Name: Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: למדו את שיטת האלקטרוספינינג ליצירת פיגומים סיביים מפולימרים פוטוריאקטיביים עבור הנדסת רקמות. השיטה מאפשרת עיצוב תבניות פוטוגרפיות ופיגומי רב-פולימרים לשיפור חדירות תאים והתפלגות רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי עמיתי American Heart Association Predoctoral כדי JLI ו National Institutes of הית מענק R01AR056624.

א יחיד פולימר Electrospinning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פתרון electrospinning, להפוך 0.5% wt פתרון של photoinitiator, Irgacure 2959 (I2959), במים deionized ידי המסת על 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. שלב זה אינו הכרחי אם פולימר photoreactive לא נמצא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חומצה היאלורונית methacrylated (MeHA, ראה Burdick et al. לסינתזה), פולי (אתילן אוקסיד) (PEO, 900 KDA), ו - I2959 במים deionized להכין פתרון סופי עם ריכוז של 2% wt MeHA, 3% wt PEO, ו 0.05% wt I2959. השתמש מערבולת לערבב עד הפתרון ברור. סוג הפולימר וריכוז, כמו גם בשימוש ממס ניתן לשנות בשלב זה תלוי התכונות הרצויות הפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התמיסה לתוך מזרק וצרף מד 18, 6 אינץ&#39; ארוכה, סוף מחט קהה עד הסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית מזרק משאבה להוציא בשיעור של 1.2 מ&quot;ל / שעה. הכנס את מחט המזרק לתוך המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את ההובלה מקורקע של מקור מתח גבוה חשמל מנגנון האיסוף. כדי לאסוף באופן אקראי סיבים מופץ להשתמש לוחית מתכת שטוחה, או להשתמש mandrel מסתובב ב ~ 10 m / s לאסוף סיבים מיושר. צרף להוביל מטען חשמלי חיובי אל המחט. ראה איור 1 עבור סכמטי של המנגנון electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המחט או מכשיר לאיסוף, כזה שיש מרחק 15 ס&quot;מ בין השניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת על משאבת מזרק. כאשר נוזל הוא מדמיין על קצה המחט, להפעיל את מקור הכוח לקבוע את מתח kV 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף תושלם (מתוך מספר דקות עבור שכבות דקות, עד עד 24 שעות על מחצלת עבה), להסיר את הפיגום מן המנגנון אוסף ולאחסן אותו תחת ואקום לילה על מנת להבטיח הסרה מלאה של הממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את המורפולוגיה סיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), פיגום נציג מוצג באיור 1 עבור שני מבנים בציר הבלתי מזדהות. </li></ol> הערה: זרימת קצב דגימה, מרחק למכשיר אוסף, מתח תלויים בשילוב פולימר ממס חייב להיות מותאם עבור כל מערכת, בדרך כלל על ידי התבוננות מורפולוגיה פיגום עם SEM. ב Photocrosslinking ו Photopatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור 5mm דגימות X 5 מ&quot;מ מהמזרן הפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו crosslinking ידי הצבת כל פיגום על נייר מכוסה שקופיות הזכוכית, הצבת photomask ישירות על הפיגום, עם מכסה זכוכית שקופית נקי גזיר בשני הקצוות עם קליפים קלסר. הערה: ארבעה דוגמאות ניתן לעשות זאת בבת אחת, ללא שקיפות דפוס יכול לשמש crosslinking אם דפוס לא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר פיגום להגדיר בתא חנקן. חשוב לשמור לבנות ללא חמצן, אשר יכול לעכב crosslinking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הפיגום ההתקנה בחדר חנקן תחת ~ 10 mW / cm 2 365 ננומטר אור עם מתאם collimating במשך 5 דקות. ראה סכמטי באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל פיגום ומניחים צלחת 12 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מים לתוך הבאר deionized כל parafilm את הצלחת על מנת למנוע אידוי של המים מקום 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. להחליף את המים שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו היווצרות נקבוביות תחת מיקרוסקופ אור (ראה לדוגמה איור 2). פיגומים כעת מוכן לשימוש. </li></ol> הערה: Photocrosslinking אינו הכרחי עבור סוגים רבים של פולימרים, אולם photopatterning ניתן להשתמש רק עם פולימרים photoreactive. ג Dual פולימר Electrospinning עם ויזואליזציה פלורסנט Fiber <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 5% wt פתרון של PEO (200 KDA) באתנול 90%. מערבבים בסל&quot;ד 700 ב 50 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון PEO כדי מזרק ולהוסיף DAPI ריכוז סופי של ריכוז מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​10 בפתרון electrospinning. לעטוף את המזרק בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון אותו תיאר A2 צעד, אלא גם להוסיף methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho, 683.24 g / mol) לצורך ריכוז סופי של 25 מיקרומטר בפתרון electrospinning. לעטוף את המזרק בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש נייר דבק כדי לאבטח coverslips זכוכית methacrylated (ראה Khademhosseini et al.) אל פני השטח של mandrel. הערה: סיבים יהיה קשור coverslips זכוכית methacrylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה אחד של פיסת זמן של 5 מ&quot;מ צינורות סיליקון עם קבצים מצורפים luer מנעול אחד מזרקים וחבר את הקצה השני מחט. הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק ולשים את המחט דרך החור האיכר. חזור עם המזרק איכר אחרים באתר ההפך mandrel. האברים לתרגם את length של mandrel ו משמשים כדי להבטיח חלוקה שווה של פולימרים הן הפיגום וכתוצאה מכך. ראה סכמטי באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הפרמטרים שתוארו בסעיף כראוי לפי טבלה 1. ודא טיפים מחט הם התרכזו mandrel. טבלה 1. Dual פולימר Electrospinning פרמטרים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מזרק </td><td> האיכר אל המחט עצה (ס&quot;מ) </td><td> מחט עצה כדי mandrel (ס&quot;מ) </td><td> קצב הזרימה (מ&quot;ל / שעה) </td><td> יישומי מתח (kV) </td></tr><tr><td> MeHA </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם הכל מיושר כמו שצריך, לכבות את האורות ולהדליק mandrel לבין משאבות מזרק. הסר את רדיד אלומיניום מן המזרקים. כאשר נוזל גלוי על קצות המחטים שניהם, בו זמנית להפעיל את ספקי כוח לחבר האברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אוסף שלם, לכבות את ספקי כוח mandrel ונתק את האברים. הסר בזהירות את coverslips קלטת באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את הסיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים עבור rhodamine ו DAPI. ראו דוגמה באיור 3. הערה: סיבים פלורסנט ברורים ביותר כדי להציג כאשר electrospun לתקופות קצרות של זמן (&lt;3 דקות), לעומת זאת, תהליך זה יכול להתארך למשך פרק זמן בלתי מוגבל כדי ליצור מבנים עבה יותר, במיוחד ללא שימוש coverslips זכוכית . </li></ol> ד מתזמן תאים על פיגומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום כל coverslip עם electrospun מצורף לתוך פולימר יחיד היטב צלחת בגודל מתאים היטב. הערה: אינטראקציות הסלולר עם הסיבים גלויים בקלות על ידי electrospinning על coverslips זכוכית methacrylated. כמו כן, MeRho יכול שוב לשמש ראיה סיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פיגומים ב PBS לילה על מנת להבטיח הסרה מלאה של ממס וכל leachable אפשרי לפי מוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקר את הפיגומים, למקם אותם מתחת לפנס קוטל חידקים במנדף זרימה למינרית במשך 30 דקות. אם פיגום מלא הוא להיות seeded, להעיף את הפיגום על מקום מתחת לפנס קוטל חידקים לעוד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע תרבית תאים סטנדרטיים להכין ההשעיה תא מרוכזים בצפיפות התא הרצוי (לדוגמא: 6000 תאים -2 ס&quot;מ). לדוגמה, השתמש ב 100 מ&quot;ל של השעיה התא 22 מ&quot;מ X 22 מ&quot;מ coverslip. מקום בחממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות המתאימה של התקשורת בתרבות התא היטב כל אחד. מניחים את הפיגומים בחזרה לתוך החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים באמצעות ערכת Live / Dead זמינים מסחרית. הערה: סוגים אחרים של מכתים התא, כגון DAPI (גרעין התא) ו phalloidin שכותרתו fluorescently (סיבי אקטין מתח) יכול להיות מיושם כדי להמחיש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים סיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים עבור TRITC ו FITC. ראו דוגמה באיור 4. </li></ol> נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי המדגים את ההתקנה למכשיר ליצירת פיגום הבלתי מזדהות (למעלה) ו מיושר היווצרות הפיגום (התחתון). סריקה דוגמה אלקטרונים מיקרוסקופית תמונות של כל סוג של פיגום מוצגים. בר סולם = 5μm. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="איור 2" /> איור 2. סכמטי של שיטת דפוסים. דפוסי נוצרות על ידי הצבת photomask בין מקור האור לבין הפיגום במהלך photocrosslinking ואז שטיפת פולימר unreacted. Photomask ו SEM התמונה של פיגומים לאחר היווצרות lyophilization הנקבוביות. בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" /> איור 3 סכמטי של ההתקנה electrospinning רב פולימר פרמטרים עיבוד הכרחי, כמו גם תמונת פלורסנט נציג מתערובת של שתי האוכלוסיות סיבים (לדוגמה: אדום וכחול MeHA PEO). Electrospun שהיו בעת ובעונה אחת כדי ליצור רב פיגום פולימרי . בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות versio גדולn של הדמות 3. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="איור 4" /> איור 4. דוגמה חיה / המלח מכתים תמונה של אדם בתאי גזע mesenchymal ויחסי הגומלין שלהם עם סיבים electrospun. בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.

<ol><li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li>
<li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li>
<li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+on+the+Straight+and+Narrow%3A+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+B%22%5BJournal%5D)">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li>
<li>Sill, T. J., Von Recum, H. avon <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning%3A+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Electrospinning שימש להכין פיגומים סיבי פולימרים. Photocrosslinkable פיגומים מבוסס על חומצה היאלורונית שימשו דוגמה להמחשה, שבו חשיפה לאור דרוש crosslinking. עם השימוש macromers תגובתי, כגון MeHA, ערוצים הוכיחו בעבר הפצה סלולרית משופרת שולבו פיגומים עם השימוש במסכה במהלך photocrosslinking כדי ליצור פיגומים מאקרו ומיקרו נקבובי. יתר על כן, שני פולימרים שונים היו בו זמנית electrospun באמצעות מנגנון אישית שלנו. הנוכחות של שתי האוכלוסיות סיבים שונים אומתה עם תוספת של פלורסנט לצבוע לפתרו...

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td> ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>I2959</td><td>ריאגנט</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEO 200 kDa</td><td></td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17503</td><td></td></tr><tr><td>PEO 900 kDa</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>189456</td><td></td></tr><tr><td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td><td>ריאגנט</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23591-100</td><td>הכן תמיסת מלאי ב-DMSO</td></tr><tr><td>Live/Dead Stain Kit</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>מכיל Calcein (צובע תאים חיים בירוק) ו-ethidium homodime (צובע תאים מתים באדום)</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>ציוד</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td>שתיים נדרשות לטכניקת טריפת פולימר כפולה</td></tr><tr><td>מקור מתח</td><td>ציוד</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES30P-5W</td><td>שניים נדרשים לטכניקת טריפת פולימר כפולה</td></tr><tr><td>מנוע</td><td>ציוד</td><td>Triem Electric Motors, Inc</td><td>0132022-15</td><td>חייב להיות מחובר למנדרל שנבנה בהתאמה אישית</td></tr><tr><td>טאכומטר</td><td>ציוד</td><td>Network Tool Warehouse</td><td>ESI-330</td><td>משמש לניטור מהירות המנדרל</td></tr><tr><td>מערכת Omnicure UV Spot Cure עם מתאם קולימציה</td><td>ציוד</td><td>EXFO</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>צינורית סיליקון</td><td>ציוד</td><td>McMaster-Carr</td><td>51135K151</td><td></td></tr><tr><td>מתאם Luer Lock נקבה</td><td>ציוד</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td></td></tr><tr><td>מתאם Luer Lock זכר</td><td>ציוד</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td></td></tr><tr><td>מחטים</td><td>ציוד</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-825-16H</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי</td><td>ציוד</td><td>Corning</td><td>2875-22</td><td></td></tr></tbody></table>

electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות cell

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

כמו בתחום הנדסת רקמות מתפתחת, יש ביקוש עצום כדי לייצר חומרים מתאימים יותר וטכניקות עיבוד על מנת לענות על הדרישות (למשל, מכניקת כלי הדם) של איברים ורקמות יותר מורכב. Electrospinning היא טכניקה פופולרית כדי ליצור פיגומים סיבי המחקות את הארכיטקטורה ואת קנה המידה של גודל המטריצה ​​תאיים הילידים. אלה פיגומים סיבי מועילות גם מצעים תרבית תאים מאז הסיבים ניתן להשתמש כדי לכוון התנהגות הסלולר, כולל התמיינות בתאי גזע (ראה סקירות נרחבות על ידי Mauck<em&gt; Et al.</em&gt; ו סיל<em&gt; Et al.</em&gt; למידע נוסף). במאמר זה, אנו מתארים את התהליך הכללי של electrospinning פולימרים כדוגמה, electrospin חומצה היאלורונית תגובתי מסוגל crosslinking עם חשיפה לאור (ראה Ifkovits<em&gt; Et al.</em&gt; לסקירה על חומרים photocrosslinkable). כמו כן, אנו מציגים את יכולות עיבוד נוסף כגון photopatterning ורב פולימר היווצרות הפיגום. Photopatterning יכול לשמש כדי ליצור פיגומים עם ערוצי ורב היקף נקבוביות להגדיל את חדירת הסלולר והפצה רקמות. Multi-פולימר פיגומים מועילים יותר לכוון את התכונות (מכניקה השפלה) של פיגום, כולל נקבוביות המותאמים חדירת הסלולר. יתר על כן, הטכניקות האלה ניתן להרחיב כוללים מגוון רחב של פולימרים macromers תגובתי כדי ליצור פיגומים מורכבים המספקים את הרמזים הדרושים לפיתוח מוצלח בונה רקמות מהונדסות.

תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

ככל שתחום הנדסת הרקמות מתפתח, עולה דרישה עצומה לייצור חומרים וטכניקות עיבוד מתאימים יותר כדי לתת מענה ל...

סרטון זה מציג טריקת פולימרים (electro spinning), טכניקה נפוצה להנדסת רקמות ותרביות תאים ליצירת פיגומים סיביים המדמים את הארכיטקטורה וקנה המידה של המטריצה החוץ-תאית הטבעית. כאן אנו מבצעים טריקה של חומצה היאלורונית פוטו-ריאקטיבית המסוגלת לעבור קשירה צולבת בחשיפה לאור, ומציגים יישומים נוספים של עיבוד כגון תבנית פוטו-גרפית (photo patterning) – תהליך היוצר תעלות, פיגומים ונקבוביות רב-קנית להגברת חדירת התאים וההפצה הרקמתית. בנוסף, אנו משתמשים ביצירת פיגום רב-פולימרי המאפשרת טריקה של שני פולימרים שונים לתוך אותה רשת, מה שמאפשר כוונון של המכניקה והפירוק של הפיגום והתאמה של הנקבוביות עבור חדירת תאים.שלום, אני ג'יימי קובי מהמעבדה של ג'ייסון בורדיק במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת פנסילבניה. שלום, אני הריני סווין, גם אני ממעבדת בורדיק. היום נראה לכם הליך ליצירת פיגומים סיביים בשיטת אלקטרו-ספינינג להנדסת רקמות.נציג גם את יכולות העיבוד הנוספות של דפוס תמונה (photo patterning) ויצירת פיגומים רב-פולימריים. אנו משתמשים בהליכים אלו במעבדתנו כדי לחקור אינטראקציות וחדירות של תאי HMSE בפיגומים של חומצה היאלורונית. כמו כן, אנו משתמשים בטכניקות אלו עם פולימרים שונים אחרים כדי לחקור רקמות מחוזקות בסיבים, כגון המניסקוס והשריר הלבבי (myocardium).בואו נתחיל. הכינו תמיסה של 0.5% weight של הפוטו-איניצ'יטור. אני ממיס Irgacure 2959 או I 29 5 9 במים דה-יוניזציה על ידי המסה בטמפרטורה של 37 °C למשך מספר ימים.משתמשים ב-I cure כאשר נדרש פולימר פוטוריאקטיבי עבור אלקטרו-ספינינג (electro spinning). כדי להכין את תמיסת האלקטרו-ספינינג, מערבבים במים דאיוניים עד לריכוזים סופיים של 2%weight methylated hyaluronic acid או MEHA, 3%weight polyethylene oxide או PEO ו-0.05%weight תמיסת I 2 9 5 9, מערבבים ב-vortex למשך חמש דקות ומדגירים ב-37 °C למשך לילה.בשלב הבא, השתמשו במזרק חשמלי (syringe pump) והגדירו אותו להזרקה בקצב של 1.2 milliliters per hour. הכניסו את מחט מנוע המזרק אל המזרק החשמלי. חברו את המוליך המוארק של מקור מתח גבוה למערכת האיסוף.בנוהל זה, נשתמש במנדרל המסתובב במהירות של כ-10 meters per second. כדי לאסוף סיבים מיושרים, חברו את המוליך בעל המטען החיובי למחט, וכוונו את המחט או את התקן האיסוף כך שיהיה ביניהם מרחק של 15 centimeter. הפעילו את זרימת משאבת המזרק, וכאשר ניתן להבחין בנוזל בקצה המחט, הפעילו את מקור המתח וכווננו את המתח ל-22 kilovolts.אספו את הסיבים על הפיגום עד להשגת העובי הרצוי. זמן האיסוף תלוי בעובי המבוקש ובנפח תמיסת האלקטרו-ספינינג שנעשה בה שימוש. עבור תבניות פוטו-גרפיות, אנו משתמשים במצעים שעברו אלקטרו-ספינינג במשך 16 שעות.הסיר את הפיגום ממכשיר האיסוף לאחר השלמת האיסוף ואחסן אותו בוואקום למשך לילה להסרה מלאה של הממס. גזור מדגימות של חמישה מילימטר על חמישה מילימטר ממעטון הפיגום בעזרת מספריים. הנח כל פיגום על שקופית זכוכית מכוסה בנייר אלומיניום כדי להכינו לקשירה צולבת, והנח את מסכת הפוטו ישירות על הפיגום תוך כיסיו בשקופית זכוכית נקייה וקיבוע שני קצות השקופית בעזרת תפסים.באמצעות תא חנקן, יש לבצע פירגינג (purge) למסבך כדי למנוע הפחתה של קשירת הצלבה עקב חשיפה לחמצן. הנח את מערך המסבך בתוך תא החנקן תחת אור באורך גל של 365 ננומטר בעוצמה של כ-10 מיליוואט לסמ"ר עם מתאם קולטינג למשך חמש דקות. הוצא כל מסבך והנח אותו בתוך פלטת תרבית רקמות של 12 בארות.הוסיפו שני מיליליטרים של מים דאיוניים לכל באר. כסו את הפלטה כדי למנוע התאיידות של המים והניחו אותה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות. החליפו את המים בכל שמונה שעות, תוך שימוש בפיפטה ואקום לשאיבת המים הדאיוניים מהבאר בין השטיפות.הכינו תמיסה של 5% weight של PEO ב-90% ethanol על פלטה מחממת. ערבבו במהירות של 700 RPM בטמפרטורה של 50 degrees Celsius למשך שעתיים לפחות לפני התהליך. לאחר הערבוב, הוסיפו DPI לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter.העבירו את תמיסת ה-PEO וה-DPI למזרק של שלושה מיליליטרים ועטפו אותו בנייר אלומיניום להגנה מאור. לאחר מכן, הכינו את תמיסת האלקטרו-ספינינג המתוארת בחלק השני והוסיפו methoxy ethyl biocarbon mole rod domine B לריכוז סופי של 25 micromolar באמצעות מיקרו-פיפט למזרק של שלושה מיליליטרים. עטפו בנייר אלומיניום להגנה מאור.השתמשו בזהירות בסרט דביק כדי להצמיד את קצוותיהן של זכוכית כיסוי מתילתית בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר לפני השטח של המנדריל, כך שזכוכית הכיסוי תתאים להיקף המנדריל. בעזרת קטע צינור סיליקון באורך חמישה מילימטרים, חברו קצה אחד לאחת המזרקים בעלי חיבורי lure lock. חברו את הקצה השני למחט, הכניסו את המזרק למשאבת המזרקים והעבירו את המחט דרך החור במאוורר.המפזרים (fanners) חוצים את אורך המנדרל ומשמשים להבטחת פיזור שווה של שני הפולימרים בפיגום המתקבל. ודאו שקצוות המחטים ממרכזים על המנדרל עבור המזרק המכיל MEHA. מקמו את קצה המחט במרחק של 15 סנטימטרים מהמנדרל והגדירו את המפזר למרחק של שישה סנטימטרים מקצה המחט.תכנת את משאבת המזריקה לספק 1.2 milliliters לשעה והגדר את מקור המתח ל-22 kilovolts. הכן את המזרק עם PEO בדיוק באותה הצורה, אך מקם את קצה המחט במרחק של 10 centimeters מהמנדרל והגדר את מקור המתח ל-15 kilovolts. לאחר מכן, כבה את האורות והפעל את המנדרל ואת משאבות המזרקות.הסירו את רדיד האלומיניום מהמזרקים כאשר נוזל נראה בקצות שתי המחטים. הפעילו בו-זמנית את ספקי הכוח וחברו את המאווררים כאשר האיסוף הושלם. כבו את ספקי הכוח ואת המנדרל ונתקו את המאווררים בזהירות.הסירו את זכוכיות הכיסוי ואת הסרט הדביק באמצעות להב תער. ניתן להדמיות את הסיבים במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור rumine ו-dpi. הניחו כל זכוכית כיסוי עליה מודבק פולימר electro spon לתוך באר נפרדת של פלטת שש.דplate של בארות דגירה של הפיגומים ב-2 milliliters של PBS למשך לילה כדי להבטיח הסרה מלאה של הממס ומזהמים. לאחר 24 שעות, השתמש בוואקום כדי לשאוב את ה-PBS מלוח הבארות והנח את הפיגומים תחת מנורת UV קוטלת חיידקים במנדף זרימה למינרית למשך 30 דקות. לצורך עיקר, בצע תרבית תאים סטנדרטית והכן תרחיף תאים מרוכז בצפיפות התאים הרצויה.לדוגמה, השתמשו ב-100 milliliters של תרחיף תאים עבור ליתקת של 22 על 22 millimeter. הניחו באינקובטור למשך שעה אחת. הוסיפו לכל אחד את הכמות המתאימה של מצע גידול תאים.החזירו את הפיגומים למדגרה. צבעו את התאים באמצעות ערכה מסחרית לצביעת תאים חיים ומתים (live dead kit) מבית Invitrogen כדי להדמיות של התאים והסיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במסננים עבור trissy ו-fitzy. כמצופה, פיגומים שנאספו על גבי פלטה שטוחה ומוארקת יציגו סיבים המפוזרים באופן אקראי, בעוד שפיגומים שנאספו על גבי מנדריל מסתובב יציגו סיבים מסודרים.היווצרו סיבים מיושרים כפי שנראה במיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת; במהלך קשירה צולבת פוטוכימית של הפיגום, הנחנו מסכה פוטווגית בין הפיגום למקור האור לאחר טבילת הפיגום במים דאיוניים ו-ha שאינו פעיל. אזורים אלו נחסמו מהאור ו-PEO הוסר, ואנו רואים היווצרויות של מקרו-נקבוביות כפי שעולה מהצבע הפלואורסצנטי. אלקטרו-ספינינג סימולטני של נתיקי MEHA ו-PEO גורם לפיגום מרוכב המכיל אוכלוסיות סיבים מובחנות המורכבות מהפולימרים האינדיבידואליים.נראה כי תאי השריר החלקים (HMCs) מגיבים באופן חיובי לסיבים. לא רק שהם נותרים חיוניים, כפי שמעיד הצביע הירוק, אלא נראה כי הם מכוונים את עצמם כך שיהיו מיושרים לאורך הסיבים האדומים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע אלקטרו-ספינינג (electro spin) של פיגומים סיביים להנדסת רקמות.הצגנו גם יכולות נוספות כגון תבנית פוטו-כימית (photo patterning) ואלקטרו-ספינינג של פולימרים מרובים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע אופטימיזציה של פרמטרי האלקטרו-ספינינג של כל פולימר כדי ליצור סיבים אחידים בטרם ניסיון לבצע ניסויים נוספים. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

electrospinning-fibrous-polymer-scaffolds-for-tissue-engineering-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מזדהות סיבים electrospun ישיר על גדילה של נוירונים במבחנה הם מרכיב הפוטנציאל של פיגומים התחדשות עצבים. אנו מתארים את הליך הכנת מצעים electrospun סיבים ותרבות חופשית בסרום של חושי העיקרי עכברוש E15 (DRG) ו הנוירונים המנוע. ויזואליזציה של נוירונים ידי immunocytochemistry כלולה גם.

תרבות מוטור ראשיים עצב סנסורי בתקשורת מוגדר על electrospun פולי-L-lactide nanofiber פיגומים

פיגומים Electrospun יכול להיות מעובד הייצור עבור יישומים הנדסת רקמות. כאן אנו מתארים שיטות ספינינג פיגומים מורכבים (על ידי ספינינג רצופים), להכנת פיגומים עבים יותר (על ידי שכבות רב באמצעות אדי חום או חישול), להשגת עקרות (ייצור מזוהם או פירסום הייצור עיקור) ו להשגת תכונות ביומכניים המתאימים.

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

פרוטוקול זה משלב אלקטרו-ספינינג ומיקרוספירות כדי לפתח פיגומים מהונדסי רקמות להכוונת נוירונים. גורם הגדילה העצבי היה עטוף בתוך מיקרוספירות PLGA והוכנס לפיגומים סיביים של חומצה היאלורונית (HA).  הפעילות הביולוגית של החלבון נבדקה על ידי זריעת הפיגומים עם גרעיני שורש הגב של אפרוח ראשוני ותרבית במשך 4-6 ימים.

גורם הגדילה Electrospinning שחרור מיקרוסכמות לתוך סיביים פיגומים

סינתזה וייצור של סיבי electrospun ארוכים המשתרעים על שטח גדול יותר הפקדה באמצעות אספן חדש תוכנן מפולימר מתכלה רומן בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) דווחה. הסיבים היו מסוגלים לתמוך בצמיחה של תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent עכבר.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק פיגומי nanofiber electrospun עם ארגון מדורג של סיבים ולחקור את היישומים שלהם בויסות מורפולוגיה תא / אורינטציה. הדרגתיים בכל קשורים לתכונות פיסיקליות וכימיות של פיגומי nanofiber מציע מגוון רחב של יישומים בתחום ביו-רפואיים.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

ההתקדמות בטכנולוגיות ביו-חומרים מאפשרת פיתוח מבנים תלת מימדיים מרובי תאים. פיתחנו פרוטוקולי אלקטרו-ספינינג לייצור שלושה פיגומים בודדים לתרבית התאים המבניים העיקריים של דרכי הנשימה כדי לספק מודל תלת מימדי במבחנה של דופן הסימפונות של דרכי הנשימה.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

פרוטוקול זה משמש כקו מנחה מקיף כדי לבדות פיגומים ויה electrospinning עם הפולימר נמס במצב כתיבה ישירה. אנו באופן שיטתי המתווה את התהליך, להגדיר את הגדרות הפרמטר המתאים להשגת ארכיטקטורות יישוב לגרדום.

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

מאמר זה מדגים את הטכניקה של הרחבת שטיחון nanofiber המסורתי, נמצא תחת ניהול דו-מימד (2D) electrospun לתוך גרדום (3D) 3-מימד דרך ירידת נוזלים2 CO subcritical. פיגומים אלו רבודה תלת-ממד, רמזים nanotopographic הסלולר מחקים מקרוב, לשמר את הפונקציות של מולקולות וחיסונים אנקפסולציה בתוך nanofibers.

ההתרחבות של דו-מימד Electrospun Nanofiber מחצלות שלוש-מימד פיגומים

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

למדו את שיטת האלקטרוספינינג ליצירת פיגומים סיביים מפולימרים פוטוריאקטיביים עבור הנדסת רקמות. השיטה מאפשרת עיצוב תבניות פוטוגרפיות ופיגומי רב-פולימרים לשיפור חדירות תאים והתפלגות רקמות.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

גלה סרטונים נוספים