Name: שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: למד שיטות ניתוח וניתוח רקמת סתי בינית בדג הזברה לחקר ביולוגיה התפתחותית ורגנרטיבית. הפרוטוקול מדגים השתלת רקמה והכנה להיסטולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שיטות אלו פותחו על ידי צלופח במהלך חופשת מחקר במעבדה של JT תמיכה סופק על ידי אוניברסיטת DePaul המועצה למחקר NIH / NIDCR R01 להעניק JT (DE016678). אנו בתודה להכיר את המאמצים של האנטר קרוליין, טיפול בבעלי חיים טכנאי במתקן גרעין דג הזברה CMRC ופאולינה Pawluczuk, לבורנטית ראשון שלנו.

בעלי דג הזברה דג הזברה הם שוכנו וגודלו על פי שיטות סטנדרטיות 1. עבר תקופת הזחל מאוחר, בשלב ההתפתחותי של דג הזברה ניתן למדוד לפי אורך הסטנדרטי שלה (SL), או את המרחק במילימטרים קו ישר מנקודת anteriormost של השפה העליונה לבסיס של סנפיר הזנב (צלחת hypural posteriormost) 2. בשלב ההפריה כחודש פוסט (10-12 מ&quot;מ SL), את barbels האף לסתי מופיעים ניצנים אפיתל שקוף כמו ליד בורות חוש הריח ועל הפינות האחורי של maxillae, בהתאמה. כמו דג הזברה מתבגר, barbels להאריך לתוך צרה, זיף כמו הנספחים. מכיוון בינית לסתי גדול (2-3 מ&quot;מ), קל יותר לתמרן, פרוטוקול שלנו חלה רק על תוספת זו בפרט; בטכניקות דומות, לעומת זאת, יכול להיות מותאם קטן האף בינית. בינית Clipping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את דג הזברה בשלב הבוגר הרצוי (למשל., 1.5-2.5 ס&quot;מ SL, ~ 3-6 חודשים לאחר ההפריה) על ידי טבילה% 0.015 MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate) שנאגרו עד 7.0 pH במים המערכת. שימו לב עד תנועות לשחות לעצור אוורור הזימים הופך איטי וקבוע. בהתאם לגודל הדגים, הרדמה מלאה לוקח כ 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת רשת דייגים אקווריום, להעביר דגים 1-3 בכל פעם כדי פיסת מגבת נייר מקופל של רטוב בצלחת פטרי. בעזרת מרית בוטה, לכוון את הדגים ולכן הם מקבילים לרוחב כל צד שמאל אחרים למעלה. חלק מקפלים מגבת נייר רטובה על החלק הזנב של הדג, מכסה את כל הגוף עד operculum (מכסה הזימים) כדי לשמור על עור לח זימים במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את צלחת פטרי תחת stereomicroscope, באמצעות זווית נמוכה לאור התקרית כדי להאיר את אזור הראש. פוקוס על בסיס של בינית לסתי משמאל, אשר הבולטת מזווית הגחון האחורי של maxilla (איור 1). <img src="/files/ftp_upload/1558/1558fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזק לתפוס את פיר של בינית דיסטלי מעט לקצה maxilla. הגבהה של פיר בינית והכנס מלתעותיו של קנס שקצהו מספריים באביב הפרוקסימלי רק כדי מלקחיים. מספריים ניתן נגע אל מלקחיים ליציבות. החלק את הלסתות של המספריים לאורך הפיר של בינית עד חוד החנית גישות קצה maxilla. סגור את המספריים לחתוך דרך הפיר בינית. בינית קטוע, עדיין אחז ב מלקחיים, ניתן להסיר את קיבוע או תצפית נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הדגים לאקווריום קטן של מים מערכת נקייה (~ 500 מ&quot;ל) המכילה טיפה אחת של מתילן כחול לשלוט זיהום פטרייתי שטחי. אפשר הדגים להתאושש במהלך הלילה. למחרת בבוקר, להחזיר את הדגים למערכת גידול. בינית התחדשות היא מקסימאלית לאחר 2 שבועות. </li></ol> אגר והטבעה של זוגות בהתאמה בינית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הדגים על ידי המתת חסד טכניקה מתאימה לתקן בצינור 50 מ&quot;ל של 4% paraformaldehyde-שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) בהתרגשות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. נפח מקבע צריך להיות לפחות עשר פעמים את נפח הרקמה. לאחר קיבוע, להשליך פסולת paraformaldehyde במיכל מאושר ולשטוף את הרקמה ביסודיות כמה שינויים של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו זכוכית 250 מ&quot;ל 150 מ&quot;ל בקבוק של 2% agarose (T מ ~ 37 ° C) במים מזוקקים. מחממים עם מיקרוגל או צלחת חמה, התססה מעת לעת עד נמס לגמרי. לאזן את הפתרון מותך בתוך אמבט מים 50-60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מתקן סטנדרטי ג&#39;ל אלקטרופורזה ידי הצבת עובש קטן ג&#39;ל gasketed (10 x 10 ס&quot;מ, נפח ~ 100 מ&quot;ל ג&#39;ל) בתקיפות נגד צידי החדר חיץ. הוספת 2-4 קטן שיניים מדגם מסרקים (4 x 1.5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח ישר, ויוצקים את agarose נמס לתוך התבנית רק כדי לכסות את הבסיס של מסרקים, להרכיב בארות רדוד מאוד. מיד לשים את שאריות agarose בחזרה לתוך האמבט במים חמים, זה ישמש מאוחר יותר להטביע את הרקמה (שלבים 9-12). שים זכוכית ארוכה פסטר פיפטה לתוך הבקבוק כדי לשמור על פיפטה לטמפרטורה זהה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ג&#39;ל להתקשות במשך 20-30 דקות. הסר את מסרקים, ולאחר מכן להסיר את התבנית ג&#39;ל המכיל את ג&#39;ל מוקשה מן החדר חיץ. קלטת היטב את הצדדים לפתוח את הג&#39;ל של עובש עם הקלטת מעבדה כך הג&#39;ל אינו מחליק החוצה. סרט זה אמור להאריך כמה מילימטרים מעל פני השטח של agarose כך agarose נוסף ניתן להוסיף מאוחר יותר (שלב 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את תבנית ג&#39;ל על הבמה של stereomicroscope. הגדלה באר מים ריקה ולהביא את הקצוות אל המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פני השטח של agarose סמוך לבאר, פיפטה טיפת מים או חיץ המכילה את דגימות קבוע בינית (למשל, להתחדש ובקרה). USIng כפוף סיכות חרקים, גרור את דגימות לחות לתוך הבאר ולדחוף אותם לתחתית. המזרח פירים בינית מקבילים זה לזה מיושר נגד קצוות מנוגדים של ארוך היטב. מתח פנים יעזור להחזיק את הרקמה בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן להטביע, השתמש קצה פיפטה קנס או את הפינה של רקמות במעבדה כדי להסיר את הנוזלים העודפים מן הבאר. עבודה במהירות, כדי לא לתת הרקמה להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזכוכית חימם פיפטה פסטר, בעדינות פיפטה agarose מותכת טרי סביב דגימות כדי לאטום את רקמת בינית במקום. אל תמלא יותר מדי. לפני agarose מתקשה, לעשות שינויים של הרגע האחרון עם סיכות חרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הדגימה ממוספרת תווית נייר ליד הבאר לאבטח אותו עם טיפה קטנה של agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6 עד 10 עבור כל טוב של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה לצורך כיול התמונה, להוסיף פיסת נייר עם בקנה מידה מיקרומטר מודפס (לדוגמה, <a href="http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/">http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/</a> ) לתוך החלק התחתון של ריק היטב. שטחו את הנייר לתחתית הבאר לכסות את זה עם agarose חם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל הדגימות הם מוטבעים, את פני השטח של ג&#39;ל יהיה לא סדיר, עם טיפות של מוקשה agarose. מניחים את הג&#39;ל על משטח שטוח בעדינות ויוצקים פנימה agarose נמס נוספים עד משטח עליון אחיד. השתמש הסכום הקטן ביותר של agarose הכרחי כדי לקבל משטח חלק, יותר מדי agarose יהיה מעורפל מועבר אור בצילום. אפשר זו השכבה העליונה להתקשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל יכול להצטלם על הבמה של stereomicroscope להקליט מורפולוגיה ברוטו עבור כל זוג בינית. כיול תמונה מתקבלת על ידי מצלם את היקף מיקרומטר מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל כולו ניתן לאחסן עטופים במגבות נייר רטוב אטום בשקית ניילון ב 4 מעלות למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניתוח נוסף, קוביות אגר המכיל זוג מתאימים של barbels ניתן לגזור מתוך הג&#39;ל עם להב סכין מנתחים או סכין גילוח ומעובד היסטולוגיה פרפין או cryosectioning על ידי שיטות סטנדרטיות 3,4. לחלופין, barbels הפרט יכול להיות גזור מתוך agarose עם מחטים דקות, לשטוף במים, ומעובדים עבור יישומים במורד אחרים (למשל, כל הר או אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה confocal). </li></ol>

<ol><li>Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Howe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+length%3A+Not+quite+so+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Fisheries+Research+%28Amsterdam%29%22%5BJournal%5D)">Standard length: Not quite so standard.</a> Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+Tissue+Samples+for+Sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).</li>
<li>Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+development+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio.</a> Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).</li>
</ol>

לסתי דג הזברה בינית היא מערכת רקמות מנוצלים לחקר גדילה, תחזוקה, התחדשות של תאים מסוגים כמה דג הזברה. למרות תוספת בינית אין אנלוגי האנושי, סוגי התאים שהוא מכיל הם שמור ביותר, כך שניתן ללמוד, בלוטות בעור, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים במבנה גלילי ברור אופטית פשוטה מבחינה אנטומית. בדומה סנפיר היטב למד את הזנב, רקמה בינית יכול להיגרם להתחדש על ידי קטיעה. שימוש גבול maxilla כמו ציון דרך אנטומיים, המטוס קטיעה ניתן למקם במדויק, להקל על המדידה של בינית לצמיחה מחודשת. עבור מפעיל מנוסה, כל הניתוח לוקח רק כמה שניות. החלמה מהירה, ויש לנו זוהה עד כה ללא תופעות קצרות או ארוכות טווח על התנהגות הדגים. דג הזברה עם לשחות one בינית לסתי, לאכול להתרבות בצורה יעילה כמו ניתוחי שולטת, יש להשוות את זמן ההישרדות של אוסף רקמות, עד 6 חודשים לאחר הניתוח. ההשפעה הפיזיולוגית של ניתוח זה צפוי להיות מינימלי, כי 1) את בלוטות הטעם extraoral נישא על בינית נמצאים גם על חלקים רבים אחרים של האפיתל דגים, כולל שפתיים, לחיים וראש 5, 2) בלוטות הטעם להבדיל להופיע בינית התחדשות בתוך 72 שעות (LeClair et al., נתונים שלא פורסמו.) זה הופך את בינית לסתי מערכת פולשנית ללימוד ריפוי הפצע, revascularization ו reinnervation בהקשר של החולייתנים מבוגר. לאחר אינדוקציה כירורגית של התחדשות, barbels ניתן לאסוף במרווחים למדידת morphometric ו / או ניתוח מיקרוסקופי של רקמת קבוע. נוח, בינית לסתי כ אורך (2-3 מ&quot;מ) קוטר (100-200 מ&quot;מ) של עובר דג הזברה, להקל את היישום של פרוטוקולים סטנדרטיים רבים, כולל היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, כל הר אימונוהיסטוכימיה ו באתרו הכלאה. יחדיו, תכונות אלו להפוך את בינית לסתי ריאלי מאוד במודל vivo ללימוד ולתיקון רקמות והתחדשות.

מיקרוסקופ ציוד מיקרוסקופ סטריאו לנתח עם מועבר סיב אופטי תאורה האירוע נדרש גזיר בינית והטבעה אגר. בינית Clipping <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת דג במים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 דג הזברה מעבר טנקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MS-222 (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate; כימית Sigma # E10521-10G) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי 120 מ&quot;מ צלחת פטרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר מגבות רטובות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרית מתכת קהה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דומון # 55 ביו Inox מלקחיים (כלים המדע פיין # 11255-20) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-Mini-Vannas באביב מספריים (כלים המדע פיין # 15000-00) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחול מתילן פטריות סוכן (Drs. פוסטר &amp; Smith # CD-905781) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשת דייגים קטן באקווריום </li></ul> רקמות אוסף והטבעה אגר <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 paraformaldehyde% ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PF-PBS), aliquoted לתוך 50 מ&quot;ל צינורות חרוטי ומאוחסנים קפוא ב -20 ° C עד השימוש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x פוספט בופר (pH 7.27-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מ&quot;ל בבקבוק זכוכית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% agarose במים מזוקקים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן קטנה agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה לבוש (גודל ג&#39;ל = ~ 10 ס&quot;מ מרובע) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטן שיניים מדגם אלקטרופורזה מסרק (גודל מסרק 4 x 1.5 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים באמבטיה חמימים (50-60 מעלות צלזיוס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבדה קלטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחור אמייל סיכות חרקים, בגודל 000 (כלים המדע פיין # 26000-25) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 פינים בעלי (כלי מדעי פיין # 26016-12) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 אינץ&#39; זכוכית פיפטה פסטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הנורה או משאבה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במעבדה רקמת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר תוויות קטנות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (לא חובה) כיול מודפסים בקנה מידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נייר מגבות רטובות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רוכסן, סגירת תיק פלסטיק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזמל / גילוח להב (לחתוך קוביות אגר) </li></ul>

שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels הם הנספחים העור חושית למצוא דגים, זוחלים ודו. דג הזברה, Danio rerio, מפתחת שני זוגות זוג barbels האף קצר וזוג לסתי יותר. בינית מכיל רקמות תאים של ectodermal, mesodermal ומוצא הרכס העצבי, כולל בתאי העור, בלוטות, בלוטות הטעם, מלנוציטים, כלי הדם והעצבים התחושתיים. שלא כמו רקמות הבוגר ביותר, בינית לסתי ברור אופטית, ומאפשר לנו לחזות את פיתוח ותחזוקה של אלו סוגי רקמות לאורך כל מחזור החיים. וידאו זה מציג את התפתחות מוקדמת של בינית לסתי (החל כחודש לאחר ההפריה) ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות בתוך תוספת הבוגרת (&gt; 3 חודשים לאחר ההפריה). בקצרה, בינית לסתי השמאלי של דגים הרדים מוגבה עם מלקחיים סטריליות דיסטלי רק עד קצה הזנב של maxilla. בסדר, מספריים באביב סטרילי ממוקם נגד מלקחיים כדי לחתוך את פיר בינית ברמה זו, הקמת נקודת ציון אנטומיות למטוס קטיעה. צמיחה הרגנרציה ניתן למדוד ביחס למישור זה, בהשוואה בינית הנגדי. רקמה בינית מחדש במהירות, להגיע לצמיחה מחודשת מקסימלי בתוך 2 שבועות של פציעה. טכניקות לניתוח בינית מחדש כוללים לנתח והטבעה תואמים barbels (להתחדש ובקרה) של בארות של תקן ה-DNA ג&#39;ל אלקטרופורזה. דגימות Embedded מצולמים בנוחות תחת stereomicroscope עבור מורפולוגיה morphometry ברוטו, והוא יכול להיות מאוחסן במשך שבועות לפני יישומים במורד כגון היסטולוגיה פרפין, cryosectioning, ו / או אימונוהיסטוכימיה הר שלם. שיטות אלה להקים בינית לסתי כרומן במערכת רקמות vivo לחקר יכולת ההתחדשות של סוגי תאים מרובים בתוך ההקשר הגנטי של דג הזברה.

לסתי דג הזברה בינית הוא איבר חוש הכסות המכיל ectodermal, mesodermal ונגזרות הרכס העצבי. חשוב לציין, בינית מבוגר יכול להתחדש לאחר כריתה הפרוקסימלי. וידאו זה מציג לסתי פיתוח בינית ומדגים פרוטוקול כירורגי כדי לעורר התחדשות, ואחריו הדמיה, אוסף הטבעה במורד דגימות בינית.

שפמות הן נספחים חושיים של העור הנמצאים בדגים, בזוחלים ובדו-חיים. דג הזברה, *Danio rerio*, מפתח שני זוגות של שפמות - שפמות נחיר קצרות...

מרבלים (Marbles) הם אוסף הטרוגני של מבנים תחושתיים הנמצאים בדו-שהיות, זוחלים ודגים. דג הזברה מפתח שני זוגות של מרבלים: זוג נחיר קטן יותר וזוג מקסילי (maxillary) גדול יותר. ניתן להשתמש בנספחים שקופים אלו כדי לחקור את הפיתוח, התחזוקה והה regeneration של מספר סוגי תאים בדג הזברה.סרטון זה מציג את התפתחות השיש הלסתי (maxillary marble) ומדגים פרוטוקול כירורגי להשראת רגנרציה. הקוצים נאספים מספר ימים או שבועות לאחר מכן, ולאחר מכן מבוצעים נתיחה והטמעה של הרקמות המשוחזרות ושל הביקרות. שלום, אני אליזבת לקלייר ממעבדת לקלייר באוניברסיטת דפול, ואני יע Chesky מהפקולטה לרפואה של אוניברסיטת נורת'ווסטרן ומרכז המחקר של בית החולים לילדים Memorial.היום נדגים מספר פרוצדורות למחקר של ה-maxillary marble בדגי zebrafish. אנו משתמשים בפרוצדורות אלו כדי לחקור את הצמיחה וההתפתחות של ה-marble בדגי zebrafish. בואו נתחיל.בקירוב 30 עד 40 ימים לאחר ההפריה, השפם העליון (maxillary barbell) מופיע כניצן אפיתלי שקוף ליד הפינה הוונטרלית האחורית של הלסת העליונה. ככל שדג הזברה מתבגר, השפם מתארך לכדי נספח דמוי שפיר צר, באורך של מספר מילימטרים. השפם הבוגר מכיל מספר סוגי תאים חשובים, כולל תאי פיגמנט, תאי בלוטה, פפילי טעם, כלי דם ועצבים מיאלינתיים.היתרון הגדול ביותר הוא שהשיש שקוף בכל שלבי התפתחותו. בדומה לאיברים אחרים בדג הזברה, השפם העליון (maxillary barbell) יכול להתחדש לאחר קטיעה פרוקסימלית. בחלק זה, נדגים הליך לגזירת השפם בבסיס הלסת העליונה (maxilla).פעולה זו יכולה להיקרא גם אקטומיה חד-צדדית. ביום הניתוח, הכינו שני מיכלים קטנים עם מי דגים, אחד להרדמה ואחד להתאוששות. מיכל ההרדמה מכיל 0.015% trica במאזן pH 7.0.במי הדגים, מיכל ההשקמה מכיל דגים, מים וטיפה של מethylene blue לשליטה בזיהומים פטרייתיים. הרדימו דג זברה בוגר אחד עד שלושה על ידי טבילה במיכל ה-trica; עקבו עד שתנועות השחייה פוסקות והאוורור של ה-GI הופך לאיטי וסדיר. בהתאם לגודל הדג, השגת הרדמה מלאה עשויה לארוך בין שתי לחמש דקות.השתמשו ברשת לדגי אקווריום כדי להעביר את הדגים לחתיכת נייר סופג רטוב על גבי צלחת פטרי. באמצעות שפכטל קהה, סדרו את הדגים כך שיהיו מקבילים זה לזה. כאשר הצד הלטרלי השמאלי פונה כלפי מעלה, קפלו חלק מנייר הספיג מעל הדגים כדי לשמור על לחותם.בשלב הבא, התבוננו בצלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי תוך שימוש בתאורה שחורה מזווית נמוכה כדי להאיר את הראש. התמקדו בבסיס השיש של הלסת העליונה השמאלית באמצעות פינצטה עדינה. אחזו בחוזקה בגוף השיש מעט דיסטלית לשפה של הלסת העליונה.הרימו את הגולה והחדירו מספרי קפיץ בעלי קצה דק ממש פרוקסימלית למלקחיים לצורך יציבות. המספריים יכולים לגעת במלקחיים או לחלופין בתחתית פטריאצ'ה. החליקו את להבי המספריים לאורך ציר הגולה עד שחלק החיתוך יתקרב לקצה הלסת העליונה.חתכו את מוט השיש והסירה את השיש הקטוע. רקמה זו ניתנת לקיבוע ולניתוח בנפרד. לאחר הניתוח, העבירו את הדג למכל ההתאוששות.אפשרו לדגים להתאושש במשך מספר שעות ועד ללילה, והחזירו אותם למערכת הגידול. המתינו שבוע עד שבועיים עד להתרחשות התחדשות השפם. בחלק הבא נראה כיצד להכין רקמת שפם מקובעת לניתוח.הליך זה מתחיל עם דגימות של שיש (marbles) שנאספו וקובעו ימים, שבועות או חודשים לאחר הניתוח. שטפו את הרקמה המקובעת בתמיסת סלין במאזן (buffered saline solution) ובצעו דיסקציה להוצאת ה-marble המשוחזר מהצד השמאלי של הראש. אל תשכחו את ה-barb הימני, המשמש כביקורת לאחסון זמני.העבירו באמצעות פיפטה כל זוג גולות תואם לתוך טיפה של תמיסת מלח על צלחת פטרי. כסו במכסה והשאירו על השולחן בזמן שאתם מתרחקים. הכינו את הג'ל על ידי חימום של 150 milliliters של 2%agros עד להמסה מלאה.הביאו את התמיסה לשיווי משקל באמבט מים בטמפרטורה של 50 עד 60 מעלות Celsius. לאחר מכן, הרכיבו מערך סטנדרטי לאלקטרופורזה של ג'ל והוסיפו שיניים קטנות אחת עד ארבע לדגימות. צקו את האגרוז המומס לתבנית הג'ל על משטח מאוזן, והוסיפו כמות מספיקה רק ליצירת בארות רדודות מאוד.החזירו מיד את שאריות ה-aros לאמבט המים החמים. הכניסו פיפטת פסטור מזכוכית ארוכה כך שהפיפטה תגיע לאותה טמפרטורה של ה-aros. לאחר שהג'ל יתקרר, הסירו את המסרקים ולאחר מכן את תבנית הג'ל.כדי לקבע את הג'ל בצורה יציבה, הדביקו את שני הצדדים בסרט הדבקה למעבדה בצבע המועדף עליכם. סרט ההדבקה צריך להתרחב מספר מילימטרים מעל פני ה-agar כדי שניתן יהיה למזוג agarose נוסף מאוחר יותר. מקמו את תבנית הג'ל על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו. הגדילו באר ריקה והביאו את הקצוות לפוקוס.העבירו את הגוליות ממעטפת הפטרי אל פני הג'ל בסמיכות לבאר, באמצעות ידיות המצוידות בסיכות חרקים כפופות. גררו את הגוליות אל תוך הבאר ודחפו אותן לתחתית. יישרו את המשקולות כך שיהיו מקבילות זו לזו וצמודות לדפנות הארוכות של הבאר. לפני ההטמעה, השתמשו בפיפטה עדינה או בנייר סופג למעבדה כדי להסיר עודפי נוזלים.השתמשו בפיפטת זכוכית מחוממת כדי להוסיף בעדינות agros נוזלי וטרי מסביב לרקמה. בצעו התאמות אחרונות לפני שה-agros מתגבש, והימנעו ממילוי יתר של הבאר. רשמו את מספר הדגימה על ידי הוספת פתק נייר קטן ומסומן בקרבת מקום.לאחר שכל הדגימות מוטמעות, יש להחליק את פני השטח העליונים של הג'ל על ידי מזיגת שכבה דקה של aros מעל. השתמש בכמות מועטה ככל האפשר כדי שהג'ל יישאר שקוף לצילום. ברגע שהג'ל התקשה, ניתן לצלם אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לתעד את הגודל והצורה של כל זוג שיש ולאסוף מדידות מורפומטריות לצורך ניתוח נוסף.ניתן לחתוך מהג'ל בעזרת סקאלפל או להב תער בלוקים של אגר המכילים זוגות תואמים של גולמיות (marbles). ניתן לעבד בלוקים אלו להיסטולוגיה בפראפין או לחיתוך קריוסטטי (cryosectioning) בשיטות סטנדרטיות. לחלופין, ניתן להוציא גולמיות בודדות מהאגר באמצעות מחטים עדינות שנשטפו במים, ולאחר מכן לעבד אותן ליישומים המשכיים אחרים, כגון אימונוהיסטוכימיה של דגימה שלמה (whole mount immunohistochemistry) או מיקרוסקופיה קונפוקלית.לבסוף, ניתן לאטום את הג'ל כולו בשקית ולאחסנו בקירור. הדגימות יישמרו למשך מספר שבועות. כעת הדגמנו כיצד לצפות בניב והניתוח של סרגל הלסת העליונה (maxillary bar) בשלבי התפתחות והסתמנות.זוהי מערכת חדשה בדגי זברה, ולכן יש עוד הרבה מה לגלות. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

methods-for-the-study-of-the-zebrafish-maxillary-barbel

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

ניתוח אלמנטים סופיים הוא כלי בשימוש תכוף לחקירת הביצועים המכניים של מבנים תחת עומס. כאן אנו מיישמים את השימוש בו למידול הביומכניקה של לסת דג הזברה.

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.

הסטה דג זברה קטלני השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדוד מתח במהלך הפעולה במהלך בגרות דג מבוגר. הגישה מנצלת את הנטייה הטבועה שדגים מעדיפים את החצי התחתון של הטנק כאשר במצב מלחיץ. כמו כן, אנו מתארים שיטות לזיווג עם פרמקולוגיה.

גישות התנהגותיות לחקר הלחץ הטבוע בדג זברה

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

פרוטוקול זה מתאר את הקציר וההדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות in vivo . בנוסף, תרבות ex vivo של קשקשים אלה עד 7 ימים לאחר הקציר מוצג.

התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו

הפרוטוקול המתואר כאן מציג הליך פשוט וקל לביצוע לצביעה וניתוח סחוסי גולגולת פנים בזחל דג זברה בן 5 ימים. בעזרתו ניתן לחקור את האנטומיה, הצורה והגודל של מבנים אלה בתנאי התפתחות שונים.

דיסקציה של רקמות הגולגולת של דג הזברה לאחר צביעה בכחול אלציאני

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות צורת הסחוס הקרניופציאלי באמצעות תוכנה חופשית (tpsDigs2, MorphoJ ו-PAST) למדידת שינויים במבנה הפנים של זחלי דגי זברה.

ניתוחים מורפומטריים של צורה: ארגז כלים לתוכנת ניתוח לכימות צורת קרניופנים בדגי זברה

למד שיטות ניתוח וניתוח רקמת סתי בינית בדג הזברה לחקר ביולוגיה התפתחותית ורגנרטיבית. הפרוטוקול מדגים השתלת רקמה והכנה להיסטולוגיה.

שיטות מחקר של דג הזברה לסתי בינית

גלה סרטונים נוספים