Microinjection Intranuclear של דנ"א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים
10 בדצמבר 2009
הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.
בשלב הראשון של הליך הזרקה זה, ריכוז עבודה של תמיסת DNA הוא צנטריפוגה למשקעים. פיפטות הזרקת חומר חלקיקי המיוצרות מצינורות נימי זכוכית סיליקט BO ממולאות לאחר מכן בתמיסת ה-DNA. התאים ממוקמים על במת המיקרוסקופ וההדמיה של גרעין התא אופטימלית.
הפיפטה מיושרת עם הגרעין והתא מוזרק. תאים מרובים מוזרקים לכל מנה למחרת. תאים שהוזרקו בהצלחה מזוהים על ידי ביטוי של גן מדווח.
היי, אני ואן מו מהמעבדה של ד"ר סטיבן אקדה במכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם במכונים הלאומיים לבריאות. אני דמיאן וויליאמס, גם הוא ממעבדת אקדה. ואני יוג'ין מנוהל ממעבדת AKADA.
היום נראה לכם את ההליך להזרקת מיקרו INTERCLEAR של מבני CDNA לתאי עצב מנותקים. זוהי שיטה יעילה לביטוי חלבונים הטרוסקסואליים מעניינים בתאים פוסט-מיטוטיים, שבאופן מסורתי קשה להעביר אותם. אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס אפנון חלבון G של תעלות N.
אז בואו נקבל שיניים כהות. התחל בציפוי נוירונים של יונקים בוגרים מנותקים על צלחות תרבית תאים המצופות ב-0.1 מיליגרם למיליליטר של פולי ליזין במשקל מולקולרי גבוה. זה מסייע להדבקה של נוירונים למשטח התחתון של הכלים.
גלילי שיבוט זכוכית יכולים לשמש לריכוז נוירונים מצופים באזור קטן ומצומצם יותר. כדי למזער את המרחק בין תאי העצב שיש להזריק. הניחו כלים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד שש שעות לפני ביצוע הזרקות מיקרו תוך גרעיניות כדי לאפשר מספיק זמן לתאים להיצמד לתחתית הכלים.
בזמן שהנוירונים דוגרים, מכינים פיפטות מיקרו-הזרקה באמצעות מושך חום בוער של Sutter P 97 וצינורות נימי זכוכית בורו סיליקט דקים בעלי דופן. אנו משתמשים בתוכנית משיכה דו-שלבית עם ההגדרות הבאות עבור משיכה אחת ומשיכה שתיים. מכיוון שההגדרות הנדרשות משתנות עם קבוצות זכוכית שונות ולפי מצב חוט החימום במושך, יש להתאים אותן לפי הצורך.
יש למשוך לפחות חמש פיפטות הזרקה לכל צלחת של נוירונים למקרה שהפיפטות ייפגעו או שיהיו בעיות במהלך ההזרקה. יש לאחסן את פיפטות ההזרקה הנמשכות במיכל מכוסה כדי למנוע כניסת אבק לקצה פיפטת המיקרו-הזרקה מיד לפני הזרקת CDNA פלסמיד מדולל לריכוז העבודה. הניחו חתיכת פרפורם קטנה על משטח העבודה והסירו את גב הנייר.
הוסף את פתרון המניות CD NA ואת מאגר TE לפרם. כדי לדלל את ה-CD NA, אנו ממליצים להשתמש בריכוז CDNA סופי של פחות מ-200 ננוגרם למיקרוליטר ובנפח כולל בין שניים ל-10 מיקרוליטר. אם החלבון המקודד על ידי CD NA אינו מתויג קידוד פלסמיד מדווח, EGFP, למשל, ניתן להזריק יחד עם ה-CD הניסיוני NA.To לאשר הזרקה וביטוי מוצלחים, לערבב את פתרונות CD NNA על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים על פרפיל.
יש להיזהר מהכנסת בועות אוויר על מנת לשקוע חלקיקים בתמיסת ה-cDNA שעלולים לחסום מאוחר יותר את פיפטת המיקרו-הזרקה. השתמש בקצה פיפטה מיקרו מעמיס כדי להעביר אותו לצינור המטוקריט מוכן שנוקה, נחתך ואטום בלהבה בקצה אחד. לאחר מכן הכניסו את צינור ההמטוקריט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר וסובבו במשך 15 עד 30 דקות.
10,000 GS בטמפרטורת החדר. לאחר השלמת הצנטריפוגה, הנח את הצינור המכיל את תמיסת הזרקת ה-cDNA בצד. ניתן לשמור את התמיסה בטמפרטורת החדר במהלך ההזרקה שעה עד שעתיים.
לאחר ציפוי התאים, הסר את גלילי שיבוט הזכוכית. לאחר מכן החזר את התאים המצופים לתוך החממה למשך שארית תקופת הדגירה לפני מפגש ההזרקה. כדי להתחיל להזריק, ראשית, קחו צלחת של נוירונים מצופים מהאינקובטור והניחו אותה על שלב המיקרוסקופ של מערך הזרקה.
ההתקנה מורכבת ממיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, מזרק לחץ המחובר למניפולטור מיקרום ומערכת ניטור וידאו. תחת ניגוד פאזה, נוירונים מופיעים כתאים כדוריים עם גרעין גלוי בבירור כאברון עגול מרכזי עם קרום כהה ועשויים להכיל גרעין יחיד או מרובה. בעזרת קצה פיפטה של מעמיס מיקרו, משוך שני מיקרוליטר של ה- CD NA המוכן מצינור ההמטוקריט.
היזהר להימנע מהתמיסה ליד תחתית הצינור שבה ייתכן שחלקיקים שקעו. העבירו את התמיסה לפיפטה מיקרו-הזרקה. החוט בפיפטה המיקרו-הזרקה אמור לסייע במשיכת התמיסה לקצה.
אבל אם בועות אוויר קטנות נמשכות, החלק בעדינות את צד הזכוכית כדי לעקור אותן, וודא שהמחזיק הנימי של מזרק הלחץ מקובע בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן הכנס את פיפטת המיקרו-הזרקה למחזיק הנימים ואבטח את המחזיק למניפולטור המיקרו. לאחר מכן, הורד את פיפטת המיקרו-הזרקה לתוך הצלחת באמצעות מניפולטור המיקרום כאשר הפיפטה נכנסת למדיום התרבית, נוצר מניסקוס המשנה את מסלול האור דרך הדגימה ובכך מפחית את איכות התמונה של הנוירונים.
כדי להקל על בעיה זו, כוונן את צריח השלבים עד שגרעיני הנוירונים נראים בבירור. לפני תחילת הזריקות. השתמש בפונקציה הנקייה של מערכת הזרקת הלחץ כדי לנקות את הפיפטה מפסולת ולבדוק את איכות הפיפטות המיקרו-הזרקה.
הפתרון שנפלט אמור להיות גלוי על המסך. עם שימוש בפונקציה זו, הנוזל מקצה פיפטה בגודל אופטימלי נפלט כזרם דק. אם פיפטת המיקרו-הזרקה סתומה או צרה מדי, היא לא תפלוט נוזלים כאשר נעשה שימוש בפונקציה הנקייה.
אם הקצה רחב מדי או נשבר, נוזל ייפלט מהקצה כזרם רחב. אם הקצה נראה לא אופטימלי במהלך ההזרקות, החלף את פיפטת ההזרקה במרכז כעת את פיפטת המיקרו-הזרקה בצג הצפייה. שמירה על הגרעין במיקוד, הורד את קצה הפיפטה עד שהוא נמצא בפוקוס בסמוך לנוירון עצב.
הגדר מיקום זה כגבול ציר ה-Z התחתון במניפולטור המיקרו. עמדה זו היא העומק שאליו תתקדם פיפטת המיקרו-הזרקה במהלך הזריקות. לאחר מכן, מקם את הקצה כ-30 מיקרומטר מעל נקודה זו.
אז פיפטת המיקרו-הזרקה מנקה את החלק העליון של תאי העצב. כעת תכנת את ההגדרות של מניפולטור המיקרום להזרקות מיקרו. הגדר את מצב ההזרקה של מניפולטור איינור מיקרום למצב מופעל ואת פונקציית האימפל למצב כבוי כדי למזער נזק לתאים.
במהלך מיקרו-הזרקה, ייעד נתיב הזרקה אלכסוני על ידי בחירת המצב הצירי. הגדר את מהירות ההזרקה ל-300 מיקרומטר לשנייה וסנכרן את הצטברות הלחץ בגבול. התוכנית הבאה.
ההגדרות של מזרק הלחץ קובעות את לחץ ההזרקה או PI בין 100 ל-200 הקטור פסקל או HPA, את משך ההזרקה או ti ל-0.3 שניות ואת לחץ הפיצוי או PC ל-30 HPA. לאחר התאמת הגדרות המניפולטור, ניתן לבצע הזרקות תוך גרעיניות. באמצעות מיקום בקרת שלב ציר ה-XY של המיקרוסקופ, הנוירון מתחת לקצה פיפטת המיקרו-הזרקה.
יישר את קצה הפיפטה מעל מרכז הגרעין על ידי התמקדות למעלה ולמטה בין הקצה לשקע הגרעין. הזרקו את הגרעין על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה במיקרו מניפולטור. הזרקת הצמיגות הנמוכה יחסית.
תמיסת CDNA מופיעה לעתים קרובות כפלומה לבנה בגרעין. כאשר מסתכלים תחת אופטיקה של ניגודיות פאזה. המשך להזריק נוירונים על ידי מיקום מחדש של שלב המיקרוסקופ כדי ליישר את הנוירון הבא מתחת לפיפטה של המיקרו-הזרקה.
נווט באופן שיטתי במנה. המשך הזרקת גרעינים. השתמש בפונקציה הנקייה שתוארה קודם לכן כל 10 עד 15 זריקות כדי לבדוק את איכות פיפטת המיקרו-הזרקה.
אם הפיפטה סתומה או פגומה, יש להחליף אותה בהזרקה חדשה. חוסר אחידות של המשטח התחתון של כלי תרבית הרקמה יכול לגרום לפיפטה להזריק לפספס את התא או למנוע מהפלומה הלבנה להיראות בגרעין. במקרים אלה, פשוט התאם את קצה הפיפטה של המיקרו-הזרקה לאותו מישור מיקוד כמו הגרעין, והגדר זאת כגבול ציר ה-x החדש.
לאחר מכן המשיכו להזריק נוירונים. לפעמים פיפטת המיקרו-הזרקה אינה חודרת לקרום הגרעיני ופשוט דוחפת את הגרעין. אם זה קורה, ניסיון הזרקה שני באותה תנוחה עשוי להוביל להזרקה מוצלחת של DNA לגרעין.
נפיחות של התא מעידה בדרך כלל על הזרקה ציטופלזמית לא מכוונת. לאחר שהוזרקו 50 עד 100 גרעינים, החזירו את צלחת הנוירונים לאינקובטור לדגירת לילה. לאחר 16 שעות ניתן לזהות נוירונים שהוזרקו בהצלחה על ידי ביטוי של גן מדווח.
בתחום זה הוזרק גנגליון צוואר רחם עליון אחד או נוירון SCG וניתן לזהותו על ידי ביטוי של EGFP. נוירוני SCG שאינם מוזרקים, שאין להם חלבון G אנדוגני המחובר פנימה לתעלות אשלגן או GRK אינן מולידים זרמים מדידים במהלך רמפת מתח. כאשר נחשפים לנוראדרנלין אגוניסט הקולטן המצומד לחלבון G לשם השוואה, הזרקה מוצלחת של קידוד CD NA פלסמיד, ערוץ GRK פונקציונלי מוליד זרמים גדולים במהלך רמפת מתח כאשר הוא נחשף לנוראדרנלין.
הזרמים הנמדדים כאן אופייניים לתעלות קירק ומאופיינים בהפעלה על ידי תיקון פנימה של נוראדרנלין ועיכוב על ידי חוסם תעלות ה-grk המשוער. בריום, זה עתה הראינו לך כיצד להזריק CD NA לגרעין הנוירונים. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לזכור ארבעה דברים.
האחת, לסובב את הדנ"א לפני ההזרקה. שנית, כדי לוודא שהגרעין נראה בבירור. שלוש, כדי להתאים מחדש את מגבלת ציר Z בעת ניווט סביב המנה.
וארבע, לבדוק באופן קבוע את איכות קצה הפפ בין הזריקות. אז זו תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.
סקירה כללית
הזרקה תוך-גרעינית ישירה של cDNA היא טכניקת טרנספקציה יעילה עבור תאים פוסט-מיטוטיים, המאפשרת רמות גבוהות של ביטוי חלבונים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון תפקוד חלבונים בסביבה רלוונטית פיזיולוגית תוך שימוש במגוון בדיקות תאים בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- טכניקות טרנספקציה
רקע
- תאים פוסט-מיטיים הם קשים לטרנספקציה באופן מסורתי.
- רמות גבוהות של ביטוי חלבון הטרולוגי הן קריטיות למחקרים פונקציונליים.
- הזרקה תוך-גרעינית מספקת שיטה ישירה להחדרת cDNA.
- בדיקות של תא בודד מאפשרות ניתוח מפורט של תפקוד החלבון.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה יעילה לטרנספקציה של נוירונים פוסט-מיטוטים.
- להקל על חקר תפקודי חלבונים בהקשר תאי רלוונטי.
- לספק פרוטוקול מפורט להזרקה מיקרוסקופית תוך-גרעינית של מבני cDNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת DNA ופיפטות למיקרו-הזרקה.
- אופטימיזציה של ויזואליזציית תאים עלבמה של מיקרוסקופ.
- הזרקת מבני cDNA לנוירונים מופרדים של יונקים בוגרים.
- זיהוי תאים שהוזרקו בהצלחה באמצעות גן רהיט (reporter gene).
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת טרנספקציה יעילה של נוירונים פוסט-מיטוטים.
- הושגו רמות גבוהות של ביטוי חלבון בתאים המוזרקים.
- זיהוי מוצלח של התאים המוזרקים אושר באמצעות ביטוי של גן דגלית (reporter gene).
- ניתן להתאים את הטכניקה לדרישות ניסיוניות שונות.
מסקנות
- הזרקה תוך-גרעינית ישירה היא כלי בעל ערך לחקר תפקודי חלבונים.
- שיטה זו משפרת את היכולת לבצע מניפולציות בתאים פוסט-מיטוטיים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו ליישומים מגוונים במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך מנהלים
מיקרו-הזרקה גרעינית (Intranuclear microinjection) מאפשרת ביטוי יעיל של חלבונים הטרולוגיים בנוירונים פוסט-מיטוטיים, ובכך היא גוברת על מגבלותיהן של שיטות טרנספקציה סטנדרטיות. גישה זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בתהליך של תיקוף מטרות (target validation), על ידי אספקת נתונים על תפקוד חלבונים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. היא בעלת ערך מיוחד עבור תהליכי גילוי מוקדמים הדורשים רזולוציה של תא בודד ויחסי מבנים (construct ratios) עקביים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של מטרות טיפוליות במערכות נוירונליות רלוונטיות פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: תומך בביטוי משותף עקבי של מספר מבני DNA ביחסים מוגדרים לצורך ניתוח מסלולים.
- ערך חיזוי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרים של קולטנים המצומדים לחלבון G ותעלות יונים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים של תא בודד הניתנים להשוואה כמותית לצורך אופטימיזציה של בדיקות.
- ערך תפעולי: מאפשר ביטוי חלבון הניתן לשחזור ללא ציטוטוקסיות הנובעת משיטות כימיות או חשמליות.
- הערת סקילביליות: מתאים ביותר ליישומים בעלי תפוקה נמוכה ותוכן גבוה, כגון אלקטרופיזיולוגיה ודימוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות שימוש בנוירונים של יונקים בוגרים הרלוונטיים למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאשר מעורבות של המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים בהקשרי נוירונים ראשוניים.
- ביטחון חיזוי: תומך בהחלטות של המשך או עצירה (go/no-go) בהתבסס על תוצאות תפקודיות ישירות בתאים שאינם מתחלקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
טכניקה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ובמיוחד עבור מטרות בתחום מדעי העצבים הדורשות תיקוף עצבי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות הובלה ישירה של cDNA לגרעין של נוירונים פוסט-מיטוטיים.
- סריקה: מאפשר מערכות מוכנות לבדיקה עם יעילות טרנספקציה עקבית עבור קריאות תפקודיות של תא בודד.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים, כגון אמפליטודות של זרם יוני וקינטיקה של אקטיבציה.
- מחקר תרגומי: משתמש בנוירונים סימפתטיים מבוגרים מופרדים כמערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף מטרה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת מיקרו-הזרקה הניתנת לשימוש חוזר עבור מספר קונסטרוקטים ותנאים ניסויים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: רמות גבוהות של ביטוי חלבון הטרולוגי בנוירונים רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: הליך סטנדרטי וניתן לשחזור עם ציטוטוקסיות מינימלית.
- ערך אסטרטגי: שיפור במידת הוודאות לגבי המטרה והפחתת סיכון ביולוגי בתוכניות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון בהתבסס על נתונים נוירונליים תפקודיים.
שיקולי יישום
- מומחיות במיקרו-כירורגיה, מיקרו-מניפולציה ותחזוקת תרביות עצביות.
- מיקרוסקופ הפוך עם ניגוד מופע (phase contrast), מערכת להזרקה בלחץ ומיקרו-מניפולטור.
- הכנה וכיול סטנדרטיים של פיפטות למניעת סתימות ולהבטחת דיוק במיקוד הגרעין.
- שיקולי התאמה עבור תתי-סוגים שונים של נוירונים ותנאי תרביות שונים.
- מגבלה מעשית: תפוקה נמוכה הופכת את השיטה לבלתי מתאימה לבדיקות ביוכימיות הדורשות מספר תאים גדול.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:55
Introduction
1:39
Preparation for Injection and Fabrication of Injection Pipettes
12:00
Whole-cell Recordings of Currents through Heterologously-Expressed G-protein Coupled Inwardly Rectifying K+ (GIRK) Channels from SCG Neurons
4:54
Intranuclear Microinjection
12:56
Conclusion
