הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור
21 בדצמבר 2009
אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב מאוחר תסיסנית עוברים מיקרוסקופית אלקטרונים Trasmission של הצינור לב עוברי. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של לומן צינור לב, כמו גם את קרום במרתף, שבו הקווים לומן של הלב.
סרטון זה מסביר כיצד לבצע מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת, הידועה גם כ-TEM, על לב עוברי של דרוזופילה. הלב הפך למערכת מודל בעלת ערך לחקר נדידת תאים, היצמדות בין תאים ושינויים במורפולוגיית התא. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה של צורת חלל הלב, כמו גם של רכיבים אולטרה-מבניים כגון ממברנות של תאים, צומתים בין תאים וממברנה בסיסית.
כדי להתחיל בהליך זה, מכינים תמיסת קיבוע המתאימה למיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת של עוברים של drosophila. לאחר מכן, מעבירים תבנית של עוברים מצופים מגיל 0 עד 20 שעות אל תוך תמיסת הקיבוע. עם סיום התהליך, מוציאים את העוברים מתמיסת הקיבוע ומבצעים להם הנדסה (handy ized) בעודם מודבקים לסרט דו-צדדי.
בצלחת פטרי המכילה בופר דאיוני, העוברים צפים בבופר ונאספים באמצעות פיפטה. לאחר מכן, העוברים עוברים קיבוע משלים (postfix) ומדרג התייבשות. לאחר חדירת שרף, הם מועברים לתבנית שיבוץ שבה הם מסודרים.
את הבלוק שהתקבל חותכים באמצעות סכין יהלום. נתחים נלקחים על גבי רשתות נחושת, נצבעים ונבחנים. שלום, אני נדין לופ מהמעבדה של סוניטה קרמר במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית באוניברסיטה לרפואה ולשיניים של ניו ג'רזי בבית הספר לרפואה של רוברט ווד ג'ונסון.
אני רג' פטאל, המיקרוסקופיסט האלקטרוני גם אני מהמחלקה הפתולוגית של PON. היום נדגים לכם הליך להכנה והדמיה של עוברים של oph עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (transmission electron microscopy).
אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את המורפוגנזה של הלב ב-Drosophila. אז בואו נתחיל.
לפני הטיפול בעוברי הדרוזופילה, הכין תמיסת קיבוע טרייה עבור שיטת חדירת ההפטאן (Heptane permeation) לקיבוע עובריים. בתוך מנדף, העבר בפיפטה שני מיליליטר של תמיסה שהוכנה טרייה המכילה 12.5% glutaraldehyde בבופר Cate אל תוך מבחנת זכוכית לסנצילציה. הוסף שמונה מיליליטר של ADA heptane ונער בעוצמה.
לאחר מכן המתינו דקה אחת. לאחר הפרדת שני השלבים, השלב העליון מכיל את ה-ADA heptane, הרווי ב-glutaraldehyde, המהווה את תמיסת הקיבוע. העבירו באמצעות פיפט את השלב העליון לבקבוק נקי והניחו אותו בצד. כדי לאסוף עוברים בני 0 עד 20 שעות, השתמשו בתא לאיסוף עוברים, שהוא סלסילה קטנה עם רכיב רשת נשלף.
התחילו בהוצאת צלחת מיץ הענבים המכילה את העוברים והסירו זבובים מתים. לאחר מכן, בעזרת מים ומכחול, שחררו את העוברים מצלחת מיץ הענבים והעבירו אותם לתא איסוף העוברים באמצעות בקבוק לחיצה המכיל מים.
שטפו את העוברים משאריות שמרים עודפות מלוחית מיץ הענבים. הסירו את קרום הכוריון החיצוני על ידי השריית העוברים בתמיסת אקונומיקה 50% למשך שתיים עד שלוש דקות או עד שהעוברים צפים אל הפנימה. שטפו היטב במים מזוקקים וייבשו את העוברים על נייר סופג.
באמצעות פינצטה, הרים את רכיב הרשת, שאמור להיות מכוסה כעת בעוברי דגים מצופים. הנח את הרשת לתוך נוזל הקיבוע, ואפשר לעוברים לנשור ממנה. הנח לעוברים להיות מקובעים במשך שעה וחצי בטמפרטורה של 4°C תוך כדי ערבוב על רוקר אורביטלי.
עם סיום הדגירה, העבירו את העוברים אל צלחת פטרי המרופדת בסרט דביק דו-צדדי, תוך גרירה של כמות מינימלית ככל האפשר של חומר הקיבוע. נערה את הצלחת כדי לפרוס את העוברים לשכבה אחת, ולאחר מכן הניחו אותה במנדף כימי כדי לאפשר להפטאן להתאדות. לאחר שהעוברים התייבשו, כסו אותם בתמיסת בופר המכילה 0.1% tween hand de vize.
עוברים בשלב מאוחר של שלב 16 תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם מחט טונגסטן קהה. עוברים שעברו דה-קוריוניזציה צפים וניתן לאסוף אותם באמצעות פיפט פסטור; העבירו את העוברים לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. שטפו את העוברים בבופר ציטראט 0.1 מולרי, ולאחר מכן בצעו קיבוע משני ב-1% Osmium tetroxide למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר האינקובציה, שטפו את העוברים בבופר Cate. שוב, בצעו דהידרטציה לעוברים בסדרה מדורגת של אתנול ואצטון. התחילו ב-50% ethanol למשך 10 דקות, לאחר מכן ב-70% Ethanol למשך 10 דקות, לאחר מכן בצעו דהידרטציה ב-90% acetone למשך 10 דקות, ולבסוף בשלבים של 100% acetone למשך 10 דקות כל אחד.
הסיר את האצטון. התחל בתהליך ההספיגה על ידי הוספת תערובת ביחס של אחד לאחד של שרף ספריי ein ואצטון. ודא שהדגימה נמצאת תחת לחץ ואקום וחמם במיקרוגל למשך שלוש דקות.
שמרו על לחץ ואקום למשך חמש דקות נוספות. החליפו את תערובת שרף-אצטון בשרף 100% וחממו שוב במיקרוגל תחת לחץ ואקום. החליפו את השרף וחממו במיקרוגל תחת לחץ.
פעם אחרונה, לסך של שלושה שלבי חדירה. העבירו את העוברים מהשפופרת של המיקרו-צנטריפוגה לתבנית שיקוע מסיליקון. סדרו את העוברים בשורה כך שהקצה האחורי של העובר יהיה מיושר עם הקצה המצומצם של התבנית.
בשל את הבייקון בתנור בטמפרטורה של 70 °C למשך הלילה. לאחר מכן, הוצא את הגוש שהתקבל לצורך חיתוך. השתמש במיקרוטום כדי לחתוך חתכים בעובי של 1 µm מהעוברים.
לאחר שבוצעו חתכים בבלוק והעובר נחשף, השתמשו בלולאה כדי להעביר חתך בודד לעל שקף זכוכית, כדי לקבוע אם הושג העומק המתאים להדמיית הלב לפני תחילת התצפית. חממו קצרות את החתך על פלטה מחממת וצבעו את החתך במתילן כחול על ידי הוספת טיפה אחת לשקף, ולאחר מכן חימום קצר.
שטוף שוב במים דה-יוניים ובחן את החתך תחת מיקרוסקופ בעומק החיתוך הרצוי. חלל הלב צריך להיות ניתן לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לעמוד במגבלות המקום. קצץ שוב את הבלוק כך שיכלול מקסימום חמישה עוברים בחתך רוחב המראים את לב העובר.
חתכו חתכים בעובי 90 nanometer באמצעות המיקרוטום. העבירו מספר חתכים לרשת נחושת. צבעו את הרשת ב-3%al acetate למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים במים מזוקקים.
כעת צבעו את הרשת בlead citrate למשך שתי דקות וחצי בתא המכיל גרגרי sodium hydroxide כדי ליצור סביבה נטולת carbon dioxide. לאחר הדגירה, שטפו שלוש פעמים במים מזוקקים. בחנו את החתכים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ב-80 kilovolts וצלמו בעזרת מצלמת CCD.
כדי לקבוע האם עומק החיתוך והשלבים בוצעו כראוי, יש לוודא כי נוצר חלל לב בוגר בין שני ה-cardio blasts של קו האמצע הגבי. כדי לקבוע האם ממברנות התאים שלמות, יש לבחון את חלל הלב לנוכחות של מטריקס חוץ-תאי ולחפש נוכחות של Christie ומיטוכונדריה. כך הצגנו בפניכם כיצד לקבוע את המבנה העל של לב עוברי של drosophila. בעת ביצוע הליך זה.
חשוב לזכור לבצע שלב (staging) נכון של עוברי ה-drosophila, למדוד במדויק את רכיבי השרף ולערבב אותם היטב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור קיבוע, טמינה, חיתוך והדמיה של עוברים של Drosophila בשלב מאוחר באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM). הטכניקה מאפשרת ויזואליזציה של חלל צינור הלב ומעטפת הבסיס הנלווית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- עוברי Drosophila משמשים כמודל לחקר המורפוגנזה של הלב.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים בשיטת התהודה (Transmission Electron Microscopy) מספקת דימוי ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים.
- צינור הלב העוברי הוא קריטי להבנת נדידה והיצמדות של תאים.
- קיבוע וטמינה נאותים הם חיוניים לשימור פרטים אולטרה-מבניים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להiapan עוברי Drosophila עבור TEM.
- ויזואליזציה של הרכיבים המבניים של הלב העוברי.
- העמקת ההבנה של התפתחות הלב ברמה התאית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת קיבוע ואיסוף עוברים.
- טמיעת עוברים בשרף לאחר ייבוש.
- חיתוך של הבלוק הטמוע באמצעות מיקרוטום.
- צביעה ודימוי של חתכים על רשתות נחושת.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של חלל הלב וממברנת הבסיס.
- דימות מפורט של צמתים תאיים וממברנות.
- הפרוטוקול מאפשר קבלת תוצאות הניתנות לשחזור בחקר מורפוגנזה של הלב.
- הוכחת יעילותה של שיטת החדירה באמצעות Heptane.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מהווה כלי בעל ערך לחוקרים הלומדים את התפתחות הלב של Drosophila.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (Transmission Electron Microscopy) מספקת תובנות לגבי המבנה התאי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לבחון היבטים אחרים של ההתפתחות העוברית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM) של צינורי לב עובריים של Drosophila מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של מבנים תאיים הקריטיים להבנת מורפוגנזה, נדידה של תאים והדבקה. תהליך עבודה זה נותן מענה לאתגר של דימות מאפיינים תת-תאיים ברקמות קטנות ודינמיות מבחינה התפתחותית, ובכך תומך בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות. נתונים אולטרה-מבניים מהימנים ממערכת מודל זו מסייעים להפחתת סיכונים מכניסטיים ולמיון תיקי פיתוח בנתיבי עבודה של ביולוגיה של מערכת קרדיווסקולרית וביולוגיה התפתחותית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פארמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של צמתים בין-תאיים ושל הקרום הבסיסי לצורך תיקוף תפקודי של מטרות.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרה של הארכיטקטורה התאית במהלך מורפוגנזה.
- מספק ראיות ברזולוציה גבוהה לחקירת מסלולים ובדיקת היפותזות.
- מקל על תעדוף מטרות מועמדות בהתבסס על שלמות מבנית ופנוטיפים התפתחותיים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס סטנדרטים של ייחוס ביולוגיים שעברו תיקוף עבור בדיקות דימות המשך.
- משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של קריאות אולטרה-מבניות בין ניסויים.
- מאפשר הערכה כמותית של היווצרות לומן ומאפייני ממברנה לצורך פיתוח בדיקות.
- תומך במוכנות לסריקה על ידי אישור נאמנות מערכת המודל ברמה התאית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים ממערכת מודל לסמנים מבניים רלוונטיים למחלה במחקר פרה-קליני.
- מבטיחה רציפות מדימות בשלב הגילוי ועד לתיקוף תרגומי של תהליכים מורפוגנטיים.
- מפחיתה את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי אישור היפותזות מכניסטיות במערכת ניתנת לטיפול גנטי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה, המבוסס על TEM, משתלב ברצף הגילוי המוקדם, ומגשר בין תיקוף המטרה לפיתוח מודלים פרה-קליניים עבור תוכניות לב-כלי דם והתפתחות.
- ביולוגיה של תגליות: מספקת ראיות אולטרה-מבניות לבדיקת השערות ולהבהרת מסלולים במחקרי מורפוגנזה.
- סריקה: מספקת פלטים של דימות כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של גודל הלומן, שלמות הממברנה וארכיטקטורה של חיבורים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים ממערכות מודל להתאמה של ביומרקרים פרה-קליניים כאשר נקודות קצה מבניות הן רלוונטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה יכולת דימות ניתנת לשימוש חוזר עבור מערכות מגוונות הרלוונטיות להתפתחות ולמחלות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי מחקר מוקדמים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע, הטמעה ודימוי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת מחקר (go/no-go) ובהקצאת הון באמצעות אספקת נתונים מבניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות ומודלים שעברו ולידציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה אלקטרונית וטיפול במודלים התפתחותיים.
- מחייב גישה למכשור TEM ותשתית להכנת דגימות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי קיבוע וחיתוך.
- עשוי להצריך התאמה לשלבים התפתחותיים שונים או לאורגניזמי מודל שונים.
- תלוי בביצוע שלבים מדויקים ובהכנה מדויקת של ריאגנטים לקבלת תוצאות אופטימליות.
