August 13th, 2009
טכניקה המשלבת ב מכתים tetramer באתרו של הכלאה באתרו (ISTH) מאפשר, הדמיית מיפוי וניתוח של הקרבה המרחבי של ספציפיים וירוס CD8 תאים + T ליעדים הנגועים בנגיף שלהם, וקביעת היחסים הכמותיים בין effectors מטרות החיסונית לתוצאות זיהום.
על ידי שילוב הכלאה באתרה וצביעה של טטרה בטכניקה המכונה ISTH, ניתן לקבוע את המספרים היחסיים והיחסים המרחביים בין תאי אפקטור חיסוני ספציפיים לאנטיגן ויראלי לבין תאים ורקמות נגועים בנגיף. ISTH מתחיל בהטמעת רקמה נגועה ב-SIV באגרוס. הרקמה נחתכת לחלקים בעובי 200 מיקרון באמצעות ויברטו ונצבעה לאנטיגן נגיפי.
CD ספציפי שמונה תאים חיוביים באמצעות טטרמרים MHC המסומנים בהתאמה C. לאחר ההקפאה, קטעי הכתמים הללו נחתכים עוד יותר למקטעים בעובי שמונה מיקרומטר באמצעות קריוסטט ומבוצעת הכלאה באתרה כדי לאתר תאים נגועים ויראליים. מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להדמיית קטעי הכתם הכפול ובסופו של דבר לשחזר את החלקים העבים המקוריים כדי לחשוף את הקשר בין אפקטור החיסון לתאי המטרה.
שימוש בהליך זה לבחינת זיהום SIV מוקדם הוכח כמנבא טוב לחומרת המחלה שלאחר מכן. היי, אני צ'ינן לי מעץ המעבדה של אשלי HA במחלקה למיקרוביולוגיה באוניברסיטת מינסוטה. אני פאם סקינר, עוזרת פרופסור במחלקה למדעים ביו-רפואיים וטרינריים באוניברסיטת מינסוטה.
היום נראה לכם נוהל להכלאה פנימית במכון או בקיצור ISTH. בנוסף לשימוש בצביעת אינצ'י טיר בשילוב עם הכלאה של אינצ'י כפי שאנו מדגימים היום, אנו משתמשים באופן שגרתי בצביעת אינצ'י טיר בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע את המיקום, השפע ופרופיל ביטוי החלבון של תאי CD שמונה T ספציפיים לאנטיגן באתרך. מסייעים לנו היום עם הצביעה באתרכם עם החלקים העבים יהיו ד"ר הון קים וטרי מטלה ויסייעו לנו בהכנת חתך דק ובמקום ההכלאה שלך תהיה אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בהליך זה, יש לצנן את אמבט הוויברם המכיל PBSH סטרילי עד אפס לשתי מעלות צלזיוס. הגדר את זווית להב הוויברטור ל-27 מעלות. במידת האפשר, שמור טישו טרי מקורר על קרח והתחל בהליך תוך 24 שעות לאחר קצירת הרקמות.
על מנת למזער את קירור הפירוק, הוויברם גם מקל על חיתוך רקמה טרייה, חיתוך רקמת חיבור וחתוך את הדגימה עם אזמל לחתיכות קטנות ומכניס את החלקים לסירת מי גבינה ומכסה ב-4% נמס נמוך. אגרוס ב-PBS נמס בסביבות 40 מעלות צלזיוס. וודאו שהטישו נמצא במגע עם תחתית הכלי ודחפו את חתיכות הרקמה כלפי מטה אם הן צפות, התמצקו על קרח למשך שלוש עד חמש דקות.
כאן משתמשים ברקמת הטחול, אך ניתן להשתמש גם בבלוטות הלימפה, הנרתיק, צוואר הרחם, הרחם או רקמות טריות אחרות עם אזמל. חותכים את האגרוס סביב הרקמה ובעזרת מלקחיים מעבירים בזהירות את הרקמה המוטבעת באגרוס לגוש הרקמה. המשך בציפוי גוש רקמות Vibram בדבק Loctite.
אין להזיז את פיסת הרקמה ברגע שהיא מונחת על גוש הרקמות. מניחים להתייבש כ -10 דקות על קרח. לאחר מכן, הרכיבו את גוש הרקמה בוויברטור וחתכו את הרקמה למקטעים בעובי 200 מיקרומטר באמצעות מהירות קדימה איטית ומשרעת גבוהה יחסית.
השתמש במכחול כדי להעביר את החלקים החתוכים לתא רקמות מיוחד המוגדר בבאר של צלחת תרבית רקמות בת 24 בארות ממולאת מראש במיליליטר אחד של PBSH צונן. הכניסו עד ארבעה קטעי רקמה לכל תא רקמות. סמן את הדגימות והדק את המכסה לצלחת עם גומייה על מנת להכתים את חלקי הרקמה עבור תאי T ספציפיים לנגיף.
טטרמרים מצומדים של ZI מדוללים תחילה במאגר חוסם ל-0.5 מיקרוגרם למיליליטר. התמיסה מוזרמת לצלחת של 24 בארות במיליליטר אחד לבאר. הרקמה הטרייה שנחתכה מועברת לצלחת בתאי הרקמות ומניחה לה להתנדנד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
שמור באר ריקה בין תאי רקמות המכילים דגימות שונות כדי למנוע זיהום צולב של תמיסות בשלבים הבאים. בשלב זה ניתן להוסיף נוגדנים המכוונים כנגד חלבונים חוץ-תאיים או פני התא. לכביסה, הכינו צלחת תרבית רקמות 24 באר המכילה PBSH צונן לאחר הדגירה הראשונית.
נשטף פעמיים על ידי העברת תאי הרקמות לצלחת ממולאת מראש למשך 20 דקות בכל פעם, הקפד לנקז את רוב הנוזל מתאי הרקמות לפני ההעברה. כמו כן, אין לטפטף תוכן של דגימה אחת לאחרת בעת הזזת תאי הרקמות ולפקח על החלקים בתאי הרקמות כדי לוודא שהם לא נדבקים לצדדים. תקן את החלקים עם 4% פרלדהיד טרי ב- PBS למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר הקיבוע.
נשטף פעמיים עם PBSH קר במשך חמש דקות בכל פעם כדי להגביר את האות מהטטרמרים. דגרו את החלקים עם נוגדנים אנטי פיצי של ארנב ביחס של אחד ל -10,000 במאגר חוסם למשך יום עד שלושה ימים. בשלב זה ניתן להוסיף נוגדנים כנגד אפיטופים תוך-תאיים.
הקפדה על חלחול התאים וחסימת אתרים לא ספציפיים לפני הוספת הנוגדן. אחזור אנטיגן עשוי להידרש גם לאחר הדגירה הארוכה השנייה שנועדה להגביר את האות. שטפו את החלקים ב-PBSH שלוש פעמים למשך 20 דקות לפחות ועד מספר שעות בכל פעם.
בצע דגירה סופית עם נוגדנים מתאימים עם תווית פלואורסצנטית. לדוגמה, אפשר להשתמש בעז נגד ארנב SI 3 כדי לקשור את הנוגדנים נגד פיצי של הארנב כדי לגרום לתאי צביעת הטטרמר להאיר באדום. אם נעשה שימוש בנוגדנים של עכברים כדי לנטרל חלבונים מעניינים, כגון CD 8, כדי לדמיין תאי T קטלניים, ניתן להשתמש בעז אנטי-US Alexa 488 כדי להיקשר לנוגדנים של העכבר ולגרום לתאי הנוגדנים להכתים את הפלורזיה, יש לקבוע באופן אמפירי דילולים ירוקים של כל נוגדן.
דגירה למשך יום עד שלושה ימים שמור על חלקים מוגנים מפני אור על ידי עטיפת הצלחות ונייר הכסף במהלך הדגירה הזו ולאחר מכן כאשר האור מרווה את הצמחייה. לבסוף תקן שוב את החלקים כדי לאבטח את הטטרמרים והנוגדנים במקומם. שוטפים ומרכיבים על שקופית מיקרוסקופ עם גליצרול ג'לטין המכיל ארבעה מיליגרם למיליליטר פרופיל N גלאט לאחסון במינוס 20 מעלות צלזיוס עד להכנת חלקים דקים להכלאה באתר.
כעת ניתן לנתח את קטעי צבע הטטרמר של המכון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי על מנת לקבוע את הלוקליזציה, השפע ודפוס ביטוי החלבון של CD ספציפי לאנטיגן, שמונה תאי T חיוביים בתמונה הראו קטעי רקמת טחול משקע נגוע ב-SIV, meac נצבע בטטרמרים של גאג כדי לסמן CD ספציפי ל-SIV, שמונה תאי T חיוביים, נוגדנים CD 20 ונוגדני CD שלושה נוגדנים. מכיוון שמונים מכתימים בנוגדנים יאבדו בשלב הבא. חשוב לנתח טטרמרים באתרם לפני שממשיכים הלאה.
התחל את הליך החיתוך הדק על ידי חימום החלקים בעובי 200 מיקרון ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות על גוש חום על מנת לנתק חלקים עבים מהמגלשה. לאחר ניתוק החלקים, הטמיעו אותם ב-OCT על קרח יבש על ידי מילוי תחתית תבנית הפלסטיק ב-OCT. לאחר מכן הניחו את הממחטה על גבי ה-OCT וכסו אותה ב-OCT.
השתמש בקריוסטט כדי לחתוך חלקים בעובי שמונה מיקרון מהחלקים המוטבעים ב-OCT ולהדביק את שמונת חלקי המיקרון לשקופיות מבודדות. לאחר מכן ניתן לאחסן את השקופיות במינוס 80 מעלות צלזיוס בקופסה אטומה להכלאה באתר. הכלאה סטנדרטית באתרה משמשת לאיתור תאים נגועים בנגיף באמצעות בדיקות צלעות ספציפיות לנגיף המסומנות S 35.
ההליך כולל גם קטעי ציפוי עם תחליב מסלול גרעיני ושקופיות הרכבה. במדיום פלואורסצנטי תואם תמונות קונפוקליות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי BioRad MRC 1000, המצויד במכשיר השתקפות כחול של צינור אפי. צביעת הטטרה של האינסטיטו מודגמת באמצעות ה-EPI אחד 605 עבור הטטרה פלואורוכרום האדום ו-EPI 2 522 DF 32 עבור ה-CD הירוק שמונה פלואורוכרום עבור הכלאה אינסטו.
השתמש בהשתקפות הכחולה של EPI עבור גרגרי הכסף הנובעים מאות ההכלאה באתרו בחתימות הרדיו שפותחו. כדי להתחיל ברכישת תמונות, רכוש את התמונות מכל קטע משמאל לימין ומלמעלה למטה והקפד לצלם כל תמונה עם חפיפה של כ-20% עם התמונות השכנות. כדי למנוע פערים בתמונת המונטאז' המשוחזרת, תן שם לכל תמונה לפי האח והעמודה שלה בקובץ Excel.
לאחר השלמת איסוף הנתונים מהשקופיות, השתמש בתוכנת המסייע הקונפלי כדי להקרין תמונות טוריות Z עבור כל ערוץ לתמונה אחת באמצעות הליך שבע פעולות של Photoshop הזמין אצל המחברים, ומזג אוטומטית את התמונה המוקרנת משלושת הערוצים לתמונת RGB אחת. לאחר מכן תפר את התמונות הממוזגות יחד בשכבות כדי ליצור תמונת מונטאז' של כל הקטע. שייך גרגרי כסף בודדים וכתם טטרמר לתאים במונטאז' באמצעות מטמורף או פוטושופ.
הקצה את קואורדינטות ה-XY של המרכזים או ה-OIDs של התאים החיוביים ל-RNA הנגיפי והתאים החיוביים לטטרמר. ייצא את נתוני ה-OID לקבצי אקסל כמספרים מספריים עבור כל תא והשתמש בנתונים שנאספו בקבצי האקסל כדי לקבוע את היחסים בין תאי אפקטור חיסוני או תאי e למטרות נגיפיות או תאי T מהמספרים הכוללים של תאים חיוביים לטטרמר ותאי RNA חיוביים נגיפיים בחתך כדי ללכוד את הקשרים המרחביים בין תאים חיוביים לטטרמר לתאים חיוביים ל-RNA. העתק והדבק את העלילות המתאימות מקובצי Excel למסמך Photoshop ב-Photoshop.
הפחיתו את האטימות של שכבה כדי ליישר את הרשתות ולשנות את גודלן כך שהן יהיו חופפות לצבע, בחרו ולאחר מכן העתיקו והדביקו בשכבה חדשה. מיקומם של התאים החיוביים של ה-RNA הכחול משליך את השכבה המשמשת ליישור הרשתות והמיקומים של התאים החיוביים של הטטרמר והחיוביים ל-RNA הנגיפי יתגלו בתמונה השטוחה. באמצעות שיטת ISTH המוצגת כאן, אנו מסוגלים לעקוב אחר התגובה החיסונית לזיהום SIV לאחר חיסון תוך נרתיקי בשער כניסה זה וברקמות הלימפה שאליהן מתפשט הזיהום.
יש מספר גדול של תאים נגועים באתרי רקמה אלה 10 ימים לאחר ההדבקה, אך עד שלושה ימים לאחר מכן, ישנם תאים חיוביים ל-CD A בצבע ירוק, אך עדיין לא. תאי טטרה חיוביים ספציפיים ל-SIV מוכתמים באדום. לכן התגובה החיסונית מאוחרת מדי לנקות את הזיהום.
עם זאת, שלושה שבועות לאחר ההדבקה, ירידה בתאים נגועים נראית בבירור, במיוחד בשער הכניסה. השתמשנו ב-ISTH כדי להראות כי מידת ההפחתה הייתה בקורלציה עם קרבה מרחבית ומספרים יחסיים של תאי אפקטור חיסוני חיוביים לטטרמר. תאי מטרה חיוביים N-S-I-V-R-N-A, אנו קוראים לזה יחס in vivo E ל-T.
הקשרים המרחביים נראים בקלות בשיטה זו עם תאי אפקטור באדום ומטרות נגיפיות בכחול בבלוטת לימפה נגועה זו. תאי אפקטור ומטרה רבים נמצאים בסמיכות וישנם אזורים שבהם תאי אפקטור רבים מקיפים תא חיובי יחיד S-I-V-R-N-A בעוד שבאזורים אחרים תא חיובי S-I-V-R-N-A עומד בפני עצמו. היחס של ETT מחושב פשוט כאשר מיקומי התאים נקבעים ונכנסים לפי המספרים של כל אחד מהם בקובץ האקסל.
השליטה הטובה ביותר בזיהום הנגיפי נמצאת בקורלציה עם עודף גדול באפקטורים אדומים על פני מטרות ירוקות 43 לאחד. במקרה זה, בצוואר הרחם ובנרתיק שבהם החל הזיהום יחסי ETT היו נמוכים יותר בבלוטות הלימפה. המתאם החיובי בין יחסי ETT גבוהים להפחתת העומס הנגיפי מהשיא מצביע על כך שתגובה חיסונית חזקה יותר בשער הכניסה מתורגמת לשליטה טובה יותר בזיהום.
זה עתה הראינו לך כיצד לזהות בו זמנית את תאי ה- CDAT הספציפיים מאוד ואת תא הזיהום בנגיף באתרו. טכניקה זו מאפשרת לנו לדמיין בו זמנית תאי T ספציפיים לאנטיגן ותאים נגועים בנגיף ברקמות. ניתן ליישם טכניקה זו כדי להעריך את החיסון המבוסס על תאי T חיוביים CD שמונה ואת הפתוגן האחר שאינו בעל ערך ואינטראקציה עם המארח בעת ביצוע הליך זה.
חשוב לשמור על כל ה-RNA של הריאגנטים פנויים לפני התובנות שאתה מכליא. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
מאמר זה מציג טכניקה הנקראת צביעת טטרמר in situ בשילוב עם הכלאה in situ (ISTH) לניתוח היחסים המרחביים בין תאי T CD8+ ספציפיים לנגיף והמטרות שלהם. שיטה זו מאפשרת הדמיה ומיפוי של תגובות חיסוניות ברקמות הנגועות בנגיפים, ומספקת תובנות לגבי תוצאות ההדבקה.
Understanding the spatial dynamics between virus-specific CD8+ T cells and infected target cells is critical for evaluating immunotherapeutic efficacy and predicting infection outcomes. The ISTH method enables quantitative assessment of effector-to-target ratios and spatial proximity, providing mechanistic insights that support target validation and lead identification in antiviral development. This approach enhances predictive confidence by linking early immune interactions to disease trajectory, informing go/no-go decisions in preclinical pipelines.
The ISTH method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven analysis of immune-target interactions after initial lead identification but before efficacy confirmation in disease models.