Name: RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: חקור שימוש בחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) לזיהוי ויזואלי של תאים ספציפיים בדיסק העין הדמיוני של זבובי פרי. שיטה זו מאפשרת הפרדה מדויקת של רקמות העין מהמוח והחלקים האחוריים של הזחל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי בקינגס קולג&#39; בלונדון ושל החברה המלכותית.

<ol&gt;<li&gt; מקום ראשון ירידה של PBS על צלחת Sylgard תחת מיקרוסקופ לנתח.</li&gt;<li&gt; הבא להסיר מספר הזחלים נודדים instar השלישי בקבוקון או בקבוק בעזרת מרית ומניחים אותם PBS.</li&gt;<li&gt; לנתיחה כדי להתחיל את השימוש פינצטה ביד שמאל (אם אתם ימניים) לאחוז הזחל שני שלישים של הדרך לכיוון אחורי ולאחר מכן להשתמש זוג אחרים להחזיק את הפה ווים בצבע כהה בקצה הקדמי.</li&gt;<li&gt; כעת משוך בעדינות את הזחל בנפרד על ידי הזזת שני זוגות של פינצטה אחד מהשני. גפי צריכה לבוא משאר הגוף עם מורכבות העין / המוח המצורפת.</li&gt;<li&gt; כדי להכתים את הדיסקים עין immunofluorescence לתקן את הדיסקים בשלב זה על ידי הצבת אותם paraformaldehyde 4% / פתרון PBS עבור 30-45 דקות על הקרח. ואז לשטוף את הדיסקים ארבע פעמים עם PBST ואת כתם אז עם נוגדנים מתאימים.</li&gt;<li&gt; זה הכי קל לנתח את העין הדיסקים ישירות בשקופית. מניחים ירידה של PBS בשקופית ולעבור את הדיסקים לירידה של PBS על ידי החזקת גפי.</li&gt;<li&gt; הרקמות דמותי הם שקופים ולכן בהתחלה את הדיסקים עין קשה לזהות. כדי להקל לזהות אותם במיקרוסקופ לנתח עם יכולת פלואורסצנטי. באמצעות העין RFP קו כתב דיסקים העין ניתן לראות בבירור כמו רקמה ניאון אדום שכיסה האונות אופטי כדורי (איור 1).</li&gt;<li&gt; אם אתה משתמש מקור סיבים אופטיים אור קר לכוון את האור בזווית אלכסונית לשקופית, כמו זה ייתן את הדיסקים ניגוד גדול יותר. דיסקים העין / מחושים מחוברים האונות אופטיים באמצעות גבעול הראייה בבית האחורי ואל גפי דרך גבעול הקרובים מדיסק מחושים בבית הקדמי.</li&gt;<li&gt; כדי לנתח את הדיסקים עין להחזיק את גפי באמצעות אחד פינצטה ולהשתמש זוג אחר כדי להפריד את הדיסקים העין מהמוח הזחל. הבא להפריד את הדיסקים עין מן גפי. לבסוף להסיר את גפי משקופית כמו אלה יכול למנוע את coverslip מן שוכב.</li&gt;<li&gt; כאשר יש לך גזור את כל הדיסקים העין בעדינות להטות את השקופית ויבש את PBS עודף. לאחר מכן להוסיף טיפת Vectashield בעדינות למקום coverslip על העליונה.</li&gt;<li&gt; הדיסקים מוכנים כעת להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ או epifluorescence או confocal (איור 2).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; נציג תוצאות</p&gt;<p class="jove_content"&gt; כאשר ניתח נכון את הדיסק העין / מחושים צריך לשכב בשקופית ברורה של רקמה כלשהי זרים כגון המוח. הקטבים הגבי ו הגחון של הדיסק עין מעוגלים, כך נוטים להתקפל, אבל זה יכול להימנע על ידי לקיחת Z-סדרת מיקרוסקופ confocal ו השמטת סעיפים אלה מן התחזית. אמנם הדיסק הוא אפיתל monolayer עמדות משתנה של גרעיני דורשים הקרנת Z-סדרת לקבל תמונה כוללת של הדיסק. השלכה של העין העין RFP טיפוסי / דיסק מחושים לקחה על מיקרוסקופ confocal מוצג באיור 2. אנחנו בדרך כלל לוקח 1 סעיפים מיקרומטר דרך הדיסק באמצעות עדשה 20x או 40X. הכתב העין RFP הוא מקומי גרעיני ולכן דפוס ראו תרשים 2 מייצג את הגרעינים של תאים לבטא RFP.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig1.jpg" alt="figure 1" /<br /<strong&gt; באיור 1. דיסקציה ראשונית של העין / המוח מורכב מ הזחל עין third-RFP תסיסנית instar.</strong&gt; העין / דיסק דמותי מחושים (בקווים כלליים) ניתן לראות המחוברים גפי (MP) ו שכיסה האונה אופטיים (OL) של המוח. התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח כדי להראות את הביטוי RFP דיסק העין. Anterior היא שמאלה. בר קנה מידה: 300 מיקרומטר.</p&gt;<p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1617/1617fig2.jpg" alt="figure 2" /<br /<strong&gt; באיור 2. הביטוי של עיתונאי העין RFP של הדיסק עין דמותי.</strong&gt; העין השלישית instar (ED) / דיסק מחושים (AD) גזור מן הזחל העין RFP מראה RFP הביטוי (אדום). הדיסק היה מוכתם phalloidin (ירוק), אשר כתמי משטחים התא apical ומראה את תלם המוךפו&quot;גנטי שהולך (ראש חץ). RFP מתבטא בתאים מבשר סביב MF, על photoreceptors 1,6,7 ו בתאי קונוס. Anterior היא שמאלה. בר קנה מידה: 25 מיקרומטר.</p

<ol><li>Doroquez, D. B., Rebay, I. Crit Rev Biochem Mol Biol. 41 (6), 339-339 (2006).</li>
<li>Kaul, A. K., Craig, G. M., McNeill, H., Bateman, J. M. , Forthcoming.</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. Biotechniques. 36 (3), 436-436 (2004).</li>
</ol>

Dissection של הדיסק עין דמותי תסיסנית היא פשוטה, אבל יכול לקחת זמן כדי לשלוט. השלבים הקריטיים זיהוי של הדיסק העין לנתיחה שלה מן המוח הזחל. זיהוי של הדיסק העין נעשה קל יותר באמצעות קו העין RFP המתואר כאן. שינויים אפשריים הם להסיר את הדיסק מחושים או קרום peripodial, או לעזוב את האונה אופטיים המחוברים לדמיין את האקסונים יחסי ציבור הזנת המוח. קו העין RFP נוצר על ידי שיבוט עין ספציפי רומן אלמנט משפר מן אינטרו...

rfp כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

<em&gt; תסיסנית</emעין&gt; מערכת מודל רב עוצמה ללימוד בתחומים כגון התמרה, אות הנוירוגנזה ניוון מוחיים. רבים מן הגילויים שנעשו באמצעות מערכת זו ניצלו את האופי spatiotemporal של בידול photoreceptor דיסק העין בפיתוח דמותי. כדי להשתמש במערכת יש צורך הראשון החוקר ללמוד לזהות לנתח את הדיסק העין. אנו מתארים כתב RFP רומן כדי לסייע בזיהוי של הדיסק העין ואת להדמיה של סוגי תאים מסוימים בעין מתפתחות. אנו פרט מתודולוגיה דיסקציה של הדיסק עין דמותי מן הזחלים instar השלישי לתאר איך הכתב העין RFP יכול לסייע לנתיחה זו. כתב זה העין RFP מתבטאת רק בעיניים ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ברקמה חיה או אחרי קיבוע ללא צורך הגברה האות. כמו כן, אנו מראים כיצד זה הכתב יכול לשמש כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים בתוך הדיסק העין. זה פרוטוקול ושימוש הכתב העין RFP יסייע לחוקרים באמצעות<em&gt; תסיסנית</em&gt; עין במטרה לענות על שאלות ביולוגיות חשובות מיסודו.

אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; עין. אנו פרט מתודולוגיה דיסקציה של הדיסק עין דמותי ואיך זה הכתב יכול לשמש כדי לסייע לנתיחה וזיהוי של סוגי תאים מסוימים בעין מתפתחות.

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

עין ה-Drosophila היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקר תחומים כגון נוירוגנזה, העברת אותות וניוון עצבי. רבות מהתגליות...

קו הדרוזופילה הטרנסגני החדש, IRFP Reporter, מבטא חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP בתאים ספציפיים בדיסקה האימגינלית של העין. קו טרנסגני זה יכול לסייע בזיהוי, בניתוח ובסימון של סוגי תאים ספציפיים בעין המתפתחת. כדי לנתח את הדיסקה האימגינלית של העין, מוציאים זחלים בשלב ה-wandering third מצד הבקבוק באמצעות שפכטל.לאחר מכן מניחים את הלרווה בטיפת PBS על תבנית sill guard. את חלקי הפה עם דיסקיות העין המחוברות להם מסירים משאר גוף הלרווה באמצעות פינצטה, ואז מעבירים את דיסקיות העין לזכוכית כיסוי, שם הן מופרדות באמצעות דיסקציה מחלקי הפה ומהמוח. שלום, אני עמנה קול מהמעבדה של ג'וזף בייטמן במרכז וולפסון למחלות תלויות גיל, קינגס קולג' לונדון.היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע דיסקציה של דיסקיות עין אימגינליות מ-Drosophila. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הגנים המעורבים בנוירוגנזה. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בניתוח של דיסקים אימגינליים של העין, טפטפו טיפה של PBS על צלחת פטרי מצופה ב-Syl Guard. תחת מיקרוסקופ נתיחה, ציפוי ה-Syl Guard יעזור להגן על הפינצטות מפני נזק במהלך הניתוח. לאחר מכן, בעזרת שפכטל, קחו זחל בשליש האחרון של השלב וניחו אותו בטיפת ה-PBS. כאשר מחזיקים פינצטות בכל יד, תפסו את הזחל בשתי שליש הדרך לכיוון החלק האחורי עם סט אחד של פינצטות. כעת השתמשו בסט הפינצטות השני כדי להחזיק את חלקי הפה כהים הצבע בקצה הקדמי של הזחל.משכו בעדינות את הלבה לצדדים על ידי הרחקת הפינצטות זו מזו. חלקי הפה אמורים להיפרד משאר הגוף כאשר קומפלקס העין והמוח מחובר אליהם. לאחר מכן, הניחו טיפה של PBS על תבנית והעבירו את הדיסקים לטיפת ה-PBS תוך החזקת חלקי הפה.כעת עברו למצב פלואורסצנציה במיקרוסקופ הדיסקציה; מכיוון שרק הדיסקים האימגינליים של העין מבטאים RFP, ניתן לזהותם בקלות כרקמה פלואורסצנטית אדומה המונחת על האונות האופטיות הספריות להגברת הניגודיות של הדיסקים. כווןו את מקור האור הקר של הסיב האופטי בזווית אלכסונית לשקופית. הדיסקים האימגינליים של העין מחוברים לאונות האופטיות באמצעות הגבעול האופטי בחלק האחורי, ולחלקי הפה באמצעות גבעול המגיע מדיסק האנטנה בחלק הקדמי.כדי לנתח את הדיסקים האימגינליים של העין, החזיקו את החלקים באמצעות זוג פינצטות אחד והשתמשו בזוג השני כדי להפריד את הדיסקים האימגינליים של העין מהמוח של הזחל. לאחר מכן, הפרידו את הדיסקים האימגינליים של העין מחלקי הפה. לאחר שהפרדתם את חלקי הפה מהדיסקים האימגינליים של העין, הסירו אותם מהסלייד.דיסקיות הדמיה של העין צריכות כעת להישכב שטוח על השקופית ולהיות נקיות מכל רקמה זרה, כולל רקמת מוח. המשיכו להוציא את שאר דיסקיות הדמיה. לאחר שכל דיסקיות הדמיה של העין הוצאו, הטו בעדינות את השקופית והשתמשו בחתיכה קטנה של נייר סופג כדי לייבש את עודפי ה-PBS.כעת הוסיפו טיפה של תמיסת קיבוע vector shield והניחו בעדינות זכוכית כיסוי מעל. הדיסקים מוכנים כעת לדגימה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence) או מיקרוסקופיה קונפוקלית. אם הדגימה תתבצע במועד מאוחר יותר, אחסנו את השקופית בטמפרטורה של 4°C.ה-RFP יישאר נראה למשך שנה אחת לפחות. בעת הדמיה, יש לרכוש תמונות Z Series במיקרוסקופ קונפוקאלי או במיקרוסקופ Zeiss aome במרווחים של 1 µm באמצעות עדשה של 20x או 40x; ניתן להפיק תמונות היטל (projection images) באמצעות תוכנת המיקרוסקופ. דיסקים אימגינליים מזבובים המבטאים IRFP הוצאו בדיסקציה ונצבעו ב-Phin. לאחר מכן בוצעה הדמיה במיקרוסקופ Zeiss aome במרווחים של 1 µm באמצעות עדשה של 20x. תאי דיסק העין המבטאים RFP מוצגים בצבע אדום.החריץ המורפוגנטי (morphogenetic furrow) מוצג באמצעות צביעה של foid ומופיע בירוק. הקטבים הדורסליים והונטרליים של דיסק העין מעוקלים ונוטים להתקפל. ניתן להסיר מקטעים אלו מתמונת ההקרנה הסופית.למרות שהדיסקה היא אפיתליום חד-שכבתי, המיקומים המשתנים של הגרעינים מחייבים ביצוע היטל של סדרת Z (Z Series projection) כדי לקבל תמונה כוללת של הדיסקה. מאחר שהדיווח של IRFP ממוקם בגרעין, התבנית הנראית כאן מייצגת ביטוי של RFP בגרעין. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע את הפרוצדורה לבידוד דיסקות עין וגינליות מ-drosophila.בעת שימוש בפרוטוקול זה, מומלץ להשתמש בפינצטה עדינה, וככל הנראה כדאי להימנע משתיית קפה לפני הביצוע. תודה שצפיתם, ובהצלחה בכל הניסויים שלכם.

a-novel-rfp-reporter-to-aid-visualization-eye-imaginal-disc

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי קולטי אור.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

חקור שימוש בחלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) לזיהוי ויזואלי של תאים ספציפיים בדיסק העין הדמיוני של זבובי פרי. שיטה זו מאפשרת הפרדה מדויקת של רקמות העין מהמוח והחלקים האחוריים של הזחל.

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית

גלה סרטונים נוספים