אבי העורקים Assay טבעת
November 24th, 2009
אנגיוגנזה, מצמיח כלי דם בכלי הדם קיימים, קשור גם בתהליכים טבעיים פתולוגי. כאן אנו מדגימים assay טבעת אבי העורקים המאפשר potentiators angiogenic ומעכבי להתווסף ישירות טבעות אבי העורקים בתרבות. להנבטה ו תולדה neovessel ניתן לקבוע באמצעות בדיקת מצלצל אבי העורקים על פני תקופה של 6-12 ימים.
המטרה הכוללת של בדיקת טבעת אבי העורקים היא לספק מערכת ניסויית גמישה שבה כלי דם מונבטים מחתיכות שלמות של אבי העורקים של עכבר בתוך מטריצה תלת מימדית. זה מושג על ידי ניתוח אבי העורקים החזי מעכבר ולאחר מכן ניקוי זהיר מכל שאריות הרקמה שמסביב. פרוסות של אבי העורקים הנקי או טבעות אבי העורקים מונחות לבארות בודדות של צלחת של 48 בארות שכל אחת מהן מכילה תמצית מטריצה בזאלית או BME יצוק לכיפות.
טיפה נוספת של BME סוגרת את הטבעת במבנה תלת מימדי. המטריצה יכולה להכיל כל מגיב ניסיוני לבחירה. לאחר הדגירה של מספר ימים, ניתן לראות כלי דם נובטים מטבעות אבי העורקים ולהעריך את הפוטנציאל האנגיוגני של תרכובות הבדיקה.
היי, אני קארן ביין מהמעבדה של ד"ר א. לואיס במחלקה לביוכימיה קלינית באוניברסיטת בון של השלילי בבית שבע. היום נראה לך נוהל לבדיקת טבעת אבי העורקים של העכבר. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ההשפעות של חומרים שונים על היווצרות כלי דם.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, אפשר לתמצית מטריצת המרתף או BME להפשיר על קרח או בארבע מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, המשך לשמור על ה-BME קר כדי למנוע ממנו להתמצק שוב.
ביום הניסוי, המתת חסד של עכבר בן שישה עד שבעה שבועות על ידי זריקת קטמין וקסילזין רגילה מדממת במהירות דרך עורקי הצוואר, ואחריה נקע צוואר הרחם. התחל את ההליך בניגוב החיה עם 70% אתנול במכסה זרימה למינרי סטרילי. לאחר מכן, תוך כדי עבודה תחת היקף ניתוח, השתמש במלקחיים סטריליים ובמספריים לדיסקציה כדי לבצע חתך אנכי של העור ולפתוח את דופן הצפק.
יש לבצע את החתך כדי לחשוף את עצם החזה העליונה, שם חותכים גם את כלוב הצלעות ומסירים את הסרעפת. המשך לדחוף בזהירות את כל האיברים הצידה תוך חשיפת אבי העורקים החזי הממוקם לצד עמוד השדרה כשאבי העורקים חשוף, הכנס פינצטה סטרילית דקה בין אבי העורקים לעמוד השדרה. פתחו את הפינצטה והרימו בהדרגה את אבי העורקים ממיטתו, תוך הפרדת קטע בית החזה משאר אבי העורקים.
כעת, כשאבי העורקים מופרד, השתמש במספריים חדים כדי לחתוך אותו מהעכבר החל מהקצה, שנמצא בסמיכות לכלי הכליה ומסתיים ליד הלב. מניחים את אבי העורקים החזה הכרות בצלחת פטרי מלאה ב-PBS סטרילי קר. כעת, לאחר הסרת אבי העורקים, ניתן להכין את טבעות אבי העורקים באמצעות שתי פינצטות סטריליות ולעבוד מתחת למשקפת.
נקה את אבי העורקים החזי מרקמת השומן שמסביב. הקפידו לא לפגוע באבי העורקים והחזיקו אותו רק בקצוות. יש לטבול את אבי העורקים שוב ושוב בצלחת פטרי המכילה PBS כדי למנוע התייבשות עד לניקויו הסופי.
כעת, כשאבי העורקים של בית החזה נקי, השתמש בלהב כירורגי ועבוד מתחת למשקפת כדי לפרוס את אבי העורקים באופן שווה לטבעות של מילימטר אחד. בעזרת סרגל הממוקם מתחת למשטח החיתוך כמדריך, הקפידו להשתמש בלהב חדש והחליפו אותו מדי פעם כדי לשמור על חדות. לא משתמשים בקצות אבי העורקים לאחר חיתוך כל טבעת, השתמשו בפינצטה כדי להעביר אותה בעדינות רבה לכלי חדש המכיל PBS קר.
הנח את כל הטבעות באותה צלחת המכילה PBS כדי להבטיח שהבדיקה אקראית. מכיוון שלכל מקטע של אבי העורקים יש פוטנציאל אנגיוגני שונה במקצת, שמור את הטבעות על קרח. לאחר מכן, הכינו את לוחית הבדיקה באמצעות קצות פיפטה מקוררים מראש.
הוסף לכל באר בצלחת של 48 בארות סביב טיפה של 150 מיקרוליטר BME קר הטיפה מתמצקת לכיפה באמצע תנועה. ה-BME מאפשר הובלה של חומרים, כימוטקסיס של תאים, והכי חשוב, התמיינות ונדידת תאים המובילה להיווצרות כלי דם ניאו בארות היקפיות מלאות ב-PBS כדי למנוע התייבשות BME, אפשר לירידת ה-BME להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. לאחר שה-BME התמצק הרם בזהירות טבעת אבי העורקים מצלחת הפטרי באמצעות פינצטה על מנת למנוע נזק, יש להעביר את הטבעת בתוך טיפת השומן שנוצרת בין קצות הפינצטה כתוצאה ממתח פנים נוזלי, הנח טבעת אבי העורקים בודדת במרכז העליון של כל כיפה ודגר למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס על גבי כל טבעת, מוסיפים עוד 150 מיקרוליטר BME ודוגרים למשך 20 עד 30 דקות.
בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הטבעת עטופה כעת ב-BME ובבדיקה. ניתן להוסיף חומרים לצלחת כדי להתחיל את הבדיקה. תוסף Pres שהוכן בעבר מדיום נטול סרום אנדותל אנושי עם החומר הניסיוני או תוסף צמיחת תאי אנדותל כבקרה חיובית לבקרה שלילית.
השתמש במדיום בלבד. הוסף 500 מיקרוליטר ממדיום תוסף הקדם לכל באר ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שישה עד 12 ימים. בתקופת הדגירה יש לבחון את הצלחת במיקרוסקופ ולחפש כלים הנובטים מאבי העורקים וכלי דם בוגרים מתקדמים המזוהים על ידי כלי הסתעפות נוספים.
צריך להרחיב פנימה מרקמת הטבעת לצלם בתלת מימד את הטבעות בין היום השישי ל -12 תחת סטריאוסקופ ניגודיות פאזה סטנדרטי. בנוסף, אספו סופרנטנטים בימים שונים בין היום השישי ל-12 ואחסנו בארבע מעלות לשימוש תוך יום או Eloqua ואחסנו במינוס 20 או מינוס 80 לשימוש עתידי. ניתן לנתח את הסופרנטנטים בטכניקות שונות כגון אלייזה ל-vgf או בדיקת שומן לרמות תחמוצת החנקן.
תמונות אלה נאספו 12 יום לאחר הצבת הטבעות בבארות והדגירה עם תרבית, מדיום שנראה בשורה העליונה של התמונות או ECGS ששימש כבקרה חיובית להנבטת כלי שנראה. בחלונית התחתונה. כל תמונה היא תמונת מצב מייצגת של ארבע מתוך 12 הטבעות, המשמשת בדרך כלל בבדיקה לכל תנאי.
הפינה של כל טבעת אבי העורקים בכל באר נפרדת היא שחורה. כאשר מצולמים בדרך זו, טבעות אבי העורקים שנחשפו ל-ECGS מציגות צמיחה של כלי דם והחיצים מצביעים על כמה מכלי הדם הרבים שנוצרו. כל כלי מאופיין כשרשראות של תאי אנדותל עם הסתעפות מדי פעם המעידה על כך שהם בוגרים.
לא ניתן להבחין בכלי הנבטה בתרבות. בארות בינוניות בפאנל העליון, זה עתה הראינו לך כיצד לבצע את בדיקת אבי העורקים בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לעבוד בצורה מדויקת ולהבין את התנאים שלהם.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג מבחן טבעת אבי העורקים שנועד לחקר אנגיוגנזה על ידי אפשרות לנביטה של כלי דם מאבי העורקים של עכבר בסביבה מבוקרת. המבחן מאפשר הוספה ישירה של תרכובות אנגיוגניות כדי להעריך את השפעתן על צמיחת כלי דם חדשים לאורך תקופה של מספר ימים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אנגיוגנזה
- ביולוגיה של כלי דם
- מבחנים ניסויים
רקע
- אנגיוגנזה חיונית הן לתהליכים פיזיולוגיים והן לתהליכים פתולוגיים.
- מבחן טבעת האבי העורקים מספק מודל לחקר היווצרות כלי דם.
- הבנת האנגיוגנזה יכולה להוביל לתובנות לגבי מחלות שונות.
- המבחן מאפשר בדיקה של תרכובות שונות במטריצה תלת-ממדית.
מטרת המחקר
- לפתח מערכת גמישה לחקר אנגיוגנזה.
- להעריך את ההשפעות של מחזקי אנגיוגנזה ומעכבים.
- לצפות בנביטת כלי דם מטבעות אבי העורקים in vitro.
שיטות ששימשו
- ניתוח של אבי העורקים החזי מחולדות.
- הכנת טבעות אבי העורקים והנחתן במטריצה תלת-ממדית.
- דגירה של טבעות אבי העורקים עם ריאגנטים ניסויים.
- תצפית על צמיחת כלי דם חדשים לאורך 6-12 ימים.
תוצאות עיקריות
- נביטה מוצלחת של כלי דם מטבעות אבי העורקים.
- הערכה של הפוטנציאל האנגיוגני של תרכובות שונות.
- הדגמה של גמישות המבחן לתנאים ניסויים שונים.
- תובנות לגבי מנגנוני האנגיוגנזה.
מסקנות
- מבחן טבעת האבי העורקים הוא כלי חשוב לחקר אנגיוגנזה.
- הוא מאפשר בדיקה ישירה של גורמים אנגיוגניים בסביבה מבוקרת.
- הממצאים יכולים לתרום להבנת התפתחות כלי הדם ומחלות קשורות.
