Name: בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-01T14:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: למדו שיטה לבידוד נוירונים היקפיים מתסיסנית באמצעות מיון מגנטי עם חרוזים מצופים נוגדנים. הטכניקה מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של אוכלוסיות נוירונים טהורות ליישומי מחקר מולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ו-Office ג&#39;ורג&#39; מייסון האוניברסיטה מכללה (EPRI).

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

הפרוטוקול המובא כאן הוא אופטימיזציה עבור בידוד וטיהור של נוירונים הפריפריה אשר להיצמד בחוזקה לפני השטח הפנימי של לציפורן third תסיסנית הזחל instar באמצעות מיון מגנטי חרוז אסטרטגיה התא. אמנם יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה במיוחד כדי לבודד תסיסנית נוירונים דה, יישומים של פרוטוקול זה לבידודה של סוגי תאים אחרים לדבוק לציפורן של הזחל גלמי או בשלבים של פיתוח (למשל epithelia, שריר, עצב היקפיים אחרים) ניתן להתאים על ידי משתנים כמה פרמטרים ושימוש GAL4 ברורים, כטב&quot;מ-mCD8-GFP trans...

ציוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (10) לחסום מגנטים נאודימיום (K &amp; J מגנטיות, Inc, חתול. # B444B), לחילופין DynaMag ™ -2 (Invitrogen, חתול. # 123-21D) עשוי לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות Kontes מלתעה זכוכית, 2 מ&quot;ל כושר עבודה, עם העלי סיקול גדולה (קט # 885300-0002) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מסננים, למשל MACS טרום ההפרדה סינון (Miltenyi BIOTEC, חתול. # 130-041-407) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 מ&quot;מ צלחות פטרי, מצופה Sylgard (Dow Corning Corporation, חתול. # 3097358-1004) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים לנתח: שני זוגות של דומון מס &#39;5 מלקחיים (כלים מדע טוב, חתול # 11251-20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vannas באביב מיקרו לנתיחה מספריים (כלים מדע טוב, חתול. # 15000-08) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes (P-1000, P-100, P-10) עם טיפים חד פעמיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemocytometer רגילה לספור את התאים טוהר אומדן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes פסטר עם טיפים אש מלוטשת בקוטר סטנדרטי, צמצמה ל 50% ~ בקוטר סטנדרטי צמצמה ל 25% ~ בקוטר סטנדרטי טחינה דקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוח צנטריפוגות מיקרו העליון (1-16,000 (x) ז) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלורסנט סטריאו מיקרוסקופ (א MZ16FA לייקה נעשה שימוש בפרוטוקול זה) </li></ul>

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

<em&gt; תסיסנית</em&gt; מערכת העצבים ההיקפית (PNS) הוא מודל רב עוצמה עבור חוקרת את התהליכים המורכבים של פיתוח עצב המורפוגנזה דנדריט ברמות פונקציונלי מולקולרית. כדי לסייע בניתוחים אלה, פיתחנו אסטרטגיה לבידודה של subclass של נוירונים PNS נקרא arborization הדנדריטים (דה) נוירונים היה בשימוש נרחב לחקר המורפוגנזה דנדריט<sup&gt; 1,2</sup&gt;. נוירונים אלה קשה מאוד לבודד כאוכלוסייה טהור, בין השאר כתוצאה המופע שלהם נמוך ביותר שלהם, קשה להשגה מיקום מתחת לציפורן קשה הזחל כיטיניות. השיטה החדשה שפותחה שלנו מתגבר על אתגרים אלה, והיא מבוססת על העשרת תא מהיר באמצעות נוגדן ספציפי מצופה חרוזים מגנטיים. עבור מחקרים מגנטי שלנו מיון חרוז, השתמשנו בגיל בהתאמה third הזחלים instar להביע עכבר CD8 מתויג היתוך חלבון ה-GFP (<em&gt; כטב&quot;מ-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; תחת שליטה של ​​אחת arborization הדנדריטי בכיתה IV (דה) נוירון ספציפי<em&gt; כייס (פ.פ.ק.)-GAL4</em&gt; הנהג<sup&gt; 4</sup&gt; או את השליטה GAL4 נוירון ספציפי פאן דה<sup&gt; 21-7</sup&gt; הנהג<sup&gt; 5</sup&gt;. אמנם זה פרוטוקול כבר מותאם לבידוד PNS תאים אשר מחוברים לקיר הפנימי של לציפורן הזחל, על ידי שינוי כמה פרמטרים, פרוטוקול אותו יכול לשמש כדי לבודד הרבה סוגי תאים שונים המחוברים לציפורן בשלבי הזחל או גלמי של פיתוח (למשל epithelia, שרירים, oenocytes וכו &#39;), או סוגי תאים אחרים מאיברים הזחל תלוי דפוס GAL4 ספציפיים ביטוי הנהג. RNA בודד בשיטה זו היא באיכות גבוהה והוא יכול לשמש בקלות עבור ניתוחים גנומית במורד כגון הביטוי microarray מחקרים פרופיל גנטי. גישה זו מציעה כלי חדש רב עוצמה לבצע מחקרים על מבודד<em&gt; תסיסנית</em&gt; הדנדריטים (דה) arborization נוירונים ובכך לספק תובנות הרומן לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס המורפוגנזה דנדריט.

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור של<em&gt; תסיסנית</em&gt; הנוירונים ההיקפיים באמצעות מיון מהיר מגנטי חרוז בסיוע אסטרטגיה התא. RNA המתקבלים בתאים מבודדים יכול לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל ניתוחים microarray.

מערכת העצבים ההיקפית (PNS) של ה-Drosophila היא מודל רב-עוצמה לחקירת התהליכים המורכבים של התפתחות נוירונים ודנדריטים...

זחלי דרוזופילה הנושאים טרנסגן של דוחף (Reporter) GFP המחובר ל-CD8 הספציפי לנוירונים משמשים לבידוד נוירוני DA. הזחלים מנותחים על ידי הפיכת הקוטיקולה שלהם כלפי חוץ, ובכך נחשף מערכת העצבים ההיקפית. הזחלים ההפוכים עוברים דיסוציאציה אנזימטית, ולאחריה דיסוציאציה מכנית באמצעות שקישוף (vortexing), ערבוב ושקיעה.לאחר מכן מסננים את התאים כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים המכיל בעיקר שריר אפיתליאלי ונוירונים. חרוזי מגנט מצופים בנוגדנים מתווספים לתרחיף התאים, שם הם נקשרים לנוירונים המבטאים את חלבון היתוך ה-GFP המסומן ב-CD8. לבסוף, מבודדים את הנוירונים המצופים בחרוזי מגנט על ידי הנחת התמיסה בשדה מגנטי חזק, מה שמעניק אוכלוסיות נוירונים מטוהרות מאוד.שלום, אני דן קוקס מהמחלקה למיקרוביולוגיה ומולקולרית במכון קראסנו למחקר מתקדם באוניברסיטת ג'ורג' מייסון. שלום, אני איש AER מהמעבדה של ד"ר דן קוקס. היום נראה לכם פרוצדורה לבידוד וניקוי של נוירונים פריפריאליים של DLO באמצעות מיון בחרוזי מגנט.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים מורפוגנזה ספציפית למחלקה וימינה. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בנוהל זה, בחרו 30 עד 50 זחלי כוכב בשלב השלישי ובגיל תואם, והניחו אותם באבוב מיקרו-צנטריפוגה של 1.6 milliliter המכיל 1 עד 1.2 milliliter של 1X PBS.סגרו את המבחנה וערבבו אותה במכשיר וורטקס (vortex) בהגדרה המקסימלית שלוש פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם. בעזרת פסטורת פיפט מלוטשת באש, השליכו את העלייה (supernatant) לחלוטין. הוסיפו 1 mL של PBS וחזרו על שלבי השטיפה והערבוב בוורטקס שלוש פעמים, עד שהעלייה תהיה נקייה באופן נראה מחלקיקי מזון ומשאריות.חזרו בקצרה על השטיפה עם 1 mL של ethanol בריכוז 70%. לאחר מכן, שטפו את הזחלים פעמיים עם 1 mL של מים מזוקקים פעמיים. ולבסוף, חזרו על השטיפה פעם נוספת עם 1 mL של RNase Away ושלוש פעמים ב-1 mL של מים מזוקקים פעמיים להסרה מלאה של ה-RNase Away; הזחלים מוכנים כעת לדיסקציה.מקמו 10 עד 12 זחלים במרכזה של צלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר מצופה בשכבת מגן (sill guard). מקמו אותם במרחק קל זה מזה והסירו כל זחל שנראה כי אינו נמצא בשלב ההתפתחות המתאים. לאחר מכן, השתמשו במספרי דיסקציה עדינים כדי לחתוך את הקצה הקדמי של הזחלים באמצעות פינצטה Dumont קהה.מספר חמישה, פינצטה. הפכו את הזחלים מהפוכים. התחילו בהחדרת פינצטה אחת לתוך הקוטיקולה של הזחל עד לקצה האחורי.לחצו את קצות הפינצטה יחדיו כדי לתפוס את הקצה האחורי של הקוטיקולה. לחיצה של הקוטיקולה כלפי מטה על פני השטח של ה-syl guard מקלה על הפעולה. באמצעות זוג הפינצטות השני, דחפו את קוטיקולת הזחליל כך שתהפוך החוצה.ודאו שהזחלים הפוכים לחלוטין, כך שכל הרקמות הרכות חשופות לתמיסה לצורך דיסוציאציה קלה. התאמנו על פעולה זו מספר פעמים לפני שתנסו לבצע את דיסוציאציית התאים. לאחר הדיסקציה של שלושה עד ארבעה זחלים, העבירו אותם מיד ל-PBS קר במיוחד על קרח בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה.חזור על הפעולה עד לאיסוף של 30 עד 40 זחלים הנדרשים, לפני המעבר להסרה של תאים שאינם ספציפיים. יש לקחת בחשבון כי צפוי אובדן של 10% עד 20% במהלך הניתוח וההסחקה, כעת לאחר שכל הזחלים נותחו. הסר רקמות שאינן ספציפיות ההיצמדות אליהן היא רפויה, כגון גופי שומן ותאי מערכת העצבים המרכזית.החלף את הנוזל במבחנה המכילה את קשריות העור של הפקעות ההפוכות ב-700 עד 800 µL של PBS קר מהמקרר. לבסוף, בצע ערבוב בפולסים: השתמש ב-Vortex על מבחנת המיקרוצנטריפוגה חמש פעמים למשך שלוש שניות לכל פולס במהירות מרבית.לאחר מכן השליכו את supernatant והחליפו אותו בכ-700 עד 800 microliters של PBS קר וטרי. חזרו על שלב זה שלוש פעמים, ובסופו השביו את ה-cuticles של הזחלים ב-400 microliters של PBS קר וטרי.השתמשו ב-PBS קר לפני המעבר לפירוק התאים לצורך בידוד העץ הדנדריטי או נוירונים של זחלים. השתמשו בשילוב של פירוק אנזימטי ומכני. היזהרו מפירוק יתר, שעלול לגרום לאובדן של סמני פני השטח של התא, מה שיוביל לתשואת תאים נמוכה ולחיוניות תאים נמוכה.התחילו את הדיסוציאציה על ידי הוספה של 1.5 µL של liase zyme three בריכוז one x במינון 28 units per vial אל הקוטיקולות של הזחלים המושעות ב-400 µL של PBS. ערבבו את התמיסה ב-Vortex פעמיים עד שלוש פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם בהגדרה המקסימלית, כדי להעביר את התאים שנדבקו באופן רופף מהקוטיקולות אל התמיסה.לאחר מכן, דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. מכיוון שזמן הדגירה משפיע רבות על יעילות מיון התאים הסופית, אין לחרוג מ-15 דקות בסיום פעימת ההדגירה.שקשקו את המבחנה במיקסר Vortex‏ 20 עד 30 פעמים במהירות מקסימלית, למשך שתי שניות בכל פעימה. פעולה זו אמורה לשחרר את השריר ורקמות לא ספציפיות אחרות אל תוך התמיסה. בחנו את הדגימה מעת לעת תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופ עם יכולת פלואורסצנציה כדי לקבוע אם הנוירונים הפריפריים עדיין דבקים לקוטיקולה.בדקו מדגם קטן מהתמיסה על ידי התבוננות במבובת המיקרו-צנטריפוגה ישירות תחת מיקרוסקופ סטריאו בעל יכולת פלואורסצנציה, כדי לקבוע את מידת הדיסוציאציה. המשיכו לבצע זאת בכל שלב של הדיסוציאציה; הפסיקו את השקישוק (vortexing) לפני שנראה כי הנוירונים הפריפריים מנתקים את קשרם מהקוטיקולה ועוברים לתמיסה. שטפו קצר את קוטיקולות הזחלים בשני עד שלושה החלפות של 1 mL כל אחת של PBS טרי וקר בקרח.ולסיום, ביצוע ריסספנסיה (resuspension). השעו אותם ב-500 microliters של PBS טרי וקר במקרר המכיל 1%BSA. כדי להמשיך בפירוק המכני של התאים, השתמשו במטחנת רקמות של שני מיליליטר בתוספת פסטל בעל מרווח גדול עם תמיסת 1%BSA ב-PBS. לאחר שטיפה קצרה, השליכו את תמיסת ה-BSA.פעולה זו תמנע מהקוטיקולות של הזחלים להידבק למשטחי הזכוכית. לאחר מכן, קררו מראש את דוחק הרקמות והפסטל על ידי הנחתם על קרח למשך מספר דקות, כדי למנוע נזק לתאים או ליזיס. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה בעלת קצה מלוט (fire polished) כדי להעביר את הקוטיקולות לדוחק הרקמות.כעת, פייסו את הרקמה בתנועות איטיות ועקביות, תוך הימנעות מהיווצרות קצף, למשך כ-20 עד 30 תנועות. ודאו שהפיסוס נעשה באיטיות ובעקביות. אחרת, התאים עלולים להישבץ.כדי להעריך את רמות הדיסוציאציה של התאים, נגבו את דופן טחון הרקמות במטלית Kim wipe נקייה ובחנו תחת מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי. הנוירונים אמורים להיות מנותקים מהקוטיקולה וניתן לראותם בתמיסה. אינדיקציה טובה לדיסוציאציה של התאים היא היעדר נוירונים מהקוטיקולה של הלרווה.עם זאת, אם עדיין נצפים נוירונים adhered לקוטיקולה או אם נצפים תאים בתוך גושים בתאים שאינם מופרדים לחלוטין, יש להמשיך בתהליך ההפרדה עד להשגת סספנזיה של תאים בודדים. המשיכו את הדיסוציאציה המכנית באמצעות פסטור-פיפט (pastuer pipette) שעבר חישול באש. צמצמו את הקצה לכ-50% מקוטר הטיפ הסטנדרטי, העבירו את התמיסה על פניו חמש פעמים, ולאחר מכן עשר פעמים עם פסטור-פיפט שעבר חישול באש.צר את הקצה לכ-25% מקוטר התיי הסטנדרטי. שים לב כי סיבוב בכוח עלול לפגוע בתאים. עקוב אחר התאים בין השלבים והתאם את הפרוצדורה בהתאם.סיימו על ידי סינון התמיסה דרך מסנן תאים של 30 micrometer ואספו את תסנין התאים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.6 milliliter. התמיסה שמתקבלת צריכה להיות תרחיף תאים בודדים והיא מוכנה כעת למיון תאים מגנטי. חרוזי מגנט מצופים בנוגדן anti CD eight.הוכנו כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ותאי ה-DA neurons מבטאים חלבון איחוד של CD8 GFP המהווה מטרה לנוגדן. התחילו את מיון התאים על ידי הוספת 15 µL של חרוזי מגנט מצופים בנוגדן ל-500 µL של תרחיף תאים. דגרו את התאים עם החרוזים המגנטיים המצופים בנוגדן למשך 30 עד 60 דקות על קרח, תוך ערבוב ידני מדי פעם; דגירה בטמפרטורה גבוהה יותר או למשך זמן ממושך יותר עלולה להוביל לקשירה לא ספציפית של הנוגדן.לאחר מכן, הניחו את המיקרו-פיובית (micro huge tube) בשדה מגנטי חזק למשך שתי דקות. כל התאים שנבחרו באופן חיובי, יחד עם חרוזיים שאינם קשורים, יידבקו לדופן הפיובית; שאבו באיטיות את הנוזל העליון (supernatant), מבלי להפריע למשקע התאים, ושטפו את התאים שלוש עד ארבע פעמים ב-PBS קר במצב קרח. שלב זה מסיר תאים שאינם ספציפיים שנותרו.לבסוף, השעו שוב את התאים ב-30 microliters של PBS טרי וקר בקרח, כדי להעריך את רמת הטוהר ואת תנובת התאים. העבירו בעזרת פפטה 5 microliters מתחילת תמיס התאים אל פניו המלוטשות של המוסימטר (hemo cytometer) וספרו את כל התאים הפלואורסצנטיים הנראים תחת מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי. כמו כן, בדקו את כמות התאים שאינם פלואורסצנטיים ואת כל הסימנים לזיהומים או שאיריות.בדרך כלל, הדגימה תהיה מועשרת מאוד בתאים פלואורסצנטיים. לבסוף, השתמש בערכה pico pure RNA isolation כדי לבודד RNA מהתאים הקשורים לחרוזי הפלסטיקה. הוסף את תמיסת המיצוי לתאים הממוינים, אך הסר את החרוזים באמצעות מגנט לפני שלב הטיהור בעמודה; השתמש ב-1 µL של ה-RNA שמוצא כדי להעריך את איכות ה-RNA הכולל באמצעות Agilent Bioanalyzer 2100.ה-RNA שבודד מנוירוני ה-DA המבודדים הוא באיכות מצוינת, כפי שמעידה הנוכחות של שיאי rRNA חדים של 5.8 s ו-28 s בניתוח באמצעות Agilent 2100 Bioanalyzer. החל מהשלבים ה-30 עד ה-43 בעבורים של star, הצלחנו לבודד בממוצע 300 עד 500 נוירוני DA מסוג class four באמצעות הדרייבר PPK gal four, ו-1500 עד 2000 נוירוני DA מהסוגים classes 1, 2, 3 ו-4. שימוש בדרייבר panda neuron specific gal four בבדיקת quantitative R-T-P-C-R עם L 11 fch, המהווים סממנים ספציפיים לנוירונים, חשף העשרה משמעותית של שניהם, מה שמעיד על העשרה ספציפית מאוד לנוירוני DA באמצעות הפרוטוקול שהצגנו בהשוואה ל-flow through. לבסוף, ה-RNA המבודד הן מנוירוני panda והן מנוירוני class four DA שימש לביצוע פרופיל ביטוי תעתוקי (transcriptional expression profiling) על גבי Agilent Drosophila Melanogaster whole genome oligo microarrays, אשר זיהה גורמים רבים המעורבים במורפוגנזה של נוירוני da.הראינו כיצד לבודד ולטהר נוירונים פריפריאליים של drosohpila באמצעות מיון בחרוש חרוזיים מגנטיים משלב הגולם השלישי של ההתפתחות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לאזן בין שלבי הדיסוציאציה האנזימטית והמכנית. דיסוציאציה אנזימטית מופרזת עלולה להוביל לדגרדציה של סממני פני השטח של התא CD8, מה שיוביל למיון תאים לא יעיל או כשלון של המיון.חשוב גם לשמור על תנאים נקיים מ-RNA לאורך כל הפרוצדורה, וזאת כדי לשמר את שלמות ה-RNA המופק מהנוירונים שבודדו. זהו, תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

isolation-purification-drosophila-peripheral-neurons-magnetic-bead

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או...

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin...

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי אוליגודנדרוציטים ראשוניים מתרחיף תא עצבי המתקבל מגור עכבר באמצעות הפרדה מגנטית. הטכניקה עושה שימוש בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים ספציפיים לאנטיגנים אוליגודנדרוציטים, המאפשרים בידוד סלקטיבי של תאים אלה.

בידוד אוליגודנדרוציטים ראשוניים באמצעות חרוזים אימונומגנטיים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

רקמות דרוזופילה בדרך כלל מכילות תערובת הטרוגנית של סוגי תאים. כדי לבחון ביטוי גנים בסוגי תאים מסוימים מרקמה מסוימת, גרעינים יכולים להיות מתויגים גנטי ולאחר מכן מבודד באמצעות גישה המבוססת על זיקה. גרעינים בודדים יכולים לשמש עבור יישומים במורד כגון ניתוח ביטוי גנים וimmunoprecipitation הכרומטין.

בידוד מבוסס זיקה של תייג גרעינים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות לניתוח ביטוי גנים

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

קשה לזהות נוירונים חושיים ספציפיים לאיברים. מעקב כחול מהיר משמש לזיהוי נוירונים נומינוסים המעצבבים את דרכי הנשימה למיון תאים. נוירונים ממוינים משמשים למיצוי חומצה ריבונוקלאית (RNA) באיכות גבוהה לריצוף. באמצעות פרוטוקול זה, נקבע ביטוי גנים של נוירונים ספציפיים לדרכי הנשימה.

שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

כאן, אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה תא לבידוד ביעילות תאים נוכח שפע נמוך בתוך מערכת הראייה דרוזופילה דרך התא פלורסצנטיות מופעל מיון (FACS).

טיהור של התאים נמוך-שפע ב מערכת הראייה דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

למדו שיטה לבידוד נוירונים היקפיים מתסיסנית באמצעות מיון מגנטי עם חרוזים מצופים נוגדנים. הטכניקה מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של אוכלוסיות נוירונים טהורות ליישומי מחקר מולקולריים.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

גלה סרטונים נוספים