הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

שלום, אני סאן לי מהמעבדה של סטיבן הרלם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת בריטיש קולומביה. היום נדגים לכם פרוצדורה להפקת DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מדגימות קרקע מיער, שניתן להחיל גם על מגוון רחב של סוגי קרקעות ומשקעים. אנו משתמשים ב-DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה כדי לבנות את ספריית הפורסט-מטר (forest meter) של קהילות מיקרוביאליות בקרקע.

בעזרת ספריות אלו, נוכל לחקור את הגיוון ואת הפוטנציאל המטבולי של קהילות מיקרוביאליות המופרדות בין אופקי קרקע שונים. אם כן, נתחיל בתהליך. פרוטוקול זה מתחיל בליזיס של התאים.

השלב הראשון הוא השלמת בופר הדנטורציה על ידי הוספת betta mer capto ethanol לריכוז של 0.5%. לקבלת תוצאות מיטביות, הכינו את תמיסת הדנטורציה באופן טרי בכל פעם. לחלופין, השתמשו בבופר שגילו פחות משבוע ונשמר בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. לשלב הבא, תזדקקו למכל של חנקן נוזלי, לאוטוקלב, למכתש ועלי וספטולה שקוללרו מראש.

הניחו דגימת קרקע קפואה במשקל שני גרם במכתש שקולל מראש. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת הדנטורציה. לאחר מכן, הוסיפו חנקן נוזלי עד לכיסוי מלא של הקרקע.

השתמשו בעקת המקפיאה קודם לכן כדי לטחון את הדגימה עד שחלקיקי הקרקע נראים אבקתיים והומוגניים והדגימה מתחילה להפשיר. לאחר מכן, הוסיפו חנקן נוזלי נוסף וחזרו על שלב הטחינה. פעולה זו משלימה את שלב ליזיס התאים תוך שימוש במרית שהוקפאה קודם לכן.

העבירו את הדגימה הטחונה למבחנה קונית של 50 milliliter. שמרו את הדגימה על קרח כדי להמשיך באופן מיידי לשלב מיצוי ה-DNA, או אחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. לשימוש מאוחר יותר, רגע לפני תחילת מיצוי ה-DNA, השלימו את באפר המיצוי על ידי הוספת hexa deco trimethyl ammonium bromide או CTAB ו-SDS.

בדקו אם ה-CTAB התגבש, ואם כן, המסו אותו בטמפרטורה של 60 °C לפני ההמשך. לאחר מכן, הוסיפו אותו לתמיסה עד לריכוז סהריבי של 1%. כעת, הוסיפו תמיסת SDS בריכוז 20% עד לריכוז סופי של 2%. השCsuspension חלבית שנוצרת היא תקינה.

לאחר הוספת ה-SDS, שמרו על הומוגניות של תמיסת המיצוי המוכנה על ידי אחסוןה בטמפרטורה של 60 °C לאחר 10 עד 15 דקות. ברגע שתמיסת המיצוי מומסת היטב והיא הומוגנית, הוסיפו תשעה מיליליטרים של תמיסת מיצוי לדגימת הקרקע ובצעו ערבוב קצר ב-vortex במהירות נמוכה. דגרו את הדגימה עם תמיסת המיצוי בתנור היברידיזציה בטמפרטורה של 65 °C למשך 40 דקות.

במהלך הדגירה, הפכו בעדינות את המבחנות מדי 10 דקות או סובבו את המבחנות ברציפות במהירות הנמוכה ביותר של הרוטור. במהלך הדגירה, התמיסה עשויה להיראות צמיגית מעט לאחר סיום התהליך. השלב הבא הוא שימוש בכלורופורם-איזואמיל אלכוהול כדי לטהר את ה-DNA מחומרים אורגניים בתערובת הליסיס.

התחילו בצנטריפוגציה של הדגימה למשך 10 דקות ב-1800 Gs בטמפרטורה של כ-10 עד 14 °C בתוך המנדף, ואספו את העלייה (supernatant) המכילה את ה-DNA על ידי החלקת קצה הפ pipette בזהירות לאורך דופן המבחנה, תוך הימנעות מהשכבה הבז'ית בחלק העליון ומהשכבה האורגנית בתחתית. העבירו את העלייה למבחנה של 50 milliliter שהוקררה מראש ומכילה 20 milliliters של chloroform ISL alcohol or i a a. לאחר מכן, חזרו על תהליך המיצוי פעמיים נוספות על אותה דגימה. בינתיים, השאירו את תמצית ה-DNA ואת ה-chloroform i a a על קרח בתוך המנדף.

עבור הפקת ה-DNA השנייה, חזרו למבחנה המכילה את משקע הקרקע עם תמיסת ההפקה הנותרת והוסיפו חמישה מיליליטרים נוספים של תמיסת הפקה. ערבבו בעדינות באמצעות טיפ של מיליליטר אחד כדי לערבב, ובצעו vortex קצר כדי להשעות מחדש את המשקע כפי שנעשה קודם לכן. הדגירה תהיה הפעם בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות.

לאחר מכן, סרטזנטר ב-1800 Gs למשך 10 דקות. במצב של כ-10 עד 14 מעלות צלזיוס בתוך המנדף, העבר את הנוזל העליון (supernatant) למבחנה המכילה כלורופורם, איזואמיל אלכוהול או chloroform i a a ואת הנוזל העליון מההפקה הקודמת. חזור על תהליך ההפקה כולו פעם נוספת כדי להפיק כמה שיותר DNA מדגימת הקרקע.

לאחר השלמת סך של שלוש מיצויים מדגימת הקרקע, נערו בעדינות רבה את המבחנה המכילה את העל-נוזל (supranatant) והכלורופורם שנאספו על גבי פלטה מסתובבת במהירות של 1.25 RRP m למשך 10 דקות. לאחר שלב ערבוב זה, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-1800 Gs למשך 20 דקות בטמפרטורה של כ-10 עד 14 degrees Celsius. לאחר הסבב בצנטריפוגה, העבירו בזהירות את הפאזה המימית למבחנה חדשה לאולטרה-צנטריפוגה, והשאירו 1 עד 2 מיליליטר של SNAT כדי למנוע פגיעה בממשק שבין הפאזה המימית לפאזה האורגנית. כעת, כדי להשקיע את ה-DNA, הוסיפו 0.6 מיליליטר של איזופרופנול.

לכל מיליליטר של עליל שנאסף, הפכו את המבחנות בעדינות מספר פעמים כדי לערבב. בנקודה זו, ייתכן שתוכלו לראות את ה-DNA שוקע לצורת חוטים ארוכים. לאחר מכן, דגרו את ה-DNA עם האיסוֹפרוֹפַּנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, הגיע הזמן לשקיע את ה-DNA באמצעות סנטריפוגציה. סמנו פינה אחת של הפרועת בעת הנחתה בסנטריפוגה, כדי שתוכלו לדעת היכן לצפות למשקע ה-DNA. סובבו במהירות של 16,000 GS למשך 20 דקות בטמפרטורה של 20 עד 25 °C. לאחר הסנטריפוגציה, הסירו את האיזופרופנול על ידי מזיגה או שאיבה בוואקום. היזהרו לא לאבד את משקע ה-DNA, שגודלו נע בין בקושי נראה לעד רוחב של 9 מילימטרים, בהתאם ליעילות המיצוי ולביומסה בדגימות הקרקע. ייבשו את משקע ה-DNA בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 20 דקות. היזהרו לא לייבש יתר על המידה כאשר המשקע יבש.

יש להמיס מחדש את ה-DNA ב-200 עד 400 µL של TE. ערבב בנקישה עדינה. העבר את תמיסת ה-DNA למבחנה של 1.5 mL.

שמרו את ה-DNA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס במהלך הלילה. על מנת להמיס את ה-DNA באופן מלא לאחר שהוצא מהדגימה של האדמה, השלבים הנותרים לבדיקת הריכוז ושלמות ה-DNA של הדגימה הם הליכים סטנדרטיים, המתוארים בפירוט בפרוטוקול JoVE אחר ממעבדתו של Hallam. קבעו את ריכוז ה-DNA באמצעות השיטה הבחירתכם.

בדקו בנוסף את שלמות ה-DNA בעל המשקל המולקולרי הגבוה על ידי הרצה של 10 עד 20 µL מדגימת ה-DNA שלכם באמצעות אלקטרופורזה בשדה פולס (PFGE). גודל ה-DNA החציוני צריך להיות 36 kb או יותר, בהתאם ליישום ההמשך שלכם. המשיכו לשלב הבא של סבוב במרכז פוגה במדרג של צסיום כלוריד; לחלופין, ניתן לאחסן את ה-DNA בטמפרטורה של 20°C- או 80°C- לפני האולטרה-צנטריפוגציה.

השלב הבא הוא שימוש בסנטיפוגת עם מדרג צפיפות של צסיום כלוריד כדי לטהר את ה-DNA עוד יותר על ידי הסרת זיהומים, ולאחריו ריכוז וטיהור נוסף של ה-DNA באמצעות התקני סינון צנטריפוגיים מסוג AmCon ו-MicroCon. הסנטיפוגה במדרג צפיפות של צסיום כלוריד היא המפתח להשגת DNA באיכות גבוהה, והיא מתוארת בפירוט בפרוטוקול JoVE אחר ממעבדתו של Hallam. לאחר ביצוע שלבי הסנטיפוגה במדרג צפיפות של צסיום כלוריד והריכוז, בדקו את ריכוז ה-DNA באמצעות השיטה הבחירה שלכם.

בשלב הבא, בדקו פעם נוספת את שלמות ה-DNA בעל המשקל המולקולרי הגבוה על ידי הרצת דגימה קטנה של ה-DNA באמצעות PFGE. הכמות הכוללת של DNA גנומי שהבודל משני גרם של קרקע מאולצת נעה בין 10 ל-180 מיקרוגרם, כפי שמוצג בהרצת הג'ל לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגציה של צסיום כלוריד. טווח הגדלים של ה-DNA המבודל נע בדרך כלל בין 40 ל-60 קילו-בסיסים; כאן מוצג כרומטוגרם של דגימות DNA גנומי לפני ואחרי אולטרה-צנטריפוגציה של צסיום כלוריד.

שלב זה משפר את טהוּר ה-DNA על ידי העלאת היחס בין 260 ל-280 מ-1.3 ל-1.6 לפני כן, ל-1.8 עד 1.9 לאחר מכן. יתרה מכך, שיא הבליעה באורך גל של 230 ננומטרים, המעיד על זיהום בחומצה הומית, הופחת בהצלחה לאחר סנטריפוגה. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבודד DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מקהילות מיקרוביאליות בקרקע.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין את בופר המיצוי והדנטורציה בדיוק לפי ההוראות. כמו כן, יש להיזהר לא לגעת במישור ה-DNA לאחר שקיעה באיזופרופנול. כאשר אתם משחזרים את פס ה-DNA לאחר צנטריפוגציה במדרג כלוריד.

אל תשכחו לשטוף את המזרק עם ה-TE כדי למקסם את השחזור של ה-DNA. ולבסוף, יש לבדוק את הכמות והאיכות של ה-DNA שבודד בכל השלבים המוצעים. וזה הכל.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.