מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

שלום, אני לאה קנט מ-STEM Gen. היום נראה לכם כיצד להפשיר ולהקפיא תאי גזע עובריים אנושיים. אז בואו נתחיל.

להפשרת תאי גזע עובריים אנושיים, מוציאים מבחנה קריוגנית מחנקן נוזלי ומפשירים אותה במהירות. באמבט מים של 37 °C, מעבירים את תרחיף התאים מהמבחנה הקריוגנית למבחנה קונית המכילה מצע גידול לתאי ES אנושיים לצורך דילול, ולאחר מכן מבצעים סבוב (צנטריפוגה). כדי ליצור משקע תאים קטן, מסירים את הנוזל העליון (supernatant) וממיסים מחדש את משקע התאים במצע גידול טרי לתאי ES אנושיים בתוך המבחנה, לפני הזריעה בבאר אחת של פלטת תרבית תאים בעלת שש בארות, שעל פניה נזרעה מראש שכבת תאי מזינים (feeder layer) של meth שהוקרנו.

יום אחד לפני הפשרת תאי ES אנושיים, פזרו שכבת מזינים של פיברובלסטים עובריים של עכבר שהקרנו, או MEFs, במצע גידול בבאר אחת של פלטת תרבית רקמה בעלת שש בארות המצופה ג'לטין. דגרו את הפלטה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.

כדי להבטיח הפשרה יעילה ומוצלחת, ודאו שכל הציוד והריאגנטים הדרושים מוכנים. לפני הוצאת ה-human ESL מהחנקן הנוזלי, הוציאו באמצעות פינצטה ממתכת מבחנה קריוגנית של human E ESL ממכל האחסון של החנקן הנוזלי.

גלגלו את הבקבוק בין ידיים חבושות בכפפות למשך שלוש עד חמש שניות. כדי להסיר את הכפור, רשמו את המידע המופיע על תווית הבקבוק באמצעות פינצטה ממתכת. טבלו את הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C.

סובבו את המבחנה בעדינות ועקבו לעיתים קרובות אך במהירות אחר התקדמות ההפשרה על ידי החזקת המבחנה מול האור, כדי לבחון את גודל גביש הקרח. אין לטבול את פקק המבחנה במקלח המים, שכן הדבר עלול לזהם את התאים.

כאשר נותר רק גביש קרח קטן, טבול את המבחנה באתנול כדי לעקר אותה בתוך קבינה בטוחה ביולוגית סטרילית, והעבר את תכולת המבחנה הקריוגנית ישירות לתחתית של מבחנה קונית בנפח 15 milliliter. הוסף לאט למבחנה ארבעה milliliters של מצע תרבית לתאי ES אנושיים.

נערה את המבחנה בעדינות כדי לערבב את התאים באופן רציף תוך כדי הוספת המצע החדש למבחנה. סבב את תאי ה-human E es במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-200 Gs. הוצא את פלטת ה-meth feeder שהוכנה מראש מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וסמן אותה עם המידע המתאים עבור ה-human ESL, כגון קו תאים, מספר מעבר (passage number) ותאריך הפשרה.

שאבו את מצע התרבית של ה-MEF והוסיפו מיליליטר אחד של PBS לבאר. העבירו את משקע ה-human E ESL בחזרה למCבטחת הביולוגית ושאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). היזהרו לא לשאוב את משקע התאים, אך הסירו כמה שיותר מהנוזל העליון, כיוון שפתרון זה מכיל DMSO מתוך מצע ההקפאה. Resus.

שעלק את המשקע בעדינות רבה על ידי הוספת 2.5 milliliters של מצע גידול human ESL. באמצעות פיפטת זכוכית של חמישה milliliters, שאב את ה-PBS מהבאר של ה-MEF feeder על ידי פיפטור של שלוש עד ארבע פעמים. הוסף לאט את כל 2.5 milliliters של תרחיף תאי ה-human ES לבאר המוכנה בלוח שש הבארות.

הנח את הפלטה בתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והזלק אותה בזהירות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה בכל הבאר. זאת כדי למנוע ריכוז של המושבות במרכז. אין לסובב את הפלטה בתנועה מעגלית.

אפשרו לתאים להיקשר בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך לילה, ביום שלאחר ההפשרה. הסירו את המצע יחד עם תאים צפים והוסיפו לבאר 2.5 milliliters של מצע טרי לתרבית תאי ES אנושיים.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך הלילה, והמשיכו בתרבית עד שהמושבות יהיו מוכנות למעבר. פרוטוקול ההקפאה של תאי ES אנושיים מתחיל עם מושבות בריאות של תאי ES אנושיים בגודל בינוני שגודלו בצלחת שש בארות. לאחר דגירה של התרבית עם אנזים collagenase four, גוררים את המושבות באמצעות פיפטת זכוכית של 5 mL, אוספים אותן לשפופרת קונית ומסבבים בצנטריפוגה ליצירת משקע תאים רפוי.

לאחר שאיבת הנוזל העליון (supernatant), משחזרים את משקע התאים. ראשית עם מצע גידול לתאי ES אנושיים ולאחר מכן מדללים עם מצע לשימור בהקפאה (cryo-preservation medium) בריכוז פי שניים. התאים מחולקים באופן שווה למכסות (aliquots) של מילליטר אחד, ומוקפאים במבחנות קריוגניות.

בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה, סמנו את המבחנות הקריוגניות בתוך קבינת הבטיחות עם מספר המעבר של שורת התאים ותאריך ההקפאה. הצפיפות הטיפוסית להקפאת תאי E es אנושיים היא באר אחת של תאים מתוך פלטה בעלת שישה בארים עבור כל מבחנה קריוגנית. לאחר סיום סבב הצנטריפוגה של ה-human E ESL, העבירו את המבחנה חזרה לקבינת הבטיחות הביולוגית.

שאבו את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה. תוך כדי זהירות לא להפריע למשקע התאים הרופף, השעו את משקע התאים בכמות המתאימה של מצע גידול ESL אנושי.

0.5 מיליליטר של מצע תרבית של תאי ESL אנושיים למכל קריוגני. היו עדינים מאוד בעת הפעולה עם הפפיט, כיוון שתאי E es אנושיים מחלימים טוב יותר כאשר הם מוקפאים בחתיכות גדולות יחסית של מושבות; תוך כדי ניעור עדין ואיטי של המבחנה, הוסיפו לתאים את הכמות המתאימה של מצע הקפאה לתאי human E es בריכוז 2x.

לאחר הוספת מדיום ההקפאה, ערבבו את התמיסה על ידי פיפטא בצורה עדינה ביותר, פעם אחת או פעמיים, והוסיפו במהירות אך בעדינות 1 mL של תרחיף התאים לכל מבחנה קריוגנית. העבירו את המבחנות למכל הקפאה המכיל איזופרופנול והניחו במקפיא של 80°C- למשך לילה. התאים יקפאו בקצב של 1°C לדקה בתוך מכל ההקפאה עם האיזופרופנול ביום למחרת.

העבירו במהירות את המבחנות הקפואות למיכל אחסון של חנקן נוזלי באמצעות פינצטה ממתכת. ביום הראשון לאחר הפשרת תאי ES אנושיים, ייתכן שהמושבות הקטנות ייראו שקופות ויהיה קשה לראותן תחת המיקרוסקופ. מכיוון שהם הופשרו לאחרונה, תאי e ESL אנושיים נוטים להתרבות באיטיות יחסית.

עשויים לחלוף מספר ימים בתרבית עד שיופיעו כמושבות מבוססות. כעת הראינו לכם כיצד להפשיר ולהקפיא תרביות של תאי גזע עובריים אנושיים. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.