Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

סרטון זה מציג טריקת פולימרים (electro spinning), טכניקה נפוצה להנדסת רקמות ותרביות תאים ליצירת פיגומים סיביים המדמים את הארכיטקטורה וקנה המידה של המטריצה החוץ-תאית הטבעית. כאן אנו מבצעים טריקה של חומצה היאלורונית פוטו-ריאקטיבית המסוגלת לעבור קשירה צולבת בחשיפה לאור, ומציגים יישומים נוספים של עיבוד כגון תבנית פוטו-גרפית (photo patterning) – תהליך היוצר תעלות, פיגומים ונקבוביות רב-קנית להגברת חדירת התאים וההפצה הרקמתית. בנוסף, אנו משתמשים ביצירת פיגום רב-פולימרי המאפשרת טריקה של שני פולימרים שונים לתוך אותה רשת, מה שמאפשר כוונון של המכניקה והפירוק של הפיגום והתאמה של הנקבוביות עבור חדירת תאים.

שלום, אני ג'יימי קובי מהמעבדה של ג'ייסון בורדיק במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת פנסילבניה. שלום, אני הריני סווין, גם אני ממעבדת בורדיק. היום נראה לכם הליך ליצירת פיגומים סיביים בשיטת אלקטרו-ספינינג להנדסת רקמות.

נציג גם את יכולות העיבוד הנוספות של דפוס תמונה (photo patterning) ויצירת פיגומים רב-פולימריים. אנו משתמשים בהליכים אלו במעבדתנו כדי לחקור אינטראקציות וחדירות של תאי HMSE בפיגומים של חומצה היאלורונית. כמו כן, אנו משתמשים בטכניקות אלו עם פולימרים שונים אחרים כדי לחקור רקמות מחוזקות בסיבים, כגון המניסקוס והשריר הלבבי (myocardium).

בואו נתחיל. הכינו תמיסה של 0.5% weight של הפוטו-איניצ'יטור. אני ממיס Irgacure 2959 או I 29 5 9 במים דה-יוניזציה על ידי המסה בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר ימים.

משתמשים ב-I cure כאשר נדרש פולימר פוטוריאקטיבי עבור אלקטרו-ספינינג (electro spinning). כדי להכין את תמיסת האלקטרו-ספינינג, מערבבים במים דאיוניים עד לריכוזים סופיים של 2%weight methylated hyaluronic acid או MEHA, 3%weight polyethylene oxide או PEO ו-0.05%weight תמיסת I 2 9 5 9, מערבבים ב-vortex למשך חמש דקות ומדגירים ב-37 °C למשך לילה.

בשלב הבא, השתמשו במזרק חשמלי (syringe pump) והגדירו אותו להזרקה בקצב של 1.2 milliliters per hour. הכניסו את מחט מנוע המזרק אל המזרק החשמלי. חברו את המוליך המוארק של מקור מתח גבוה למערכת האיסוף.

בנוהל זה, נשתמש במנדרל המסתובב במהירות של כ-10 meters per second. כדי לאסוף סיבים מיושרים, חברו את המוליך בעל המטען החיובי למחט, וכוונו את המחט או את התקן האיסוף כך שיהיה ביניהם מרחק של 15 centimeter. הפעילו את זרימת משאבת המזרק, וכאשר ניתן להבחין בנוזל בקצה המחט, הפעילו את מקור המתח וכווננו את המתח ל-22 kilovolts.

אספו את הסיבים על הפיגום עד להשגת העובי הרצוי. זמן האיסוף תלוי בעובי המבוקש ובנפח תמיסת האלקטרו-ספינינג שנעשה בה שימוש. עבור תבניות פוטו-גרפיות, אנו משתמשים במצעים שעברו אלקטרו-ספינינג במשך 16 שעות.

הסיר את הפיגום ממכשיר האיסוף לאחר השלמת האיסוף ואחסן אותו בוואקום למשך לילה להסרה מלאה של הממס. גזור מדגימות של חמישה מילימטר על חמישה מילימטר ממעטון הפיגום בעזרת מספריים. הנח כל פיגום על שקופית זכוכית מכוסה בנייר אלומיניום כדי להכינו לקשירה צולבת, והנח את מסכת הפוטו ישירות על הפיגום תוך כיסיו בשקופית זכוכית נקייה וקיבוע שני קצות השקופית בעזרת תפסים.

באמצעות תא חנקן, יש לבצע פירגינג (purge) למסבך כדי למנוע הפחתה של קשירת הצלבה עקב חשיפה לחמצן. הנח את מערך המסבך בתוך תא החנקן תחת אור באורך גל של 365 ננומטר בעוצמה של כ-10 מיליוואט לסמ"ר עם מתאם קולטינג למשך חמש דקות. הוצא כל מסבך והנח אותו בתוך פלטת תרבית רקמות של 12 בארות.

הוסיפו שני מיליליטרים של מים דאיוניים לכל באר. כסו את הפלטה כדי למנוע התאיידות של המים והניחו אותה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות. החליפו את המים בכל שמונה שעות, תוך שימוש בפיפטה ואקום לשאיבת המים הדאיוניים מהבאר בין השטיפות.

הכינו תמיסה של 5% weight של PEO ב-90% ethanol על פלטה מחממת. ערבבו במהירות של 700 RPM בטמפרטורה של 50 degrees Celsius למשך שעתיים לפחות לפני התהליך. לאחר הערבוב, הוסיפו DPI לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter.

העבירו את תמיסת ה-PEO וה-DPI למזרק של שלושה מיליליטרים ועטפו אותו בנייר אלומיניום להגנה מאור. לאחר מכן, הכינו את תמיסת האלקטרו-ספינינג המתוארת בחלק השני והוסיפו methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B לריכוז סופי של 25 micromolar באמצעות מיקרו-פיפט למזרק של שלושה מיליליטרים. עטפו בנייר אלומיניום להגנה מאור.

השתמשו בזהירות בסרט דביק כדי להצמיד את קצוותיהן של זכוכית כיסוי מתילתית בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר לפני השטח של המנדריל, כך שזכוכית הכיסוי תתאים להיקף המנדריל. בעזרת קטע צינור סיליקון באורך חמישה מילימטרים, חברו קצה אחד לאחת המזרקים בעלי חיבורי lure lock. חברו את הקצה השני למחט, הכניסו את המזרק למשאבת המזרקים והעבירו את המחט דרך החור במאוורר.

המפזרים (fanners) חוצים את אורך המנדרל ומשמשים להבטחת פיזור שווה של שני הפולימרים בפיגום המתקבל. ודאו שקצוות המחטים ממרכזים על המנדרל עבור המזרק המכיל MEHA. מקמו את קצה המחט במרחק של 15 סנטימטרים מהמנדרל והגדירו את המפזר למרחק של שישה סנטימטרים מקצה המחט.

תכנת את משאבת המזריקה לספק 1.2 milliliters לשעה והגדר את מקור המתח ל-22 kilovolts. הכן את המזרק עם PEO בדיוק באותה הצורה, אך מקם את קצה המחט במרחק של 10 centimeters מהמנדרל והגדר את מקור המתח ל-15 kilovolts. לאחר מכן, כבה את האורות והפעל את המנדרל ואת משאבות המזרקות.

הסירו את רדיד האלומיניום מהמזרקים כאשר נוזל נראה בקצות שתי המחטים. הפעילו בו-זמנית את ספקי הכוח וחברו את המאווררים כאשר האיסוף הושלם. כבו את ספקי הכוח ואת המנדרל ונתקו את המאווררים בזהירות.

הסירו את זכוכיות הכיסוי ואת הסרט הדביק באמצעות להב תער. ניתן להדמיות את הסיבים במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור rumine ו-dpi. הניחו כל זכוכית כיסוי עליה מודבק פולימר electro spon לתוך באר נפרדת של פלטת שש.

דplate של בארות דגירה של הפיגומים ב-2 milliliters של PBS למשך לילה כדי להבטיח הסרה מלאה של הממס ומזהמים. לאחר 24 שעות, השתמש בוואקום כדי לשאוב את ה-PBS מלוח הבארות והנח את הפיגומים תחת מנורת UV קוטלת חיידקים במנדף זרימה למינרית למשך 30 דקות. לצורך עיקר, בצע תרבית תאים סטנדרטית והכן תרחיף תאים מרוכז בצפיפות התאים הרצויה.

לדוגמה, השתמשו ב-100 milliliters של תרחיף תאים עבור ליתקת של 22 על 22 millimeter. הניחו באינקובטור למשך שעה אחת. הוסיפו לכל אחד את הכמות המתאימה של מצע גידול תאים.

החזירו את הפיגומים למדגרה. צבעו את התאים באמצעות ערכה מסחרית לצביעת תאים חיים ומתים (live dead kit) מבית Invitrogen כדי להדמיות של התאים והסיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במסננים עבור trissy ו-fitzy. כמצופה, פיגומים שנאספו על גבי פלטה שטוחה ומוארקת יציגו סיבים המפוזרים באופן אקראי, בעוד שפיגומים שנאספו על גבי מנדריל מסתובב יציגו סיבים מסודרים.

היווצרו סיבים מיושרים כפי שנראה במיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת; במהלך קשירה צולבת פוטוכימית של הפיגום, הנחנו מסכה פוטווגית בין הפיגום למקור האור לאחר טבילת הפיגום במים דאיוניים ו-ha שאינו פעיל. אזורים אלו נחסמו מהאור ו-PEO הוסר, ואנו רואים היווצרויות של מקרו-נקבוביות כפי שעולה מהצבע הפלואורסצנטי. אלקטרו-ספינינג סימולטני של נתיקי MEHA ו-PEO גורם לפיגום מרוכב המכיל אוכלוסיות סיבים מובחנות המורכבות מהפולימרים האינדיבידואליים.

נראה כי תאי השריר החלקים (HMCs) מגיבים באופן חיובי לסיבים. לא רק שהם נותרים חיוניים, כפי שמעיד הצביע הירוק, אלא נראה כי הם מכוונים את עצמם כך שיהיו מיושרים לאורך הסיבים האדומים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע אלקטרו-ספינינג (electro spin) של פיגומים סיביים להנדסת רקמות.

הצגנו גם יכולות נוספות כגון תבנית פוטו-כימית (photo patterning) ואלקטרו-ספינינג של פולימרים מרובים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע אופטימיזציה של פרמטרי האלקטרו-ספינינג של כל פולימר כדי ליצור סיבים אחידים בטרם ניסיון לבצע ניסויים נוספים. וזהו זה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.