מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

הקרינה הרב-פוטונית. התאוששות לאחר הליך פוטו-הלבנה מודגמת בקלות עם דגימה מפוזרת בחופשיות של מולקולות צבע פלואורסצנטיות. ראשית, קרן לייזר בעוצמה נמוכה נשלחת לדגימה כדי ליצור רמת ייחוס של פלואורסצנטיות ממולקולות D בתוך נפח המוקד של הלייזר.

לאחר מכן, הבזק לייזר קצר בעוצמה גבוהה נשלח בפוטו-הלבנה של חלק ממולקולות הצבע בתוך נפח המוקד. לבסוף, קרן הלייזר מוחלשת לרמת העוצמה הנמוכה הקודמת והפלואורסצנטיות מנוטרת כאשר מולקולות מולבנות פוטו מתפזרות החוצה ומוחלפות במולקולות פלואורסצנטיות דוממות מחוץ לנפח המוקד. הקרינה המתקבלת כפונקציה של עקומת הזמן מנותחת כדי להניב את מקדם הדיפוזיה.

היי, אני קלי סאליבן מהמעבדה של אדוארד בראון במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. היום נראה לך כיצד לבצע התאוששות פלואורסצנטית מרובת פוטונים לאחר פוטוהלבנה. אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור דיפוזיה הן במערכות ביולוגיות במבחנה והן במערכות ביולוגיות.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל, הגדר את אורך גל הלייזר הרצוי והכנס את המסנן המתאים מול צינור מכפיל הצילום או PMT. לאחר מכן כדי למנוע נזק לתא ה-PCAL, כוונן את עוצמת הלייזר ל-200 מילי-וואט או פחות.

ישנן שתי מראות המכוונות באיור ארבע במעלה הזרם של תא ה-PCAL. מראות אלו נחוצות ומספיקות כדי ליישר את קרן הלייזר דרך תא ה-PCAL. הגדר את היסט המתח בבקר ההטיה של תא ה-pcal לאפס, כוונן את נתיב הלייזר דרך תא ה-pcal כך שהלייזר יהיה מרוכז בחלונות הקדמיים והאחוריים.

השתמש במראה במעלה הזרם באיור ארבע כדי למרכז את הקורה בחלון הקדמי ובמראה במורד הזרם באיור ארבע כדי למרכז את הקורה בחלון האחורי. כעת הגדר את המתח על פני גביש תא ה-pcal לערך המקסימלי. הערך המתאים תלוי באורכי גל וניתן למצוא אותו במדריך ההוראות של תא PCAL.

כוונן את המראות באיור ארבע במעלה הזרם של תא ה-PCAL עד שהספק המוצא מתא ה-pcal יהיה מקסימלי. כעת העבר את המתח על פני הגביש לאפס והתאם את היסט המתח בבקר ההטיה כדי למזער את הספק המוצא מתא ה-PCAL. החזר את אירוע כוח הלייזר בתא ה-PCAL לערך הנדרש לניסוי.

כעת עוברים למיקרוסקופ, קבלו מיקוד חזותי טוב על דגימת פלורסנט סטנדרטית. כאן אנו משתמשים בגרגרי אבקה פלואורסצנטיים קבועים. לאחר המיקוד, אטום את המיקרוסקופ, כוונן את עוצמת הלייזר לרמה מתאימה להדמיית הדגימה על ידי שינוי המתח על פני גביש תא ה-PCAL.

לבסוף, כבה את האורות והפעל את ה-PMT. התחל סריקת תמונה חוזרת של הדגימה הסטנדרטית והתאם את המראות במורד הזרם של תא ה-PCAL עד לקבלת תמונה חדה של הדגימה. עכשיו בואו נסתכל על קביעת כוחות ניטור בטוחים שאנשים מתמקדים בתוך המדגם.

לצורך סרטון זה, נשתמש בדגימה של צבע מימי המוחזק בתוך שקע במגלשת זכוכית ומכוסה בגלישת כיסוי. להחליש את הלייזר לעוצמה נמוכה אך סבירה ליצירת פלואורסצנטיות בתוך הדגימה. אטום את המיקרוסקופ, הסיט את הפלט מה-PMT למונה הפוטונים.

כבה את האורות, הפעל את ה-PMT והתחל סריקת נקודה בתוכנת המיקרוסקופ. הגדר את מונה הפוטונים להשתלב על פני ציר זמן ארוך בהרבה מזמן התאוששות הקרינה הצפוי ורשום מספר סביר של נקודות נתונים. הגדל את ההספק וקח סדרה נוספת של נתוני ספירת פוטונים.

המשך להגדיל את ההספק עד שנראה שהעלייה בספירת הפוטונים פוחתת משמעותית. ביחס לעלילת הגדלת ההספק, יומן הפוטון נחשב כפונקציה של לוג הכוח. כל סטייה משיפוע של שניים מעידה על הלבנה.

במהלך הצג, בחר עוצמת צג סבירה שנמצאת מתחת לניתוק זה. עכשיו בואו נקבע את פרמטרי הקלט לסולם הרב-ערוצי ולמחולל הדופק. על מחולל הדופק.

הגדר את זמן הלימוד המקדים כך שיהיה גדול פי אחד עד שניים מזמן ההתאוששות הצפוי במחצית וזמן ההלבנה יהיה עשירית מזמן ההתאוששות הצפוי בסקלר. הגדר את רוחב הפח לכמחצית ממשך ההלבנה והגדר את מספר הפחים לכל רשומה, כך שהתוצר של רוחב הפח שבחרת והפחים לכל רשומה גדול מזמן ההתאוששות המלא הצפוי שלך. בנוסף, זמני ה-preble והאקונומיקה חוזרים למחולל הדופק ומגדירים את תדירות רצף ה-preble והאקונומיקה שווה לערך קטן רק מההופכי של המכפלה של רוחב הפח כפול מספר הפחים לכל רשומה.

לבסוף, הגדר את מספר הרשומות לכל סריקה בקנה המידה בהתבסס על עוצמת האות בעוצמת הצג שבחרת. כעת הגדר את עוצמת הצג לרמה בטוחה והגדר את עוצמת ההלבנה לכ-200 מילי-וואט מעל הפסקת ההלבנה שנקבעה במהלך בדיקת הלבנת הצג. שני הכוחות הללו מוגדרים כמתחים שונים על פני אטם הגביש של התא, המיקרוסקופ מכבה את האורות.

הפעל את ה-PMT. התחל סריקה נקודתית בתוכנת ההדמיה. לאחר מכן הפעל את מחולל הדופק והסקלר.

כדי לנתח את עקומת ההתאוששות המתקבלת, סמן שלוש נקודות חשובות. הקרינה הקדם-פלואורסצנטית, הקרינה מיד לאחר האקונומיקה והפלואורסצנטיות בסוף מערך הנתונים. השתמש בערכי הקרינה לפני ומיד לאחר האקונומיקה כדי להעריך טוב יותר את זמן ההחלמה של מחצית.

כעת, השתמש בכללים המתוארים בשלבים קודמים כדי לעדכן את הערכים עבור האקונומיקה המוקדמת ולהתחיל את משכי הרוחב. קח עקומה חדשה והמשך לשנות פרמטרים עד שהעקומה המתקבלת תציג אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה. בדוק אם יש רוויה בעירור על ידי התוויית היומן של פרמטר עומק האקונומיקה כפונקציה של לוג הכוח.

כל סטייה משיפוע של שניים מעידה על רוויה בעירור. בחר עוצמת אקונומיקה המניבה אקונומיקה חזקה אך אינה גורמת לרוויה. לבסוף, לאחר קביעת הפרמטרים המתאימים, המשך לבצע התאוששות פלואורסצנטית מרובת פוטונים לאחר פוטוהלבנה או עקומות MP FP של המדגם המעניין שלך.

כעת נציג תוצאות מייצגות של שני נתוני MP frap גולמיים בעקומת עטיפת MP F מנורמלת שהותאמה, מקדם הדיפוזיה, נתוני MP F frap הגולמיים, אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה. כאשר ההתאוששות המלאה מדווחת עבור המחצית השנייה של הנתונים כדי להתאים לנתונים. תחילה אנו מנרמלים את ההתאוששות לפלואורסצנטיות הקדם-פלואורסצנטית הממוצעת ולאחר מכן מבצעים התאמת ריבועים מושכרים לא ליניארית.

ביחס לדגם המתאים. שני מערכי הנתונים נלקחו במקדמי פלואורסצאין מימיים ודיפוזיה תפוקה. בהתאם לספרות זה עתה הראינו לך כיצד לבצע התאוששות פלואורסצנטית מרובת פוטונים לאחר ניסוי פוטו-הלבנה.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקפיד ולהגדיר את פרמטרי הניסוי שלך, בפרט, משך האקונומיקה וסמכויות ההלבנה והניטור לגבולות הבטוחים המוגדרים בפרוטוקול. אז תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.