הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

היי, אני סן לי מהמעבדה של סטיבן הארלם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. היום אנו מראים לכם נוהל למיצוי DNA גנומי במשקל מולקולרי גבוה מיער לאדמה הרלוונטי גם למגוון רחב של סוגי קרקע ומשקעים. אנו משתמשים בדנ"א גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה כדי לבנות את ספריית מד היער של קהילות מיקרוביאליות בקרקע.

עם הספריות האלה ביד, אנו יכולים לחקור את המגוון והפוטנציאל המטבולי של קהילות מיקרוביאליות המתחלקות בין אופקי קרקע שונים. אז בואו נתחיל. פרוטוקול זה מתחיל בליזית תאים.

השלב הראשון הוא להשלים את מאגר הדנטורציה על ידי הוספת אתנול betta mer capto לריכוז של 0.5%לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפוך את תמיסת הדנטוור לרעננה בכל פעם. לחלופין, השתמש במאגר בן פחות משבוע שנשמר בארבע מעלות צלזיוס. לשלב הבא תזדקק לעושה של חנקן נוזלי וחיטוי ועלי מרגמה ומרית מקוררים מראש.

מניחים דגימת אדמה קפואה של שני גרם בטיט המצונן. הוסף מיליליטר אחד מתמיסת הדנטור. לאחר מכן הוסף חנקן נוזלי לכיסוי מלא של האדמה.

השתמש בעלי מקורר מראש כדי לטחון את הדגימה עד שחלקיקי האדמה נראים אבקתיים והומוגניים והדגימה מתחילה להימס. לאחר מכן מוסיפים עוד חנקן נוזלי וחוזרים על שלב הטחינה. זה משלים את שלב הליזיס של התאים באמצעות מרית מקוררת מראש.

העבירו את דגימת הקרקע לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. שמור את הדגימה על קרח כדי להמשיך מיד לשלב מיצוי ה-DNA או לאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. לשימוש בליטר, רגע לפני תחילת מיצוי ה-DNA, השלם את מאגר המיצוי על ידי הוספת hexa deco trimethyl ammonium bromide או CTAB ו-SDS. ראשון.

בדוק אם ה-CTAB התגבש, ואם כן, ממיס אותו ב-60 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך. לאחר מכן הוסף אותו לתמיסה לריכוז כולל של 1%הבא, הוסף תמיסת SDS של 20% לריכוז סופי של 2%התרחיף החלבי. זה נורמלי.

לאחר הוספת ה-SDS, שמור על מאגר המיצוי שהושלם הומוגני על ידי אחסונו ב-60 מעלות צלזיוס לאחר 10 עד 15 דקות. לאחר שמאגר המיצוי מומס היטב והומוגני, הוסף תשעה מיליליטר של מאגר מיצוי לדגימת האדמה ומערבולת קצרה במהירות נמוכה לערבוב. דגרו את הדגימה עם מאגר מיצוי בתנור הכלאה של 65 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.

במהלך הדגירה, הפוך בעדינות את הצינורות כל 10 דקות או סובב ברציפות את הצינורות במהירות הנמוכה ביותר של הרוטור. במהלך הדגירה, התמיסה עשויה להיראות מעט צמיגה לאחר הדגירה. השלב הבא הוא להשתמש באלכוהול איזואמיל כלורופורם כדי לטהר את ה-DNA הרחק מהחומר האורגני בתערובת הליזיס.

התחל בצנטריפוגה של הדגימה למשך 10 דקות ב-1800 גרם בכ-10 עד 14 מעלות צלזיוס במכסה המנוע, אסוף את ה-DNA המכיל סופרנטנט על ידי החלקת קצה הפיפטה שלך בזהירות לאורך צד הצינור, הימנע משכבת הבז' למעלה והשכבה האורגנית בתחתית. העבירו את הסופרנטנט לצינור מקורר מראש של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר אלכוהול ISL כלורופורם או לאחר מכן, חזרו על תהליך המיצוי פעמיים נוספות על אותה דגימה. בינתיים, שמור את תמצית ה- DNA והכלורופורם i a a על קרח במכסה המנוע.

למיצוי ה-DNA השני, חזור לצינור המכיל את כדור האדמה עם מאגר מיצוי שיורי והוסף עוד חמישה מיליליטר של מאגר מיצוי. מערבבים בעדינות עם קצה של מיליליטר אחד לערבב ומערבלים קצרות כדי להשעות את הכדור כמו קודם. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, הפעם למשך 10 דקות.

ואז צנטריפוגה ב -1800 גרם למשך 10 דקות. בטמפרטורה של כ-10 עד 14 מעלות צלזיוס במכסה המנוע, העבירו את הסופרנטנט לצינור המכיל כלורופורם, אלכוהול איזואמיל או כלורופורם i a a a ואת הסופרנטנט מהמיצוי הקודם. חזור על כל תהליך המיצוי פעם נוספת כדי לחלץ כמה שיותר DNA מדגימת האדמה.

לאחר שהשלמת בסך הכל שלוש מיצוי על דגימת האדמה שלך, נער בעדינות רבה את הצינור המכיל את הסופרה נטנט שנאסף והכלורופורם i a a על צלחת מסתובבת ב-1.25 RRP m למשך 10 דקות לאחר שלב ערבוב זה, צנטריפוגה את הצינור ב-1800 Gs למשך 20 דקות בכ-10 עד 14 מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, העבירו בזהירות את השלב המימי לצינור אולטרה צנטריפוגה חדש, והשאירו מיליליטר עד שניים של SNAT על מנת למנוע הפרעה לממשק בין השלבים המימיים והאורגניים. כעת, כדי לזרז את ה- DNA, הוסף 0.6 מיליליטר אלכוהול איזופרופיל.

לכל מיליליטר של סופרנטנט שנאסף, הפוך את הצינורות בעדינות כמה פעמים כדי לערבב. בשלב זה, ייתכן שתוכלו לראות את הדנ"א משקע לחוטים ארוכים. לאחר מכן דגרו את ה- DNA עם האיזופרופנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הגיע הזמן לגלול את ה-DNA על ידי צנטריפוגה לסמן פינה אחת של הצינור כשאתה מכניס אותו לצנטריפוגה כך שתדע היכן לצפות לכדור ה-DNA ספין ב-16,000 GS למשך 20 דקות ב-20 עד 25 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה, הסר את האלכוהול האיזופרופיל על ידי סילוק ו/או יניקת ואקום. היזהר לא לאבד את כדור ה-DNA, שגודלו נע בין בקושי נראה לרוחב של תשעה מילימטרים, תלוי ביעילות המיצוי והביומסה בדגימות אדמה, יבש את כדור ה-DNA בטמפרטורת החדר למשך חמש עד 20 דקות. היזהר לא להתייבש יתר על המידה כאשר הגלולה יבשה.

השעו מחדש את ה-DNA ב-200 עד 400 מיקרוליטר של te. מערבבים אותו על ידי הקשה עדינה. העבירו את תמיסת ה-DNA לצינור של 1.5 מיליליטר.

שמור את הדנ"א על ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. על מנת להמיס את ה-DNA במלואו לאחר חילוץ ה-DNA מדגימת האדמה, השלבים הנותרים לבדיקת הריכוז ושלמות ה-DNA של הדגימה הם נהלים סטנדרטיים, המתוארים בפירוט בפרוטוקול JoVE אחר ממעבדת האלאם. קבע את ריכוז ה-DNA בשיטה לבחירתך.

בדוק גם את תקינות ה-DNA במשקל מולקולרי גבוה על ידי גמר 10 עד 20 מיקרוליטר מדגימת ה-DNA שלך באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל שדה פועם או PFGE. גודל ה-DNA החציוני צריך להיות 36 קילו-בסיסים ומעלה בהתאם ליישום שלך במורד הזרם. המשך לשלב הבא של צנטריפוגה בשיפוע צזיום כלוריד לחלופין, ניתן לאחסן DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס או מינוס 80 מעלות צלזיוס לפני אולטרה-צנטריפוגה.

השלב הבא הוא שימוש בצנטריפוגה בשיפוע צזיום כלוריד כדי לטהר עוד יותר את ה-DNA על ידי הסרת זיהומים, בעקבות תרכיז צנטריפוגה בשיפוע צזיום כלוריד, ולטהר עוד יותר את ה-DNA באמצעות התקני סינון צנטריפוגליים של AmCon ו-MicroCon. צנטריפוגת שיפוע צזיום כלוריד היא המפתח להשגת DNA באיכות גבוהה ומתוארת בפירוט בפרוטוקול JoVE אחר ממעבדת האלאם. לאחר ביצוע שלבי הצנטריפוגה והריכוז של שיפוע צזיום כלוריד, בדוק את ריכוז ה-DNA בשיטה לבחירתך.

לאחר מכן, בדוק את תקינות ה-DNA בעל המשקל המולקולרי הגבוה פעם נוספת על ידי הפעלת דגימה קטנה של ה-DNA באמצעות PFGE. הכמות הכוללת של DNA גנומי שבודד משני גרם של אדמה מאולצת נעה בין 10 ל-180 מיקרוגרם כפי שמוצג בריצת הג'ל לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגה של צזיום כלוריד. טווח הגדלים של ה-DNA המבודד נע בדרך כלל בין 40 ל-60 קילו-בסיסים המוצג כאן הוא כרומטוגרמה של דגימות DNA גנומיות לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגה של צזיום כלוריד.

שלב זה משפר את טוהר ה-DNA, ומגדיל את היחס של שני 60 על פני 2 80 מ-1.3 ל-1.6 לפני ל-1.8 עד 1.9 לאחר מכן. יתר על כן, שיא הספיגה ב-230 ננומטר, מה שמרמז על זיהום חומצה הומית הופחת בהצלחה לאחר צנטריפוגה. זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד דנ"א גנומי מולקולרי גבוה מקהילות מיקרוביאליות באדמה.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע את מאגר החילוץ והדנטורציה בדיוק בהתאם להוראות. והיזהר לא להגיע לחיך ה-DNA שלך לאחר משקעי אלכוהול איזופרופיל. כאשר אתה משחזר את רצועת ה-DNA לאחר צנטריפיקציה של שיפוע כלוריד.

אל תשכח לשטוף את המזרק עם TE כדי למקסם את התאוששות ה- DNA. ולבסוף, לבדוק את הכמות והאיכות של ה-DNA המבודד שלך בכל השלבים המוצעים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.