לקחת בחשבון מספר גורמים.

ראשית, ייתכן שיהיה צורך לשנות את יחס הנגיף הפעיל ליעד במהלך שלב ההתמרה הראשוני כדי להשיג יעילות התמרה אופטימלית. שנית, מצב הגדילה של תאי המטרה יכול להשפיע. תכנות מחדש של תאים בריאים ומתרבים מוכנים יותר לתכנות מחדש.

שלישית, בעת שינוי הפרוטוקול עבור מספרי תאים שונים, מומלץ להתאים את מספרי תאי היעד באופן פרופורציונלי לשטח הפנים של צלחת התרבית. לבסוף, יש לשקול שימוש במעכבי סלע כגון Y 2 7 6 3 2 כדי להבטיח תכנות מחדש מוצלח מכיוון שמחקרים אחרונים הוכיחו את התועלת שלו בשיפור הישרדות מושבת ה"כן" האנושית. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.