Name: אבי העורקים Assay טבעת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-24T15:33:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: חקור שיטת טבעת אבי העורקים לחקר אנגיוגנזה בביולוגיה כלייתית באמצעות חתיכות אבי עורקים של עכברים במטריצה תלת-ממדית. שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של פוטנציאל אנגיוגני של תרכובות שונות במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

יום אחד לפני הניסוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר BME (גורם גדילה מופחת, Cultrex, Trevigen) להפשיר על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס; מופשר פעם לשמור על הקרח כדי למנוע מחדש לחיזוק. </li></ol> יום של הניסוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים (6-7 שבועות) יש הרדים ודימם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבי העורקים החזי הסר לתוך צלחת פטרי מלאות קר סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניקוי מכני של לרקמות שומן. שים לב, למנוע ייבוש של האאורטה בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלהב כירורגי, פרוסה באופן שווה לתוך אבי העורקים 1 מ&quot;מ טבעות. לחתוך חייב להיות אחיד ונקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת טבעות טרי קר PBS ולשמור על הקרח בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טרום מקורר טיפים פיפטה, להוסיף גם כל צלחת 48-באר טיפה מעוגלות של BME 150 מ&quot;ל קר. אפשר טיפה BME לחזק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טבעת אבי העורקים יחיד במרכז החלק העליון של הכיפה כל אחד. דגירה במשך 10 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על גבי כל טבעת להוסיף BME נוסף 150 מ&quot;ל. דגירה של 20-30 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני: בינוני האדם אנדותל חופשי בסרום (GIBCO, בקרלסבד, קליפורניה) בתוספת FCS 2%, 50 יחידות / מ&quot;ל ​​פניצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין (Cellgro). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחד גם להוסיף 500 מ&quot;ל בינוני המכיל גם: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסיוני דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרה חיובית: תא האנדותל צמיחה תוספת (ECGS, הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל, BD Biosciences). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה שליליות: בינונית בלבד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 12 ימים, טבעות תצלום בין 6 ימים ו -12 תחת stereoscope שלב תקן בניגוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: איסוף supernatants. </li></ol> הערות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור בתנאים סטריליים בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע הקדמה של בועות לתוך BME. </li></ol>

<ol><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular Research. 74, 172-183 (2007).</li>
<li>Masson, V., Devy, L., Grignet-Debrus, C., Bernt, S., Bajou, K., Blacher, S., Roland, G., Chang, Y., Fong, T., Carmeliet, P., Foidart, J. M., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aortic+ring+assay%3A+a+new+approach+of+the+molecular+genetics+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse aortic ring assay: a new approach of the molecular genetics of angiogenesis.</a> Biol. Proced. Online. 4, 24-31 (2002).</li>
</ol>

Assay טבעת אבי העורקים הוא כלי מועיל בדרך להעריך angiogenic כמו גם נגד גורמים angiogenic. כלי שגדלים מתוך תאים טבעות אבי העורקים לגייס שרירים חלקים pericytes לקשר עם צינור תא האנדותל, כלומר שהם דומים מבחינה אנטומית neovessels in vivo. יתר על כן, אבי העורקים עכבר assay הטבעת מחזיקה את היתרון של מערך עצום של כלים מהונדס זמין עבור מין זה. עם זאת, יש כמה חסרונות ל assay את הטבעת אבי העורקים. ראשית, כלי תולדה in vivo מתרחשת מתוך microvessels ולא מכלי מרכזיים כגון אבי ...

אבי העורקים assay טבעת

Aortic Ring Assay

אנגיוגנזה, מצמיח כלי דם בכלי הדם preexisting קשורה בשני תהליכים טבעיים פתולוגי. מבחני אנגיוגנזה שונים לערב את המחקר בתאי האנדותל של הפרט בתנאים תרבות (1). Assay טבעת אבי העורקים הוא מודל אנגיוגנזה המבוסס על תרבות איברים. ב assay זה, כלי angiogenic לצמוח מתוך קטע של אבי העורקים (שונה מ - (2)). בקצרה, אבי העורקים החזי העכבר הוא נכרת, שכבת שומן adventitia מוסרים, וטבעות כ 1 מ&quot;מ באורך מוכנים. טבעות אישיות המוטבעים אז בכיפה מוצק קטן של תמצית מרתף מטריקס (BME), יצוק בתוך בארות בודדים של צלחת 48-באר. גורמים angiogenic ו מעכבי אנגיוגנזה ניתן להוסיף ישירות את הטבעות, מעורבת שיתוף התרבות של טבעות אבי העורקים ואת סוגי תאים אחרים יכול להיות מועסק לחקר תופעות angiogenic אוטוקריני. להנבטה היא נצפתה על ידי בדיקה תחת stereomicroscope על פני תקופה של 6-12 ימים. בשל השונות הגדולה הנגרמת על ידי אי סדרים במגזרים אבי העורקים, ניסויים 6-plicates מומלץ בחום. תוצאה Neovessel מנוטר במהלך הניסוי צילמו באמצעות מיקרוסקופ שלב, ואת supernatants נאספים למדידת גורמים angiogenic ואנטי angiogenic רלוונטי, מוות של תאים סמנים הניטריט.

אנגיוגנזה, מצמיח כלי דם בכלי הדם קיימים, קשור גם בתהליכים טבעיים פתולוגי. כאן אנו מדגימים assay טבעת אבי העורקים המאפשר potentiators angiogenic ומעכבי להתווסף ישירות טבעות אבי העורקים בתרבות. להנבטה ו תולדה neovessel ניתן לקבוע באמצעות בדיקת מצלצל אבי העורקים על פני תקופה של 6-12 ימים.

אבי העורקים Assay טבעת

אנגיוגנזה (Angiogenesis), ניבט של כלי דם מכלי דם קיימים, קשורה לתהליכים טבעיים ופתולוגיים כאחד. תהליכי אנגיוגנזה שונים...

המטרה הכללית של בדיקת טבעת האורטה (aortic ring assay) היא לספק מערכת ניסיונית גמישה שבה כלי דם צומחים מחתיכות שלמות של אורטה של עכבר בתוך מטריצה תלת-ממדית. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחה והוצאה של האורטה החזיית מעכבר, ולאחר מכן ניקוי קפדני של כל רקמה סביבה שנותרה. פרוסות של האורטה הנקייה או טבעות אאורטליות מונחות בתוך בארות בודדות של פלטה בעלת 48 בארות, כאשר כל בארה מכילה תמצית מטריצה בסיסית (BME) המעוצבת ככיפות.טיפה נוספת של BME עוטפת את הטבעת במבנה תלת-ממדי. המטריצה יכולה להכיל כל ריאגנט ניסויי מתוכנן. לאחר דגירה של מספר ימים, ניתן להבחין בכלי דם המנבטים מטבעות האורטה, ובכך ניתן להעריך את הפוטנציאל האנגיוגני של תרכובות הבדיקה.שלום, אני קרן ביין מהמעבדה של ד"ר E. Lewis במחלקה לבכימיה קלינית באוניברסיטת Beon of the Negative בבאר שבע, ישראל. היום נדגים לכם פרוטוקול לביצוע בדיקת טבעת אאורטה בעכברים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של חומרים שונים על היווצרות כלי דם.אם כן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, יש להמיס את תמצית המטריצה של בשראת הבסיס (BME) על קרח או בטמפרטורה של 4 °C. לאחר ההמסה, יש להמשיך לשמור על ה-BME קריר כדי למנוע ממנו להתמצק שוב.ביום הניסוי, השCח עכבר בן שש עד שבעה שבועות באמצעות הזרקה סטנדרטית של ketamine ו-xylazine, בצע דימום מהיר דרך עורקי הצוואר, ולאחר מכן בצע נתיקה של חוליי הצוואר (cervical dislocation). התחל את ההליך בניגוב בעל החיים ב-70% ethanol תחת מครอบ זרימה למינרית סטרילי. לאחר מכן, בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בפינצטה סטרילית ובמספרי דיסקציה כדי לבצע חתך אנכי בעור ולפתוח את דופן הפריטונאום.יש לבצע חיתוך כדי לחשוף את החלק העליון של גרם הסטרנום (עצם החזה), שם יש לחתוך גם את כלוב הצלעות ולהסיר את הסרעפת. המשיכו לדחוף בזהירות את כל האיברים הצידה כדי לחשוף לחלוטין את אבי העורקים החזי (thoracic aorta) הממוקם לצד עמוד השדרה. לאחר חשיפת אבי העורקים, הכניסו פינצטה סטרילית דקה בין אבי העורקים לבין עמוד השדרה. פתחו את הפינצטה והרימו בהדרגה את אבי העורקים מהמיסתו, תוך הפרדת הקטע החזי משאר אבי העורקים.כעת, לאחר שהאורטה הופרדה, השתמשו במספריים חדות כדי לחתוך אותה מהעכבר, החל מהקצה הנמצא בקרבה לכלי הדם הכליתיים ועד לאזור הלב. העבירו את האורטה התורקית שהוצאה לכלי פטרי מלא ב-PBS סטרילי קר. כעת, לאחר שהאורטה הוסרה, ניתן להכין טבעות אאורטליות באמצעות שתי פינצטות סטריליות ועבודה תחת מיקרוסקופ בינוקולרי.נקו את העורק האאורטי החזי (thoracic aorta) מרקמת שומן מסביב. ודאו שאינכם פוגעים באאורטה והחזיקו אותה רק בקצוות. יש לטבול את האאורטה שוב ושוב בתוך כלי הפטרי המכיל PBS כדי למנוע התייבשות עד לסיום תהליך הניקוי.כעת, לאחר שהאאורטה החזיית נקייה, השתמש בסכין כירורגית ועבוד תחת מיקרוסקופ בינוקולרי כדי לחתוך את האאורטה באופן אחיד לטבעות של מילימטר אחד. השתמש בסרגל המונח מתחת למשטח החיתוך כמדריך, והקפד להשתמש בלהב חד ולהחליפו מעת לעת כדי לשמור על חדותו. קצוות האאורטה אינם בשימוש. לאחר חיתוך כל טבעה, השתמש בפינצטה כדי להעביר אותה בעדינות רבה לכלי חדש המכיל PBS קר.הניחו את כל הטבעות באותה פלטה המכילה PBS כדי להבטיח שהבדיקה תהיה רנדומלית. מכיוון שלכל מקטע של האורטה יש פוטנציאל אנגיוגני שונה במקצת, שמרו את הטבעות על קרח. לאחר מכן, הכינו את פלטת הבדיקה באמצעות טיפים של פפtoDate מקוררים מראש.הוסיפו לכל באר בלוח בעל 48 באערים טיפה של כ-150 µL של BME קר; הטיפה מתקשה לצורת כיפה במהלך התנועה. ה-BME מאפשר הובלה של חומרים, כימוטקסיס של תאים, וחשוב מכל,התמיינות תאים ונדידה המובילה ליצירת כלי דם חדשים (neo vessels); את הבאערים ההיקפיים מלאו ב-PBS כדי למנוע התייבשות של ה-BME. אפשרו לטיפת ה-BME להתקשח בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 עד 30 דקות. לאחר שה-BME התקשח, הוציאו בזהירות טבעת אבירטית (aortic ring) מתוך פטרי dish באמצעות פינצטה. כדי למנוע נזק, יש להעביר את הטבעת לתוך טיפת השומן שנוצרת בין קצות הפינצטה. כתוצאה ממתח פשטי של הנוזל, הניחו טבעת אבירטית בודדת במרכז החלק העליון של כל כיפה והדגרימו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C. על גבי כל טבעת, הוסיפו 150 µL נוספים של BME והדגרימו למשך 20 עד 30 דקות.בטמפרטורה של 37 °C, הטבעת עטופה כעת ב-BME ובנוזל הבדיקה. ניתן להוסיף חומרים ללוחית כדי להתחיל את הבדיקה. המלאו מצע ללא סרום לתאי אנדותל אנושיים שהוכן מראש, עם החומר הניסויי או עם תוסף לצמיחת תאי אנדותל כביקורת חיובית או ביקורת שלילית.השתמשו במצע לבדו. הוסיפו 500 µL של מצע תוסף ה-pres לכל באר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שישה עד 12 ימים. במהלך תקופת הדגירה, בחנו את הפלטה תחת המיקרוסקופ וחפשו כלי דם המנבטים מהאאורטה וכלי דם בשלים מתקדמים המזוהים על ידי התפצלות נוספת של כלי דם.יש לצלם בתלת-ממד את הטבעות מרקמת הטבעת בין היום השישי ל-12 תחת סטראוסקופ סטנדרטי בניגוד מופע (phase contrast). בנוסף, יש לאסוף תעלילים (supernatants) בימים שונים בין היום השישי ל-12 ולאחסנם בטמפרטורה של 4°C לשימוש תוך יום, או להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של 20-°C או 80-°C לשימוש עתידי. ניתן לנתח את התעלילים בטכניקות שונות כגון ELISA עבור vgf או בדיקת Griess לרמות של nitric oxide.תמונות אלו נאספו 12 ימים לאחר הנחת הטבעות בבארות ודגירה עם תרבית, מצע (הנראה בשורה העליונה של התמונות) או ECGS ששימש כביקורת חיובית לנביטת כלי דם (הנראה בלוח התחתון). כל תמונה היא צילום מייצג של ארבע מתוך 12 הטבעות, שנעשה בהן שימוש בדרך כלל בבדיקה עבור כל תנאי.הפינה של כל טבעת אאורטה בכל באר נפרדת היא שחורה. כאשר מצלמים באופן זה, טבעות אאורטה שנחשפו ל-ECGS מראות צמיחת כלי דם, והחיצים מצביעים על כמה מהכלים הרבים שהיווצרו. כל כלי דם מאופיין כשרשראות של תאי אנדותל עם התפצלוּת מזדמנת, המעידה על כך שהם בשלים.לא ניתן להבחין בכלי נביטה בתרבית. בארות המצע בלוח העליון; הרגע הצגנו כיצד לבצע את בדיקת הנביטה של אבי העורקים בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לעבוד בדייקנות ותחת תנאיהם.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות.

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

התכווצות העורקים רוחבי פולשנית (MTAC) חוסך את עיקרי התכווצות העורקים רוחבי רגיל (TAC) תוך ביטול השימוש מאוורר עם אינטובציה לקנה הנשימה. זה מוכיח להיות שיטה רצויה מאוד ללימודי תפוקה גבוהה על עומס של חדר שמאלי, בעיקר חקר תרגום.

פולשנית רוחבי אבי העורקים התכווצות עכברים

כאן, אנו מציגים שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים איפה תרבותי משותף עם אבי העורקים, נגזר רשתות אנדותל עכברוש תאים mesenchymal prelabelled. שיטה חדשנית זו מאפשרת הדמיה של תאי סטרומה Mesenchymal (MSCs) יונת ושילוב עם רשתות אנדותל, כימות של מאפייני רשת, והערכה של הביטוי immunophenotypes וג'ין MSC.

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של אבי העורקים רוחבי הכיווץ (טק) באמצעות ניקור לרוחב. טכניקה זו היא הליך ניתוחי החזה פולשנית, סגור במטרה לדמות עומס ואי ספיקת לב בעכברים ניצול ההגדרות הרגילות של מעבדה טק.

דגם סגור-החזה לזירוז רוחבי. התרחבות אבי העורקים בעכברים

כאן אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד של פירוק אבי העורקים הכירורגי במודל העכברים המבוסס היטב של התכווצות אבי העורקים. הליך זה לא רק מאפשר ללמוד את המנגנונים שבבסיס שיפוץ הפוך החדר השמאלי ורגרסיה של היפרטרופיה, אלא גם כדי לבדוק אפשרויות טיפוליות חדשניות שעשויות להאיץ את ההתאוששות שריר הלב.

לימוד שיפוץ הפוך חדרי שמאלי על ידי ניתוק האבניים במכרסמים

פרוטוקול לא פולשני להערכת האקו הקרדיולוגית של אנטומיה לב ותפקוד עבור חולדות מבוגרים מוצג במחקר הנוכחי. שסתומי הלב, כל ארבעת תאי הלב והאב-העורקים העולה, קשת אבי העורקים והאב-העורקים היורדים לומדים בפרוטרוט.

הערכת אקו-קרדיולוגית של אנטומיה ותפקוד בחולדות למבוגרים

פרוטוקול זה מציג מדריך מעשי על הניתוח ליצירת רגורגיטציה של אבי העורקים (AR) בעכבר. הערכת עכבר ה-AR על ידי אקו לב ומדידה המודינמית פולשנית מסכמת את המאפיינים הרלוונטיים מבחינה קלינית של היפרטרופיה אקסצנטרית הנגרמת על ידי עומס נפח, מה שמרמז על יישומו המבטיח בחקר היפרטרופיה לבבית.

עומס יתר של נפח הלב המושרה בניתוח על ידי רגורגיטציה של אבי העורקים בעכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טכניקת המיוגרפיה של החוטים למדידת תגובתיות כלי הדם של העורק הכלילי של החולדה.

הכנת טבעת כלילית סטנדרטית של חולדה והקלטה בזמן אמת של שינויי מתח דינמיים לאורך קוטר כלי השיט

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה חדשה של פסים באבי העורקים בעכברים כדי לגרום לעומס יתר על הלחץ היפרטרופיה לבבית. עבור להקות, טבעת גומי עם קוטר פנימי קבוע משמש. טכניקה חדשה זו מבטיחה פחות שונות ויותר נתונים הניתנים לשחזור עבור ניסויים עתידיים.

פסי אבי העורקים O-Ring לעומת כיווץ אבי העורקים הרוחבי המסורתי למידול היפרטרופיה לבבית הנגרמת על ידי עומס יתר בלחץ

אנו מציגים שיטה להרכבת שסתום אבי העורקים החזירי על משכפל פולסים כדי לבדוק את תכונותיו ההידרודינמיות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את השינוי בהידרודינמיקה לאחר יישום של הליך ניסיוני או מכשיר רפואי חדשני לפני השימוש במודל של בעלי חיים גדולים.

מודל חזירי Ex Vivo לבדיקות הידרודינמיות של פרוצדורות ניסיוניות של מסתם אבי העורקים ומכשירים רפואיים חדשניים

חקור שיטת טבעת אבי העורקים לחקר אנגיוגנזה בביולוגיה כלייתית באמצעות חתיכות אבי עורקים של עכברים במטריצה תלת-ממדית. שיטה זו מאפשרת הערכה ישירה של פוטנציאל אנגיוגני של תרכובות שונות במעבדה.

אבי העורקים Assay טבעת

גלה סרטונים נוספים