Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר
25 בפברואר 2007
בידוד של postimplantation בשלב עוברי מאפשר ללמוד דפוסים גן ולנתח התא השושלת תהליכי קבלת ההחלטות במהלך ההתפתחות העוברית, אבל לנתיחה תקין של העובר מוקדם יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מוקדם פס פרימיטיבי, בשלב עוברי (~ 6.5 ימים הודעה coitum [DPC]).
שמי קלי שי ואני מנהלת המעבדה וכן טכנאית מחקר במעבדתו של נילסן. זה קשה מאוד מכיוון שרבים אינם יודעים כיצד להבחין בין שכבות הרקמה השונות. לכן, מה שעליכם לעשות הוא למעשה לקלף את כל שכבות הרקמה כדי לחשוף את העובר שמתחתיהן, שבשלב זה אינו בעל כלי דם רבים. לכן הוא שקוף מאוד וקשה להבחין בו.
השתמשו בפינצטה ובמספריים בעלי קצוות קהים. הפעולה הראשונה שעליכם לבצע היא לתפוס את החיה בקו האמצע ולבצע חתך ראשוני. לאחר מכן, ניתן פשוט להפריד את העור, ובכך לחשוף את בטנה של החיה.
ישנה שכבה דקה של הפריטוניאום שאתם תמשכו למעלה בעזרת הפינצטה, ולאחר מכן תוכלו לחתוך אותה במספריים ולהסיטה הצידה. עליכם לחתוך לאורך קו האמצע של בעל החיים ולהפריד את שתי קרני הרחם, המחוברות במרכזן. ניתן לחתוך ממש בבסיס.
סביר להניח שתקבלו כמות גדולה של שומן יחד עם הרקמה. קחו את קרן הרחם השלמה של בעל החיים. הניחו אותה ישירות לתוך ה-PBS.
כך זה נראה בתוך הקרן. אלו הם אתרי ההשתלה, 1, 2, 3, 4, 5. מה שיש לעשות הוא פשוט להפריד ביניהם.
ניתן לחתוך בין אתרי ההשתלה ממש כאן. ניתן פשוט לתפוס את העובר מצדו ולהפריד אותו. בשלב זה, אתם חושפים את ה-deum, שהוא רקמה ספוגית יותר שנמצאת מתחת.
לכן העובר צריך להיות בדיוק במרכז, ממש כאן. זהו השפיץ של ה-deciduous. יש להכווין אותו כך שהשפיץ פונה כלפי מעלה.
בסופו של דבר, גזרו כחמישית מהמרחק מהקודקוד כלפי מטה. העובר אמור להימצא בדיוק במרכז, ממש כאן. מה שאני עושה הוא להכווין אותו הצידה, להשתמש בזוג פינצטות אחד כדי לתפוס אותו, להחזיקו כלפי מטה עם הזוג השני, לחתוך את הקצה שלו, ולאחר מכן להפרידו.
לאחר הסרת הפקק, הצמידו את העובר על צדו. וכפי שניתן לראות, ישנו פתח בדיוק במקום שבו הוסר הפקק. כעת יש להחדיר את הפינצטה פנימה. כן.
בשלב זה, העובר מונח באופן רפוי מאוד בתוך ה-deum. ברגע שתסגרו את ה-deum, תוכלו להוציאו החוצה בקלות יחסית, כל עוד תגיעו אל מתחת לבסיסו. הוא קטן מאוד.
ישנם גם רקמות שעדיין מחוברות לעובר. ישנו קונוס אקטו-פלצנטלי (ecto placental cone), שנמצא כאן, בשיאו של העובר. כמו כן, ישנן רקמות נוספות שעדיין מחוברות.
כעת אני פשוט לוקח את הפ pipette ושואב אותו פנימה. בשלב זה, יש לקבע את העוברים. לכן, הכנתי צלחית עם PFA.
בחננו גנים מועמדים. באופן בסיסי, אנו משתמשים בטכניקות של RNA whole mount in situ כדי להמחיש את ייצור חומצות הגרעין בתוך עובר. הגנים הספציפיים שבהם אנו מעוניינים מקודדים לסמנים משוערים של תאי קדם-נבט, וכן הם צפויים להתבטא בעובר עכבר בנקודת זמן ספציפית המסייעת לתאי הנבט להתפתח ולהבשיל מתאי קדם-נבט משוערים לתאי נבט.
גורם אחד שמעניין אותנו מאוד, והגורם הראשון עבורו ביצענו למעשה צביעה בשיטת whole mount in situ בעוברים אלו ביום 6.5, הוא החלבון המורפוגני של העצם BMP four. זהו חבר ממשפחת-העל TGF-beta. הוא חשוב מאוד ונחוץ באופן מוחלט להבשלת תאי הנבט.
בנוסף, תאי הנבט נדרשים לעבור התמקום ברחביו של העובר ולהימצא בקרבת הפס הפרימיטיבי (primitive streak) של העובר. BMP four ממלא תפקיד קריטי הן באיתות והן בהבשלה שדרושה לתאי הנבט כדי להשתכן בפס הפרימיטיבי. לכן, עליכם, ראשית, לוודא שאתם יודעים מה אתם מחפשים, להכיר את גודלו של המבנה ואת קנה המידה שבו אתם עובדים, וכן לשבת ולתכנן את העבודה בקפידה רבה.
הטכניקה, ובמיוחד סוג מיקרוסקופ הדיסקציה שבו תשתמשו. אחת הקשיים הטכניים היא שהתהליך כרוך במניפולציות רבות ובתנועות ידיים יציבות מאוד, כדי לא לפגוע בעובר. לכן, כדאי להשתמש במיקרוסקופ דיסקציה המאפשר מרחב עבודה רב למניפולציה, וכן לוודא שכל הציוד הדרוש לניסוי מוכן מראש, כדי למזער את מספר המניפולציות הנדרשות במהלך הדיסקציה.
מלבד זאת, אני חושבת שאתה צריך לעשות זאת באיטיות רבה ולקלף את שכבות הרקמה הבודדות לאט מאוד, כדי שתדע עם מה אתה עובד. וודא שאתה יודע היכן ממוקם העובר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד עוברים בשלב מוקדם של הפס פס (primitive-streak, כ-6.5 ימים לאחר ההפריה [dpc]). דיסקציה נכונה של העובר המוקדם עשויה להיות מאתגרת, אך טכניקה זו מאפשרת לחקור תהליכים של דפוס ביטוי גנים וקבלת החלטות של שושלות תאים במהלך ההתפתחות העוברית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- התפתחות עוברית
- דפוס ביטוי גנים
- החלטות שורש תאי
רקע
- בידוד של עוברים בשלב שלאחר ההשתלה הוא קריטי למחקרי התפתחות.
- טכניקות של דיסקציה (ניתוח) חיוניות כדי להגיע לעובר שבבסיס הרקמה.
- הבנת שכבות הרקמה היא המפתח לבידוד מוצלח.
- עוברים בשלב זה אינם מכילים כלי דם, מה שהופך את הוויזואליזציה שלהם למאתגרת יותר.
מטרת המחקר
- לספק שיטה אמינה לבידוד עוברים בשלבים מוקדמים.
- להקל על חקר ביטוי גנים במהלך ההתפתחות המוקדמת.
- לשפר טכניקות של דיסקציה עוברית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בפינצטה קהה ובמספריים לצורך נתיחה.
- צביטה של בעל החיים סביב קו האמצע להבדילת הנתיחה.
- קילוף זהיר של שכבות הרקמה כדי לחשוף את העובר.
- בדיקה חזותית של השקיפות לצורך זיהוי העובר.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של עוברים בשלב מוקדם של הפס הפרימיטיבי.
- הבנה משופרת של האתגרים בניתוח עוברים.
- הדגמת טכניקות המשפרות את הוויזואליזציה של מבנים עובריים.
- מתן בסיס למחקרים המשכיים על דפוסי ביטוי של גנים.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע גישה שיטתית לבידוד עוברים.
- הוא מסייע בחקירת ביולוגיה התפתחותית.
- מחקרים עתידיים יכולים להבסס את עצמם על טכניקות אלו כדי להגיע לתובנות מעמיקות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
דיסקציה ובידוד מדויקים של עוברי עכבר ביום 6.5 לביצוע (dpc) מאפשרים ניתוח ברמת ביטחון גבוהה של דפוסי ביטוי גנים במהלך ההתפתחות המוקדמת של יונקים. יכולת זו היא קריטית לתיקוף מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים בביולוגיה התפתחותית ובמסלולי גילוי מוקדמים. גישה מהימנה לרקמה עוברית שלמה תומכת בביטחון ניבוי במחקרי תפקודי גנים ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיקוף של מסלולים התפתחותיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של תפקוד גנים ומסלולי איתות בהקשר עוברי רלוונטי פיזיולוגית.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של תחומי ביטוי גנים ואפיון של שושלת תאים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת גנים מועמדים עבור תוכניות לרפואה התפתחותית ורגנרטיבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק רקמה עוברית שעברה תיקוף עבור היברידיזציה in situ של דגימה שלמה (whole-mount) ובדיקות ביטוי גנים בהמשך התהליך.
- מבטיח שחזור וסטנדרטיזציה של הכנת הדגימות עבור קריאות מולקולריות כמותיות.
- מאפשר הערכה מהימנה של סממני ביטוי גנים הרלוונטיים להבשלת תאי נבט ולדפוס העובר (embryonic patterning).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ניתוח ביטוי גנים מוקדם לבין מסלולים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך ברציפות בין מחקרי תפקוד גנים בשלב הגילוי לבין פיתוח מודלים פרה-קליניים.
- מפחית סיכונים בזיהוי ביומרקרים תרגומיים על ידי אספקת תובנה מכניסטית לגבי תהליכים התפתחותיים מוקדמים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
פרוטוקול נתיחה זה מציב את בידוד הרקמה העוברית בממשק שבין גילוי ראשוני למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשר מעבר חלק מבדיקת השערות לתיקוף תפקודי.
- ביולוגיה של התגליות: מאפשר ניתוח מונחה-השערות של ביטוי גנים ופעילות מסלולים בעוברים בשלבים מוקדמים.
- סריקה: מספק דגימות סטנדרטיות לבדיקות מולקולריות הדירות ולפרופיל ביטוי גנים כמותי.
- אנליטיקה: תומך במדידת דפוסי ביטוי גנים מרחביים וזמניים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מספק נתונים בסיסיים להתאמת תפקודי גנים התפתחותיים עם מודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול בר-שימוש להכנה עקבית של רקמות עובריות לאורך פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בניתוח תפקוד גנים ומסלולים התפתחותיים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של דיסקציה עוברית והכנת דגימות לצורך בדיקות המשך הניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go עבור מטרות בביולוגיה התפתחותית ומפחית עמימות מכניסטית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות גנים ומסלולים התפתחותיים למחקרים נוספים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בדיסקציית עוברי ובזיהוי שכבות רקמה.
- מצריך גישה למיקרוסקופי דיסקציה ולכלי עבודה מדויקים לטיפול בעובריים קטנים ושקופים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדיסקציה והקיבוע לצורך הדירות.
- עשוי לדרוש התאמה לשלבים עובריים שונים או לרקעים גנטיים שונים.
- תכנון והכנה קפדניים חיוניים כדי למזער נזק לרקמה ולמקסם את התוצר.
