RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית
15 בדצמבר 2009
אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד ב תסיסנית עין. אנו פרט מתודולוגיה דיסקציה של הדיסק עין דמותי ואיך זה הכתב יכול לשמש כדי לסייע לנתיחה וזיהוי של סוגי תאים מסוימים בעין מתפתחות.
קו הדרוזופילה הטרנסגני החדש, IRFP Reporter, מבטא חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP בתאים ספציפיים בדיסקה האימגינלית של העין. קו טרנסגני זה יכול לסייע בזיהוי, בניתוח ובסימון של סוגי תאים ספציפיים בעין המתפתחת. כדי לנתח את הדיסקה האימגינלית של העין, מוציאים זחלים בשלב ה-wandering third מצד הבקבוק באמצעות שפכטל.
לאחר מכן מניחים את הלרווה בטיפת PBS על תבנית sill guard. את חלקי הפה עם דיסקיות העין המחוברות להם מסירים משאר גוף הלרווה באמצעות פינצטה, ואז מעבירים את דיסקיות העין לזכוכית כיסוי, שם הן מופרדות באמצעות דיסקציה מחלקי הפה ומהמוח. שלום, אני עמנה קול מהמעבדה של ג'וזף בייטמן במרכז וולפסון למחלות תלויות גיל, קינגס קולג' לונדון.
היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע דיסקציה של דיסקיות עין אימגינליות מ-Drosophila. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הגנים המעורבים בנוירוגנזה. אז בואו נתחיל.
כדי להתחיל בניתוח של דיסקים אימגינליים של העין, טפטפו טיפה של PBS על צלחת פטרי מצופה ב-Syl Guard. תחת מיקרוסקופ נתיחה, ציפוי ה-Syl Guard יעזור להגן על הפינצטות מפני נזק במהלך הניתוח. לאחר מכן, בעזרת שפכטל, קחו זחל בשליש האחרון של השלב וניחו אותו בטיפת ה-PBS. כאשר מחזיקים פינצטות בכל יד, תפסו את הזחל בשתי שליש הדרך לכיוון החלק האחורי עם סט אחד של פינצטות. כעת השתמשו בסט הפינצטות השני כדי להחזיק את חלקי הפה כהים הצבע בקצה הקדמי של הזחל.
משכו בעדינות את הלבה לצדדים על ידי הרחקת הפינצטות זו מזו. חלקי הפה אמורים להיפרד משאר הגוף כאשר קומפלקס העין והמוח מחובר אליהם. לאחר מכן, הניחו טיפה של PBS על תבנית והעבירו את הדיסקים לטיפת ה-PBS תוך החזקת חלקי הפה.
כעת עברו למצב פלואורסצנציה במיקרוסקופ הדיסקציה; מכיוון שרק הדיסקים האימגינליים של העין מבטאים RFP, ניתן לזהותם בקלות כרקמה פלואורסצנטית אדומה המונחת על האונות האופטיות הספריות להגברת הניגודיות של הדיסקים. כווןו את מקור האור הקר של הסיב האופטי בזווית אלכסונית לשקופית. הדיסקים האימגינליים של העין מחוברים לאונות האופטיות באמצעות הגבעול האופטי בחלק האחורי, ולחלקי הפה באמצעות גבעול המגיע מדיסק האנטנה בחלק הקדמי.
כדי לנתח את הדיסקים האימגינליים של העין, החזיקו את החלקים באמצעות זוג פינצטות אחד והשתמשו בזוג השני כדי להפריד את הדיסקים האימגינליים של העין מהמוח של הזחל. לאחר מכן, הפרידו את הדיסקים האימגינליים של העין מחלקי הפה. לאחר שהפרדתם את חלקי הפה מהדיסקים האימגינליים של העין, הסירו אותם מהסלייד.
דיסקיות הדמיה של העין צריכות כעת להישכב שטוח על השקופית ולהיות נקיות מכל רקמה זרה, כולל רקמת מוח. המשיכו להוציא את שאר דיסקיות הדמיה. לאחר שכל דיסקיות הדמיה של העין הוצאו, הטו בעדינות את השקופית והשתמשו בחתיכה קטנה של נייר סופג כדי לייבש את עודפי ה-PBS.
כעת הוסיפו טיפה של תמיסת קיבוע vector shield והניחו בעדינות זכוכית כיסוי מעל. הדיסקים מוכנים כעת לדגימה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence) או מיקרוסקופיה קונפוקלית. אם הדגימה תתבצע במועד מאוחר יותר, אחסנו את השקופית בטמפרטורה של 4°C.
ה-RFP יישאר נראה למשך שנה אחת לפחות. בעת הדמיה, יש לרכוש תמונות Z Series במיקרוסקופ קונפוקאלי או במיקרוסקופ Zeiss aome במרווחים של 1 µm באמצעות עדשה של 20x או 40x; ניתן להפיק תמונות היטל (projection images) באמצעות תוכנת המיקרוסקופ. דיסקים אימגינליים מזבובים המבטאים IRFP הוצאו בדיסקציה ונצבעו ב-Phin. לאחר מכן בוצעה הדמיה במיקרוסקופ Zeiss aome במרווחים של 1 µm באמצעות עדשה של 20x. תאי דיסק העין המבטאים RFP מוצגים בצבע אדום.
החריץ המורפוגנטי (morphogenetic furrow) מוצג באמצעות צביעה של foid ומופיע בירוק. הקטבים הדורסליים והונטרליים של דיסק העין מעוקלים ונוטים להתקפל. ניתן להסיר מקטעים אלו מתמונת ההקרנה הסופית.
למרות שהדיסקה היא אפיתליום חד-שכבתי, המיקומים המשתנים של הגרעינים מחייבים ביצוע היטל של סדרת Z (Z Series projection) כדי לקבל תמונה כוללת של הדיסקה. מאחר שהדיווח של IRFP ממוקם בגרעין, התבנית הנראית כאן מייצגת ביטוי של RFP בגרעין. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע את הפרוצדורה לבידוד דיסקות עין וגינליות מ-drosophila.
בעת שימוש בפרוטוקול זה, מומלץ להשתמש בפינצטה עדינה, וככל הנראה כדאי להימנע משתיית קפה לפני הביצוע. תודה שצפיתם, ובהצלחה בכל הניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) רהיטני חדש המבטא באופן ספציפי בעין של Drosophila. המתודולוגיה לניתוח של הדיסקה התפתחותית (imaginal disc) של העין מפורטת, ומדגימה כיצד רהיט זה מסייע בזיהוי של סוגי תאים ספציפיים בעין המתפתחת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- חלבונים פלואורסצנטיים אדומים הם כלים בעלי ערך להדמיה של תהליכים תאיים.
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודל למחקר של התפתחות העין.
- הבנת סוגי התאים בעין היא קריטית לביולוגיה התפתחותית.
- קווי טרנסגניים יכולים לשפר את חקרן של פונקציות תאיות ספציפיות.
מטרת המחקר
- פיתוח של זן טרנסגני של Drosophila המבטא RFP בעין.
- אספקת מתודולוגיה לדיסקציה של הדיסקה האימגינלית של העין.
- סיוע בזיהוי של סוגי תאים ספציפיים במהלך התפתחות העין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת זן טרנסגני של Drosophila עם ביטוי של RFP.
- דיסקציה של דיסקים דמיוניים (imaginal discs) של העין מזחלי גיל שלישי בשלב הנדודים.
- שימוש ב-PBS לשמירה על חיוניות הרקמה במהלך הדיסקציה.
- זיהוי וסימון של סוגי תאים ספציפיים בעין.
תוצאות עיקריות
- קו הדומה-פרוש (Drosophila) של ה-IRFP Reporter מבטא בהצלחה RFP בתאי העין.
- טכניקות נתיחה מאפשרות הדמיה ברורה של מבני העין.
- ניתן לזהות ולסמן סוגי תאים ספציפיים באמצעות ה-RFP reporter.
- מתודולוגיה זו משפרת את ההבנה של התפתחות העין ב-Drosophila.
מסקנות
- הדווח (reporter) החדש של RFP הוא כלי בעל ערך לחקר התפתחות העין של Drosophila.
- ניתן להחיל את שיטות ההפריד (dissection) המתוארות על מחקרי התפתחות שונים.
- מחקרים עתידיים יוכלו לנצל גישה זו להשגת תובנות מעמיקות יותר לגבי תפקודי סוגי תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של סוגי תאים ספציפיים בדיסקה הדמיונית (imaginal disc) של עין ה-Drosophila באמצעות רפורטר RFP הממוקם בגרעין מאפשרת זיהוי ודיסקציה מדויקים של רקמות, ובכך תומכת במחקרים של נוירוגנזה בשלבים מוקדמים ושל העברה של אותות (signal transduction). יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובזרימות עבודה של גנומיקה תפקודית, על ידי אספקת תוצאות ברורות וניתנות לשחזור. גישה זו רלוונטית באופן ישיר לנקודות הכרעה בשלבי הגילוי בשרשרת הפיתוח, שבהן הפחתת סיכונים ביולוגיים ובהירות מכניסטית הן קריטיות לקידום תיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מקל על זיהוי חד-משמעי של רקמת הדיסק האימגינלי של העין עבור מחקרים מונחי-השערה.
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של תבניות ביטוי גנים בנוירוגנזה ובקביעת גורל התא.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של ביטוי רפורטר ברקמה חיה או מקובעת.
- משפר את רמת הביטחון החזויה בחקירת מסלולים ובבחירת מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאה סטנדרטית מבוססת פלואורסצנציה לפיתוח בדיקות במודלים של עיני Drosophila.
- מאפשר הכנה הדירה של דגימות ביולוגיות מאושרות לצורך דימות ואנליזה בהמשך.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה על ידי ביטול הצורך בשלבי הגברה של האות.
- משפר את המוכנות לסריקה לצורך הערכת תרכובות או מודיפיירים גנטיים במסלולים של התפתחות נוירולוגית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של ניוון עצבי והעברה של אותות הרלוונטיים למחלה ב-Drosophila.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה באפיון פנוטיפי חסון.
- מספק ערך תרגומי על ידי تسهيل ויזואליזציה של סמנים ביולוגיים במערכות ניתנות למניפולציה גנטית.
- מפחית סיכונים בקידום מועמדים בעלי בסיס מכניסטי מתוקף.
שילוב צינורות עיבוד וזרימת עבודה
מערכת דווח זו של RFP משתלבת ברצף המוקדם של שלב הגילוי ועד לזיהוי מובילים (leads), ותומכת בבדיקת היפותזות, מיפוי מסלולים וגנומיקה פונקציונלית במודלים של Drosophila.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת הדמיה ישירה של ביטוי גנים ומבנה רקמות עבור מחקרים מבוססי היפותזה.
- סריקה: מספקת קריאת פלואורסצנציה כמותית ועקבית לצורך סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות.
- אנליטיקה: תומכת בדימות ברזולוציה גבוהה ובהשוואה סטטיסטית של דפוסי ביטוי ספציפיים לסוגי תאים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור סריקה פנוטיפית רלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה מערכת רפורטר מקודדת גנטית לשימוש חוזר במגוון מחקרי נוירוגנזה והעברת אותות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את תהליכי זיהוי הרקמות, ההדמיה ורכישת הנתונים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקה (go/no-go) ובהקצאת משאבים יעילה מבחינה הונית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מועמדים לשלב הגילוי והשלב הפרה-קליני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- נחושה גישה לפלטפורמות דימיון קונפוקאליות או אפי-פלואורסצנטיות לצורך ניתוח כמותי.
- דורש פרוטוקולי ניתוח ודימיון סטנדרטיים להבטחת הדירות (reproducibility) בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל אחרות הניתנות לתמניפולציה גנטית, באמצעות מבני דשיין (reporter constructs) מתאימים.
- תלוי בתחזוקה של קווים טרנסגניים ובתשתית דימיון.
