Name: הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למד שיטה לאיסוף DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מקרקעות ומשקעים שונים. פרוטוקול זה מאפשר חקר מגוון מיקרוביאלי ופוטנציאל מטבולי בקהילות קרקע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, קולומביה הבריטית ידע ופיתוח הקרן, הגנום קולומביה הבריטית ואת קולומביה הבריטית משרד יערות טווח לתמיכה במחקרים מתמשך של פוריות הקרקע ביער. SL נתמך על ידי מענק ממרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.

אני חלק: הפקת DNA נוהל 1. 8 שעות נדרשים, לעיבוד 6 דגימות כולל כימות של ה-DNA. לפני שתתחיל החילוץ, יהיה עליך ועלי מראש צמרמורת מרגמה, ו מרית מקפיא -20 ° C או באמצעות חנקן נוזלי. כמו כן, מראש צמרמורת 50 צינורות מ&quot;ל המכיל 20 מ&quot;ל כלורופורם isoamyl אלכוהול (24:1) על קרח. הגדר את התנור הכלאה עד 65 מעלות צלזיוס מראש לחום. בדוק פתרון CTAB, אם הוא התגבש חמים 60 ° C כדי להמיס את הגבישים. השלם את הפתרון denaturing ו חיץ החילוץ על ידי הוספת מרכיבים האחרון ממש לפני שאתה מתחיל את החילוץ (ראו מתכון בהמשך). התנהגות מיצוי כל ההליכים במנדף קטר. 2. הכן את החיץ denaturing ו חיץ החילוץ. הערה: כדי למקסם את התשואה ה-DNA, הוא קריטי כדי לעשות בדיוק מאגרים ההוראות. 3. מקום 2 גרם של אדמה במכתש מראש צונן. הערה: קרקע שנאספו בשטח צריך להיות קפוא על קרח יבש הובלה המאוחסן ב -80 ° C. להפשיר קרקע מסננת באמצעות מסננת 2 מ&quot;מ לפני מיצוי DNA. אתה יכול להגדיל את כמות המוצא של אדמה עד 10 גרם 4. הוסף 1 מ&quot;ל של denaturing פתרון הקרקע. 5. הקפאת וטוחנים את האדמה N נוזלי 2 באמצעות העלי עד חלקיקי אדמה להסתכל אבקתי ו הומוגנית. חזור מקפיא שחיקה פעמיים. הערה: שמור את דגימת אדמה קפואים במהלך שחיקה, באמצעות חנקן נוזלי מספיק כדי לכסות באופן מלא את המדגם אדמה. התכה קלה במהלך שחיקה מקובל. 6. העברת הקרקע קרקע על צינור חרוטי 50 מ&quot;ל בעזרת מרית מראש צונן. הערה: דגימת קרקע קרקע יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C, בשלב זה, במידת הצורך. 7. הוסף 9 מ&quot;ל של מיצוי המאגר. כדי לערבב את הפתרון ואדמה, בקצרה מערבולת במהירות נמוכה. הערה: כדי להבטיח למאגר היא הומוגנית, לחמם אותו על 60 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות לפני השימוש. שמור את שאר חוצץ ב 60 ° C בכל החילוץ. וורטקס במהירות 8 (בסולם שבו 10 הוא הציון המקסימלי). 8. דגירה של 40 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה. במהלך הדגירה, ברציפות לסובב את שפופרות במהירות הנמוכה ביותר, או בעדינות להפוך את צינורות כל 10 דקות. הערה: הניחו את הצינור אופקית בתנור הכלאה לאפשר חיץ לפנות קרקע על פני שטח פנים גדול. הפתרון עשוי להיראות קצת צמיג במהלך הדגירה. 9. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, 10 דקות בשעה 10-14 ° C. העברת supernatant לתוך צינור מראש צינן את חרוטי 50 מ&quot;ל המכיל 20 מ&quot;ל כלורופורם-isoamyl אלכוהול (24:1), לשמור על הקרח. הערה: כאשר אתה מעביר supernatant, להיזהר לא להפריע את השכבה האורגנית (השכבה התחתונה). השאירו 1-2 מ&quot;ל של supernatant אם זה הכרחי על מנת לאסוף רק supernatant נקי. לעתים קרובות אתה יכול לראות שכבה בצבע בז&#39; (1-3 מ&quot;מ עובי כ) על גבי supernatant. נא לא להפריע שכבה זו בעת לקיחת supernatant. נסו להחליק את קצה הצינור לאורך הקיר כדי למנוע שבירה של שכבה זו בז&#39;. אם supernatant הוא עכור מדי, לחזור על מיצוי כלורופורם-isoamyl אלכוהול עוד פעם אחת על supernatant. אין להשתמש pipettes פלסטיק חד פעמיות בעת העברת כלורופורם, כלורופורם יתמוססו הפלסטיק. השתמש פיפטה כוס, או כוס סיימה גליל, או לשפוך כלורופורם ישירות לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל. 10. חלץ את כדורי אדמה 2 יותר פעמים; 10.1. הוסף 5 מ&quot;ל מיצוי חיץ את כדורי אדמה, לערבב בעדינות בעזרת טיפ 1 מ&quot;ל ואחריו vortexing קצר במהירות נמוכה. הערה: Shake ומערבבים החיץ לפני השימוש. 10.2. לדגור על 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתנור הכלאה. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, 10 דקות בשעה 10-14 ° C. העברת supernatant אל הצינור בשלב 9. שמור את הצינור עם אסף supernatant כלורופורם ו-isoamyl אלכוהול על הקרח במהלך החילוץ. הערה: ודא שאתה מוסיף את supernatant אל הצינור אותו מבלי לחצות ערבוב בין הדגימות. 10.3. חזור על 9.1 ו 9.2 עוד פעם אחת. 11. בעזרת צלחת מסתובבת, בעדינות רבה הסלע שפופרת המכילה את supernatant אסף (14-19 מ&quot;ל) ו-כלורופורם isoamyl אלכוהול בסל&quot;ד 1.25 עבור 10 דקות. הערה: סגור את המכסה בחוזקה כדי למנוע דליפה. הניחו מגבת נייר על הצלחת נדנדה לפני המקום הצינור ולכן כל ההדלפות ניתן לאתר בקלות. 12. צנטריפוגה ב 1800 x גרם, במשך 20 דקות בשעה 10-14 ° C. 13. העברת השלב מימית לצינור חדש. הערה: אין להפריע את שלבי הביניים בין השלב מימית (השכבה העליונה) לבין שכבת אורגני (התחתוןהשכבה) בעת העברת supernatant. השאר כ 1.5-2 מ&quot;ל supernatant כדי להבטיח אוסף של supernatant רק נקי. 14. לשחזר את ה-DNA באמצעות איזופרופיל אלכוהול (צעד 15.a - 21.a). לחלופין, להשתמש Amicon ® Ultra-15 התקנים מסנן צנטריפוגלי (שלב 15.b - 21.b) אם אתה מצפה כמות נמוכה מאוד של ביומסה במדגם שלך, אשר ייצרו גלולה בקושי נראו על ידי משקעים אלכוהול איזופרופילי שקשה להתאושש. 15.a. מניחים את supernatant כדי ultracentrifuge צינור חדש. 16.a. הוספת אלכוהול איזופרופילי כדי supernatant שנאסף ביחס נפח של 0.6:1. היפוך הצינורות בעדינות כמה פעמים כדי לערבב. 17.a דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. 18.a. צנטריפוגה ב 16000 x גרם, במשך 20 דקות בשעה 20-25 ° C. ודא את המשקולות של כל הצינורות מאוזנים היטב לפני הצעד צנטריפוגה. הערה: סמן את כיוון הכוח הצנטריפוגלי ברכבת התחתית, כך שאתה יכול לזהות את ה-DNA גלולה ביתר קלות כאשר התשואה DNA הוא נמוך. 19.a. הסר אלכוהול איזופרופילי באמצעות אחסון או שאיבת אבק. היזהר לא להפריע גלולה DNA. הערה: הסרה של אלכוהול איזופרופילי בהקדם צנטריפוגה הושלמה. תיזהר מאוד לא לאבד את גלולה DNA. גודלו של ה-DNA גלולה יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג הקרקע, מתוך לעין (~ בקוטר 9 מ&quot;מ) כדי לראות בקושי. מומלץ להסיר את שאריות של אלכוהול איזופרופילי על ידי שאיבה לאורך הקיר של הצינור בזהירות כדי לא היניקה את גלולה DNA. 20.a. יבש DNA גלולה בטמפרטורת החדר למשך 5-20 דקות. הערה: אל על יבש DNA גלולה, אחרת זה יהיה קשה redissolve את ה-DNA. 21.a. Resuspend גלולה דנ&quot;א TE 200 μl. מערבבים אותו על ידי הקשה עדינה. מעבירים את פתרון ה-DNA לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. שמור את הצינור ב 4 ° C למשך הלילה כדי לפזר באופן מלא DNA. הערה: בהתאם לגודל של גלולה, אתה יכול להתאים את עוצמת הקול של TE להוסיף. בדרך כלל 200-400 μl של TE עובד היטב. * לחילופין, בצע את השלבים 15.b - 21.b. 15.b. טרום לשטוף Amicon ® Ultra-15 התקנים מסנן צנטריפוגלי, מוסיפים 15 מ&quot;ל TE למכשיר צנטריפוגות ב 3500 x גרם, במשך 10 דקות. מחק את הזרימה דרך. 16.b. מניחים את פתרון ה-DNA משלב 13 לסנן מראש הדיחה את Amicon. צנטריפוגה ב 3500 x גרם עד נפח DNA מצטמצם 200-500 μl. מחק את הזרימה דרך. 17.b. לשטוף את ה-DNA עם TE פעמיים, מוסיפים 10 מ&quot;ל TE להתקנים לסנן Amicon. צנטריפוגה ב 3500 x גרם עד נפח DNA מצטמצם μl כ 200. מחק את הזרימה דרך. חזור עוד פעם אחת. 18.b. מעבירים את פתרון ה-DNA על הפילטר לצינור 1.5 חדש מ&quot;ל. 19.b. הוסף 40 μl TE לסנן את Amicon. לשטוף הן בצד של ממברנות סינון לפי pipetting למעלה ולמטה כדי להתאושש שאריות DNA על המסנן. הוסף את הפתרון הזה כדי לשטוף את הצינור ב 18.b. צעד 20.b. אם יש צורך, הדנ&quot;א יכול להיות מרוכז יותר על ידי Microcon יחידת ® Ultracel-30 י&quot;מ מסנן צנטריפוגלי; מראש לשטוף את המסנן על ידי הוספת 200 TE μl ו centrifuging ב 10000 x גרם במשך 7 דקות. מוסיפים את פתרון ה-DNA כדי לסנן את ו צנטריפוגות ב 5000 x g דקות 1. חזור צנטריפוגה עד סכום של פתרון ה-DNA על המסנן מופחת μl 50 בערך. הערה: המדגם הראשוני מרבי בנפח של Microcon המסנן 500 μl. אל צנטריפוגות במהירויות מעל 14,000 x ז אל על צנטריפוגות עד מתייבש קרום לחלוטין. ודא כי נוזל כלשהו עדיין מכסה את המסנן לאחר צנטריפוגה. אם אתם מעל centrifuged ואת קרום יבש, ולאחר מכן להוסיף 15 TE μl, להתסיס בעדינות למשך 30 שניות, המשך לשלב 21.b. 21.b. הנח את יחידת המסנן הפוך בצינור Microcon צנטריפוגה חדשה ב 1000 XG 3 דקות לשחזר את ה-DNA. 22. לכמת ה-DNA על ידי טה ג&#39;ל (0.8%, 0.5xTAE, 50 V 4 שעות), ועל ידי ספקטרופוטומטר Nanodrop או פיקו ירוק assay והקורא צלחת. הערה: כמות ה-DNA יכול להיות מוערך על ידי השוואת הלהקה מדגם ללהקה סמן עם ריכוז ידוע (DNA גבוהה סמן מולקולרי או λHindIII) על הג&#39;ל. 23. בדוק את שלמות ה-DNA משקל מולקולרי גבוה באמצעות שדה פעמו ג&#39;ל אלקטרופורזה (PFGE) עם 1%, 1xTAE ג&#39;ל (לפרטים נוספים ראה את שלב II, part2 ב <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1387">https://www.jove.com/index/details.stp?id = 1387</a> , doi: 10.3791/1387 ידי Taupp et al 2009).. הערה: ניתן להשתמש בג&#39;ל רגיל agarose למטרה זו QC במקום נמוך ההיתוך agarose. בקיצור, תנאי אלקטרופורזה הן כדלקמן: 2-250 קילו, 6 וולט, זמן המעבר הראשונית: 5 שניות, זמן המעבר הסופי: 15 שניות, לרוץ במשך 12 שעות ב 14 ° C. זהב SYBR מכתים במשך שעה אחת כדי להמחיש את הדנ&quot;א על ​​הג&#39;ל. 24. אם המשקל המולקולרי של הדנ&quot;א חילוץ הם משביעי רצון, ולאחר מכן להמשיך את הצעד הבא צנטריפוגות CsCl הדרגתי. לחילופין, ה-DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C או -80 ° C לפני בצנטריפוגה CsCl. הגודל הממוצע של ה-DNA צריכה להיות שווה או עולה על 36 KB, אם אתה רוצה לבנות להכניס גדול metagenomic ספריית ה-DNA. חלק II. ה-DNA טיהור באמצעות ultracentrifugation צזיום כלוריד שיפוע הכנת צנטריפוגה: 1.5 - 2 שעות צעד צנטריפוגה: 18 שעות הסרת ethidium ברומיד (EtBr) לבין ריכוז ה-DNA לאחר צנטריפוגה: 3 שעות נוהל לפרטים, עיין רייט et al. . 2009 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352">https://www.jove.com/index/details.stp?id=1352</a> , doi: 10.3791/1352 תוצאות נציג / תוצאה הסכום הכולל של הדנ&quot;א הגנומי מבודד 2 גרם של יער אדמה אורגני (אופק O) אופקים מינרלים (AE, AB, ו Bt אופקים) (שנדגמו פוריות הקרקע ארוך טווח (LTSP) באתר הממוקם Skulow האגם, BC, קנדה ומנוהל על ידי משרד לפנה&quot;ס יערות טווח) נע בין 10 מ&quot;ג עד 180 מ&quot;ג. הגודל הממוצע של ה-DNA בודד היה בדרך כלל בין 40-60 kb (איור 1). יחס ספיגת ב 260 ננומטר nm/280 היה בין 1.3-1.6 והיתה לשיא 230 ננומטר, אשר עשוי להצביע על זיהום חומצה humic נצפה לעיתים קרובות דגימות קרקע. צנטריפוגה שיפוע CsCl מופחת באופן דרסטי את זיהום גם הגדילה את יחס של 260/280 ל 1.8-1.9 כפי שמוצג באיור 2a ו 2b. <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור PFGE תמונות של ה-DNA הגנומי חילוץ לפני ultracentrifugation CsCl. lane1: 1 kb סמן 100 ננוגרם, מסלול 2: λHind III סמן 100 ננוגרם, מסלול 3: λHind III סמן 250 ננוגרם, מסלול 4: λHind III סמן 500 ננוגרם, lane5: Fosmid 36 kb סמן 100 ננוגרם, מסלול 6 ו -7: גנומית ה-DNA שבודד את האדמה מינרלים האופק AE, מסלול 8 ו -9: הדנ&quot;א הגנומי מבודדים מן א.ב. אדמה מינרלים האופק באתר LTSP ממוקם Skulow האגם, BC <img src="/files/ftp_upload/1569/1569fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /> איור 2. Chromograms של הדנ&quot;א הגנומי זוהה על ידי ספקטרופוטומטר לפני (א) ואחרי ultracentrifugation CsCl (B). שימו לב ירידת הערך ספיגת באורך גל 230 ננומטר לאחר ultracentrifugation CsCl, דבר שמצביע על שיפור באיכות הדנ&quot;א הגנומי. אנא <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/1569/1569fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol><li>Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recovery+of+RNA+and+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22AEM%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments.</a> AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).</li>
<li>Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+0.22+%CE%BCM+Sterivex+filters+and+cesium+chloride+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation.</a> JoVE. , (2009).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+insert+environmental+genomic+library+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large insert environmental genomic library production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

מתכון * Denaturing פתרון 4 M isothiocyanate Guanidine 10 mM טריס-HCl (pH 7.0) 1 mM EDTA 0.5% 2-mercaptoethanol <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;;text-align:right;direction:rtl"><tr><td colspan="2"> פתרון Denaturing: 10 מ&quot;ל בסך הכל </td></tr><tr><td> Guanidine isothiocyanate (MW 118.16) </td><td> 4.73 גר &#39; </td></tr><tr><td> טריס-1M HCl (pH 7.0) </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA </td><td> 20 μl </td></tr><tr><td colspan="2"> מוסיפים מים כדי מ&quot;ל 9.95 בסך הכל. </td></tr><tr><td colspan="2"> החיטוי. </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף 50 μl 2-mercaptoethanol רק לפני השימוש. (5 μl של mercaptoethanol-2 פתרון לכל 1 מ&quot;ל Denaturing) הערה: שמור את הפתרון Denaturing ב 4 ° C. אין להשתמש חיץ מבוגרת בשבוע אחד. אם אפשר, לעשות חיץ טרי לשימוש. </td></tr></table> ** הפקת הצפת נתרן 100 mM חיץ פוספט [pH 7.0] 100 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 7.0] 100 mM EDTA [pH 8.0] 1.5 M NaCl Hexadecyltrimethylammonium ברומיד 1% (CTAB) 2% SDS <table border="0" style="font-size:9pt; width:400px;;text-align:right;direction:rtl"><tr><td colspan="2"> הפקת הצפת עבור L 1 בסך הכל </td></tr><tr><td> סודיום פוספט 1M חיץ [pH 7.0] * </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריס-1M HCl [pH 7.0] </td><td> 100 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 0.5m EDTA [pH 8.0] </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> 300 מ&quot;ל </td></tr><tr><td colspan="2"> החיטוי ולשמור אותו בטמפרטורת החדר. </td></tr><tr><td colspan="2"> מוסיפים 200 מ&quot;ל, ברומיד Hexadecyltrimethylammonium 5% (CTAB, autoclaved) ו 100 מ&quot;ל, 20% SDS (autoclaved) רק לפני השימוש. אם CTAB היתה מגובשת, להמיס אותו על 60 ° C. * סודיום פוספט 1M חיץ: 57.7 מ&quot;ל, סודיום פוספט 1M monobasic (לאא 2 PO 4) ו - 42.3 מ&quot;ל, 1M פוספט נתרן dibasic (לאא 2 PO 4). התאם ל-pH 7.0 הערה: אין להשתמש SDS 20% אם יש משקעים. זה נורמלי לראות ההשעיה חלבי כאשר אתה מוסיף SDS לפתרון. לאחר שתוסיף SDS, המקום חיץ מיצוי ב 60 ° C כדי להבטיח SDS הוא מושעה היטב. </td></tr></table>

הפקת dna גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Microbiome אדמה הוא מאגר עצום נחקרו יחסית של גיוון גנטי וחדשנות מטבולית קשורה באופן הדוק עם מזין ואת זרימת האנרגיה בתוך המערכות האקולוגיות של כדור הארץ. טיפוח עצמאית גנומית סביבתי, המכונה גם metagenomic, גישות מבטיח גישה חסרת תקדים למידע זה גנטי לגבי שחזור מסלול ההקרנה פונקציונלי טיפולית ערך גבוה המרה תהליכים ביומסה. עם זאת, microbiome אדמה עדיין אתגר בעיקר בשל הקושי בהשגת משקל מולקולרי גבוה DNA באיכות מספיק לייצור להכניס ספריה גדולה. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול לחילוץ משקל מולקולרי גבוה, ה-DNA הגנומי של חיידקים הקהילה מקרקעות ו משקעים. איכות של הדנ&quot;א הגנומי מבודד אידיאלי לבניית סביבתי גדול להכניס ספריות גנומית עבור במורד הזרם יישומים רצף ההקרנה. ההליך מתחיל עם תמוגה התא. קירות התא ממברנות של חיידקים הם lysed על ידי שני כוחות מכניים (שחיקה) וכימיות (β-mercaptoethanol). הדנ&quot;א הגנומי מבודד מכן באמצעות חיץ החילוץ, כלורופורם, isoamyl אלכוהול אלכוהול איזופרופילי. מאגרים מועסק תמוגה ואת הצעדים החילוץ כוללים isothiocyanate guanidine ו ברומיד hexadecyltrimethylammonium (CTAB) כדי לשמור על שלמות ה-DNA גנומי מולקולרי גבוה במשקל. בהתאם ליישום הזרם שלך, ה-DNA הגנומי מבודד יכול להיות מטוהרים נוסף באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) ultracentrifugation שיפוע, אשר מפחית זיהומים כולל חומצות humic. הליך השאיבה הראשונה, לוקח כ 8 שעות, למעט שלב כימות DNA. Ultracentrifugation שיפוע CsCl, הוא תהליך יומיים. במהלך ההליך כולו, הדנ&quot;א הגנומי יש לנהוג בעדינות כדי למנוע גז, להימנע vortexing חמורים, pipetting קשים חוזרים.

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

מיקרוביום הקרקע הוא מאגר עצום ובלתי נחקר יחסית של גיוון גנומי וחדשנות מטבולית, הקשור באופן הדוק ל...

שלום, אני סאן לי מהמעבדה של סטיבן הרלם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת בריטיש קולומביה. היום נדגים לכם פרוצדורה להפקת DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מדגימות קרקע מיער, שניתן להחיל גם על מגוון רחב של סוגי קרקעות ומשקעים. אנו משתמשים ב-DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה כדי לבנות את ספריית הפורסט-מטר (forest meter) של קהילות מיקרוביאליות בקרקע.בעזרת ספריות אלו, נוכל לחקור את הגיוון ואת הפוטנציאל המטבולי של קהילות מיקרוביאליות המופרדות בין אופקי קרקע שונים. אם כן, נתחיל בתהליך. פרוטוקול זה מתחיל בליזיס של התאים.השלב הראשון הוא השלמת בופר הדנטורציה על ידי הוספת betta mer capto ethanol לריכוז של 0.5%. לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו את תמיסת הדנטורציה באופן טרי בכל פעם. לחלופין, השתמשו בבופר שגילו פחות משבוע ונשמר בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. לשלב הבא, תזדקקו למכל של חנקן נוזלי, לאוטוקלב, למכתש ועלי וספטולה שקוללרו מראש.הניחו דגימת קרקע קפואה במשקל שני גרם במכתש שקולל מראש. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת הדנטורציה. לאחר מכן, הוסיפו חנקן נוזלי עד לכיסוי מלא של הקרקע.השתמשו בעקת המקפיאה קודם לכן כדי לטחון את הדגימה עד שחלקיקי הקרקע נראים אבקתיים והומוגניים והדגימה מתחילה להפשיר. לאחר מכן, הוסיפו חנקן נוזלי נוסף וחזרו על שלב הטחינה. פעולה זו משלימה את שלב ליזיס התאים תוך שימוש במרית שהוקפאה קודם לכן.העבירו את הדגימה הטחונה למבחנה קונית של 50 milliliter. שמרו את הדגימה על קרח כדי להמשיך באופן מיידי לשלב מיצוי ה-DNA, או אחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. לשימוש מאוחר יותר, רגע לפני תחילת מיצוי ה-DNA, השלימו את באפר המיצוי על ידי הוספת hexa deco trimethyl ammonium bromide או CTAB ו-SDS.בדקו אם ה-CTAB התגבש, ואם כן, המסו אותו בטמפרטורה של 60 °C לפני ההמשך. לאחר מכן, הוסיפו אותו לתמיסה עד לריכוז סהריבי של 1%. כעת, הוסיפו תמיסת SDS בריכוז 20% עד לריכוז סופי של 2%. השCsuspension חלבית שנוצרת היא תקינה.לאחר הוספת ה-SDS, שמרו על הומוגניות של תמיסת המיצוי המוכנה על ידי אחסוןה בטמפרטורה של 60 °C לאחר 10 עד 15 דקות. ברגע שתמיסת המיצוי מומסת היטב והיא הומוגנית, הוסיפו תשעה מיליליטרים של תמיסת מיצוי לדגימת הקרקע ובצעו ערבוב קצר ב-vortex במהירות נמוכה. דגרו את הדגימה עם תמיסת המיצוי בתנור היברידיזציה בטמפרטורה של 65 °C למשך 40 דקות.במהלך הדגירה, הפכו בעדינות את המבחנות מדי 10 דקות או סובבו את המבחנות ברציפות במהירות הנמוכה ביותר של הרוטור. במהלך הדגירה, התמיסה עשויה להיראות צמיגית מעט לאחר סיום התהליך. השלב הבא הוא שימוש בכלורופורם-איזואמיל אלכוהול כדי לטהר את ה-DNA מחומרים אורגניים בתערובת הליסיס.התחילו בצנטריפוגציה של הדגימה למשך 10 דקות ב-1800 Gs בטמפרטורה של כ-10 עד 14 °C בתוך המנדף, ואספו את העלייה (supernatant) המכילה את ה-DNA על ידי החלקת קצה הפ pipette בזהירות לאורך דופן המבחנה, תוך הימנעות מהשכבה הבז'ית בחלק העליון ומהשכבה האורגנית בתחתית. העבירו את העלייה למבחנה של 50 milliliter שהוקררה מראש ומכילה 20 milliliters של chloroform ISL alcohol or i a a. לאחר מכן, חזרו על תהליך המיצוי פעמיים נוספות על אותה דגימה. בינתיים, השאירו את תמצית ה-DNA ואת ה-chloroform i a a על קרח בתוך המנדף.עבור הפקת ה-DNA השנייה, חזרו למבחנה המכילה את משקע הקרקע עם תמיסת ההפקה הנותרת והוסיפו חמישה מיליליטרים נוספים של תמיסת הפקה. ערבבו בעדינות באמצעות טיפ של מיליליטר אחד כדי לערבב, ובצעו vortex קצר כדי להשעות מחדש את המשקע כפי שנעשה קודם לכן. הדגירה תהיה הפעם בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות.לאחר מכן, סרטזנטר ב-1800 Gs למשך 10 דקות. במצב של כ-10 עד 14 מעלות צלזיוס בתוך המנדף, העבר את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה המכילה כלורופורם, איזואמיל אלכוהול או chloroform i a a ואת הנוזל העליון מההפקה הקודמת. חזור על תהליך ההפקה כולו פעם נוספת כדי להפיק כמה שיותר DNA מדגימת הקרקע.לאחר השלמת סך של שלוש מיצויים מדגימת הקרקע, נערו בעדינות רבה את המבחנה המכילה את העל-נוזל (supranatant) והכלורופורם שנאספו על גבי פלטה מסתובבת במהירות של 1.25 RRP m למשך 10 דקות. לאחר שלב ערבוב זה, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-1800 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של כ-10 עד 14 degrees Celsius. לאחר הסבב בצנטריפוגה, העבירו בזהירות את הפאזה המימית למבחנה חדשה לאולטרה-צנטריפוגה, והשאירו 1 עד 2 מיליליטר של SNAT כדי למנוע פגיעה בממשק שבין הפאזה המימית לפאזה האורגנית. כעת, כדי להשקיע את ה-DNA, הוסיפו 0.6 מיליליטר של איזופרופנול.לכל מיליליטר של עליל שנאסף, הפכו את המבחנות בעדינות מספר פעמים כדי לערבב. בנקודה זו, ייתכן שתוכלו לראות את ה-DNA שוקע לצורת חוטים ארוכים. לאחר מכן, דגרו את ה-DNA עם האיסוֹפרוֹפַּנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה, הגיע הזמן לשקיע את ה-DNA באמצעות סנטריפוגציה. סמנו פינה אחת של הפרועת בעת הנחתה בסנטריפוגה, כדי שתוכלו לדעת היכן לצפות למשקע ה-DNA. סובבו במהירות של 16,000 GS למשך 20 דקות בטמפרטורה של 20 עד 25 °C. לאחר הסנטריפוגציה, הסירו את האיזופרופנול על ידי מזיגה או שאיבה בוואקום. היזהרו לא לאבד את משקע ה-DNA, שגודלו נע בין בקושי נראה לעד רוחב של 9 מילימטרים, בהתאם ליעילות המיצוי ולביומסה בדגימות הקרקע. ייבשו את משקע ה-DNA בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 20 דקות. היזהרו לא לייבש יתר על המידה כאשר המשקע יבש.יש להמיס מחדש את ה-DNA ב-200 עד 400 µL של TE. ערבב בנקישה עדינה. העבר את תמיסת ה-DNA למבחנה של 1.5 mL.שמרו את ה-DNA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס במהלך הלילה. על מנת להמיס את ה-DNA באופן מלא לאחר שהוצא מהדגימה של האדמה, השלבים הנותרים לבדיקת הריכוז ושלמות ה-DNA של הדגימה הם הליכים סטנדרטיים, המתוארים בפירוט בפרוטוקול JoVE אחר ממעבדתו של Hallam. קבעו את ריכוז ה-DNA באמצעות השיטה הבחירתכם.בדקו בנוסף את שלמות ה-DNA בעל המשקל המולקולרי הגבוה על ידי הרצה של 10 עד 20 µL מדגימת ה-DNA שלכם באמצעות אלקטרופורזה בשדה פולס (PFGE). גודל ה-DNA החציוני צריך להיות 36 kb או יותר, בהתאם ליישום ההמשך שלכם. המשיכו לשלב הבא של סבוב במרכז פוגה במדרג של צסיום כלוריד; לחלופין, ניתן לאחסן את ה-DNA בטמפרטורה של 20°C- או 80°C- לפני האולטרה-צנטריפוגציה.השלב הבא הוא שימוש בסנטיפוגת עם מדרג צפיפות של צסיום כלוריד כדי לטהר את ה-DNA עוד יותר על ידי הסרת זיהומים, ולאחריו ריכוז וטיהור נוסף של ה-DNA באמצעות התקני סינון צנטריפוגיים מסוג AmCon ו-MicroCon. הסנטיפוגה במדרג צפיפות של צסיום כלוריד היא המפתח להשגת DNA באיכות גבוהה, והיא מתוארת בפירוט בפרוטוקול JoVE אחר ממעבדתו של Hallam. לאחר ביצוע שלבי הסנטיפוגה במדרג צפיפות של צסיום כלוריד והריכוז, בדקו את ריכוז ה-DNA באמצעות השיטה הבחירה שלכם.בשלב הבא, בדקו פעם נוספת את שלמות ה-DNA בעל המשקל המולקולרי הגבוה על ידי הרצת דגימה קטנה של ה-DNA באמצעות PFGE. הכמות הכוללת של DNA גנומי שהבודל משני גרם של קרקע מאולצת נעה בין 10 ל-180 מיקרוגרם, כפי שמוצג בהרצת הג'ל לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגציה של צסיום כלוריד. טווח הגדלים של ה-DNA המבודל נע בדרך כלל בין 40 ל-60 קילו-בסיסים; כאן מוצג כרומטוגרם של דגימות DNA גנומי לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגציה של צסיום כלוריד.שלב זה משפר את טהוּר ה-DNA על ידי העלאת היחס בין 260 ל-280 מ-1.3 ל-1.6 לפני כן, ל-1.8 עד 1.9 לאחר מכן. יתרה מכך, שיא הבליעה באורך גל של 230 ננומטרים, המעיד על זיהום בחומצה הומית, הופחת בהצלחה לאחר סנטריפוגה. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבודד DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מקהילות מיקרוביאליות בקרקע.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין את בופר המיצוי והדנטורציה בדיוק לפי ההוראות. כמו כן, יש להיזהר לא לגעת במישור ה-DNA לאחר שקיעה באיזופרופנול. כאשר אתם משחזרים את פס ה-DNA לאחר צנטריפוגציה במדרג כלוריד.אל תשכחו לשטוף את המזרק עם ה-TE כדי למקסם את השחזור של ה-DNA. ולבסוף, יש לבדוק את הכמות והאיכות של ה-DNA שבודד בכל השלבים המוצעים. וזה הכל.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.

extraction-high-molecular-weight-genomic-dna-from-soils

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ"א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

מיצוי DNA מרוק יכול לספק מקור זמין ל-DNA במשקל מולקולרי גבוה, עם מעט פירוק/פיצול.  פרוטוקול זה מספק פרמטרים אופטימליים לאיסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כדי שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA במורד הזרם עם דרישות איכות גבוהות.

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

הקריוספירה מציע גישה אורגניזמים משומרים שנמשכו בתנאים סביבתיים בעבר. פרוטוקול מוצג לאסוף לטהר ליבות קרח העד של קרקעות וקרח. עדר מושבות אקסוגניים ו- DNA מראה כי מיקרואורגניזמים זוהה מייצג את החומר, ולא זיהום מקידוחים או עיבוד.

הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח

מתוארת כאן שיטה למיצוי, טיהור ובקרת איכות של DNA גנומי מהפתוגן הפטרייתי הביוטרופי המחייב, טחב אבקתי, לשימוש בריצוף גנום לקריאה ארוכה.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-CTAB לחילוץ DNA איכותי ממיקובקטריה, תוך התמודדות עם האתגרים שמציבים דפנות התאים הקשות והעשירות בחומצה המיקולית. התהליך כולל עיכול אנזימטי, פירוק תאים באמצעות CTAB, וטיהור DNA באמצעות הפקה אורגנית והשקעת אתנול. שיטה זו מייצרת DNA המתאים למחקרים מולקולריים ואמינה למחקר מיקובקטריאלי.

הפקת חומצה דאוקסיריבונוקלית בגנום מלא ממיני מיקובקטריום באמצעות טכניקת Cetyltrimethylammonium Bromide

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

למד שיטה לאיסוף DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מקרקעות ומשקעים שונים. פרוטוקול זה מאפשר חקר מגוון מיקרוביאלי ופוטנציאל מטבולי בקהילות קרקע.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

גלה סרטונים נוספים