Name: מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-26T16:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: למד מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור פלואורסצנציה דו-פוטוני לאחר photobleaching. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקה מולקולרית במערכות ביולוגיות in vitro ו-in vivo באמצעות ניתוח עקומות שחזור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מחלקת הביטחון של עידן פרס המלומד התקווה (מס &#39;W81XWH-05-0396) וכן חוקר Pew פרס למדעי ביו אדוארד בראון ב III.

1. יישר את אופטיקה. הציוד מפתח עבור הניסוי MP-FRAP כוללים: מצב נעול מקור לייזר, Pockels Cell (עבור קרן אפנון), דופק גנרטור, dichroic, עדשה אובייקטיבי, מסנן הקרינה פליטה, צינור מכפיל סגורות, ומערכת נתונים הקלטה (פוטון לדלפק ואת רב Scaler). 2. קביעת סמכויות לפקח על בטוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליש את הלייזר לשלטון, נמוך, אבל סביר להפקת הקרינה בתוך המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס בתוך המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מונה פוטון לשלב מעל ציר הזמן הרבה יותר מאשר ההתאוששות הקרינה הצפויה. עם נפח מוקד שנערך נייח בתוך המדגם (על תוכנת מיקרוסקופ שלנו זו מושגת על ידי סריקה נקודה), שיא מספר סביר של נתונים לספור פוטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיל את הכוח לקחת סדרה נוספת של נתונים פוטון לספור. חזור על הפעולה עד העלייה ספירת פוטון נראה להפחית באופן משמעותי ביחס להגדיל את כוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש יומן (ספירת פוטון) כפונקציה של log (כוח). סטייה מדרון של שני מצביע על הלבנת במהלך לצג. בחר ככוח לצג עוצמה נמוכה זה לחתוך, אבל המאפשרת אות סביר יחס רעש. </li></ol> 3. קביעת פרמטרים של קלט כדי הגנרטור הדופק רב Scaler. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע בחזרה-of-the-המעטפה הערכות של מקדם הדיפוזיה וזמן ההתאוששות מבוסס על ספרות / או את משוואת סטוקס-איינשטיין את המשוואה דיפוזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ערכי הפרמטרים הדרושים על מחולל את הדופק ואת Scaler. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מחולל את הדופק, לקבוע את הזמנים מראש אקונומיקה אקונומיקה. קבוצה טובה של כללי אצבע הוא כי אקונומיקה מראש צריך להיות 1-2 פעמים גדול יותר הפעם צפויה התאוששות וחצי, הזמן אקונומיקה צריך להיות עשירית הזמן הצפוי להתאוששות וחצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על Scaler, להגדיר את רוחב בן כ משך one חצי אקונומיקה, ולהגדיר את מספר פחי לכל רשומה כזו, כי המוצר של רוחב בן שבחרת פחי לכל רשומה הוא גדול או שווה בקירוב התאוששות מלאה צפויה שלך פלוס מראש -אקונומיקה אקונומיקה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל הגנרטור דופק ולקבוע את תדירות רצף pre-bleach/bleach/monitor שווה ערך רק קטן יותר מאשר הפוך המוצר של רוחב פעמים בן מספר פחי לכל רשומה. * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להגדיר את מספר הרשומות / סריקה על Scaler המבוסס על עוצמת האות בכל הכוח שבחרת לפקח. * חשוב מאוד כי זמן ברצף pre-bleach/bleach/monitor מלאה (1/frequency) מוגדר על הגנרטור הדופק עולה בזמן איסוף הנתונים (רוחב x פחי bin / שיא) מוגדר על Scaler. אם זה הקריטריונים לא מתקיים, מעורר אקונומיקה מרובים עשוי להופיע בתוך הרשומה יחיד על Scaler. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הכוח לפקח לרמה מקובלת, נקבע קודם לכן. הגדר את כוח אקונומיקה כדי mW 200 או כך מעל הפסקת הלבנה נקבע במהלך הבדיקה לנטר הלבנה. סמכויות אלה הן כמפורט במתחים שונים ברחבי גביש ה-PC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את המיקרוסקופ, לכבות את האורות, להדליק PMT, להתחיל לסרוק נקודה על תוכנת מיקרוסקופ, ולאחר מכן להפעיל את גנרטור הדופק Scaler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח עקומת התאוששות וכתוצאה מכך על ידי התוויית עקומת וסימון שלוש נקודות חשובות: 1) את הקרינה מראש אקונומיקה, 2) את הקרינה מיד לאחר אקונומיקה, ו 3) את הקרינה בסוף ערכת הנתונים. השתמש ערכי הקרינה מראש ומיד לאחר אקונומיקה כדי להעריך טוב יותר את זמן מחצית התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הערכה זו של זמן מחצית ההתאוששות, השתמש כללי אצבע שתוארו קודם לכן כדי לקבוע ערכים חדשים עבור אקונומיקה, טרום אקונומיקה, ורוחב המשכים סל. כמו כן, השימוש הקרינה מראש אקונומיקה הקרינה בסוף הנתונים מוגדר טוב יותר להעריך את הזמן הנדרש כדי להשיג החלמה מלאה. ככלל אצבע, יש לאסוף נתונים עבור פרק זמן המאפשר התאוששות מלאה ידווחו על המחצית השנייה של הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הפרמטרים על גנרטור הדופק Scaler, לקחת עקומת חדש, ולהמשיך tweaking את הפרמטרים עד עקומת שלך תערוכות אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה. זכור כי משך אקונומיקה יכול, וצריך, להיות מופחת מתחת שלטונו של האגודל, אם אפשר. הכוח אקונומיקה עשוי גם להיות מותאם אם רדוד מדי או עמוק מדי, אקונומיקה מושגת. </li></ol> 4. מבחן הרוויה עירור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צג המתאים סמכויות אקונומיקה, נקבע בעבר, לנקוט שורה של MP-FRAP עקומות. ניתוח כל התאוששות, מנורמל ל פלואורסצנציה מראש אקונומיקה, באמצעות טופס מתמטיים מתאימים שאינו ליניארי הריבועים הפחותים אלגוריתם מתאים (ראה "ניתוח נתונים" להלן). הקלט את הערך של הפרמטר מצויד עומק אקונומיקה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך נטילת וניתוח סדרת רצופים של MP-FRAP עקומות להגדיל את הערכים של כוח אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש יומן (עומק פרמטר אקונומיקה) כפונקציה של log (כוח). כל סטייה מן המדרון של שני מציין הרוויה עירור. בחר כוח אקונומיקה כי התשואות אקונומיקה חזקה, אבל אינו גורם הרוויה. </li></ol> 5. המשך נטילת MP-FRAP עקומות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לקחת את הקימורים, כאמור לעיל, כל הפרמטרים יהיה להגדיר כראוי. </li></ol> 6. ניתוח נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנתונים מראש אקונומיקה אקונומיקה מהנתונים הקרינה להגדיר ולהתאים את הנתונים בזמן כזה t = 0 המתאים לערך הקרינה מיד לאחר אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל את ההתאוששות הקרינה וכתוצאה מכך לגבי הקרינה מראש אקונומיקה הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאימו את עקומת מנורמל באמצעות מודל מתמטי מתאים אלגוריתם שאינו ליניארי, הריבועים הולם, כגון תפקוד lsqcurvefit ב MATLAB. המודל המוצג כאן מהווה החלמה הקרינה מושפעת דיפוזיה וגם זרם הסעה: <img src="/files/ftp_upload/1636/1636eq.jpg" alt="משוואה" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="משוואה"> היכן F o היא הקרינה מראש אקונומיקה הממוצע, β הוא פרמטר עומק אקונומיקה, τ D הוא הזמן האופייני התאוששות diffusive, R הוא היחס בין הכיכר של צירית (w z) כדי רדיאלי (w r) רוחבי של נפח מוקד שני הפוטונים, τ VX r = w / v x, τ VY = w r / v y, τ VZ = w z / v z, ו v 2 v = x 2 + v y 2 + z v 2 הוא מהירות הזרימה הסעה. עבור זרימה מוגבלת המטוס הדמיה, τ VZ → ∞ ו 1 / τ VX + 1 / τ VY ניתן להחליף 1 / τ VR. בהעדר זרימת הסעה, הן exponentials במונה ללכת 1 והביטוי מצטמצם מאוד, רק שני פרמטרים מתאימים, β ו - τ ד. מקדם דיפוזיה מחושב בקלות D = w r 2 / 8τ ד. </li></ol> 7. נציג תוצאות. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. אקונומיקה ייצוגית עקומת התאוששות עבור FITC-BSA. עקומת התאוששות טובה תערוכות אקונומיקה חזקה והתאוששות חלקה, עם הקרינה בבית החלמה מלאה שדווח עבור המחצית השנייה של הנתונים. <img src="/files/ftp_upload/1636/1636fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. עקומת התאוששות מנורמל עבור FITC-BSA (אדום) ואת בכושר הקשורים הפחות ריבועים (שחור). התאמה זו התשואות מקדם דיפוזיה של 52.9 um2 / s, עולה בקנה אחד עם הספרות.

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 60, 73-76 (1990).</li>
<li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophys J. 77, 2837-2849 (1999).</li>
<li>Sullivan, K. D., Sipprell, W. H. B. rown, Jr, E. B., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+model+of+fluorescence+recovery+expands+the+application+of+multiphoton+fluorescence+recover+after+photobleaching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Improved model of fluorescence recovery expands the application of multiphoton fluorescence recover after photobleaching in vivo.</a> Biophys J. 96, 5082-5094 (2009).</li>
</ol>

כוחה של התאוששות רב פוטון הקרינה לאחר photobleaching טמון ביכולתה לחקור דגימות עבה עם רזולוציה 3D. מאז הפיתוח שלה של 1990, MP-FRAP נעשה שימוש כדי לקבוע את מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) בגוף התא, לשעבר פרוסות vivo רקמה עבה, ברקמות interstitium vivo ו. במאמר זה, הצגנו את הציוד הדרוש להפעלת ניסוי MP-FRAP, כמו גם את ההליך המתאים יישור נתיב קרן, קביעת פרמטרים ניסיוניים, לקיחת נתונים, שחזור וניתוח עקומות. <p class="jove_content" style=";t...

<table><tbody><tr><td>לייזר Ti:sapphire</td><td>Newport Corp.</td><td>Mai Tai</td><td></td></tr><tr><td>תא פוקלס (Pockels Cell)</td><td>Conoptics</td><td>350-80</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקה בלייזר</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>מראת דיכרואי של מעבר קצר (Short pass dichroic mirror)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>670 DCSX-2P</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת מכפיל פוטו-אלקטרונים</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>מונה פוטונים</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 400</td><td></td></tr><tr><td>סקלר/ממצע רב-ערוצי</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR 430</td><td></td></tr><tr><td>מחולל פולסים</td><td>Stanford Research Systems</td><td>DG 535</td><td></td></tr><tr><td>FITC-BSA</td><td>Invitrogen</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים fluorescence לאחר photobleaching

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching היא טכניקה מיקרוסקופיה למדידת מקדם דיפוזיה (או פרמטרים תחבורה מקביל) של מקרומולקולות, והוא יכול להיות מיושם גם<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt; מערכות ביולוגיות. Multi-הקרינה ההתאוששות לאחר photobleaching מבוצע על ידי photobleaching אזור של אינטרס בתוך מדגם ניאון באמצעות הבזק לייזר אינטנסיבי, ולאחר מכן משפשפים את הקורה ואת ניטור הקרינה כפי עדיין פלורסנט מולקולות מחוץ לאזור של מפוזר עניין להחליף את מולקולות photobleached . נתחיל ההפגנה שלנו על ידי יישור קרן לייזר דרך התא Pockels (לייזר אפנן) ו לאורך השביל אופטי באמצעות תיבת לייזר לסרוק העדשה אובייקטיבי המדגם. לשם הפשטות, נשתמש דגימה של צבע פלואורסצנטי מימית. לאחר מכן, לקבוע את הפרמטרים של הניסוי מתאים המדגם שלנו כולל, לפקח סמכויות הלבנה, משך אקונומיקה, רוחב סל (עבור ספירת פוטון), וזמן ההתאוששות פלואורסצנטי. לאחר מכן, נתאר את הליך נטילת עקומות התאוששות, תהליך זה יכול להיות אוטומטי במידה רבה את התפוקה משופר באמצעות LabVIEW (National Instruments, אוסטין, טקסס). לבסוף, מקדם הדיפוזיה נקבעת על ידי מתאים לשחזור נתונים למודל המתמטי המתאים באמצעות אלגוריתם הפחות ריבועים הולם, לתכנות בקלות באמצעות תוכנות כגון MATLAB (Mathworks, Natick, MA).

במאמר זה נתאר את הליך למדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות רב פוטון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching. נתחיל על ידי יישור לייזר לאורך השביל אופטי המדגם קביעת פרמטרים ניסיוניים נאותה, ולאחר מכן להמשיך לייצר והתאמת עקומות בסופו של דבר התאוששות פלואורסצנטי.

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

התאוששות רב-פלואורסצנטית לאחר הלבנה פוטוכימית (Multi-fluorescence recovery after photobleaching) היא טכניקת מיקרוסקופיה המשמשת למדידת מקדם הדיפוזיה (או פרמטרי הובלה מקבילים) ...

ניתן להדגים בקלות את הליך התאוששות הפלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימית (FRAP) באמצעות דגימה של מולקולות צבע פלואורסצנטי המפעפפות באופן חופשי. ראשית, קרן לייזר בעוצמה נמוכה נשלחת אל הדגימה כדי ליצור רמת פלואורסצנציה של ייחוס ממולקולות ה-D בתוך נפח המיקוד של הלייזר.בשלב הבא, פולס קצר של לייזר בעוצמה גבוהה נשלח כדי לבצע פוטו-הלבנה (photobleaching) של חלק ממולקולות הצבע בתוך נפח המוקד. לבסוף, עוצמת קרן הלייזר מוחלשת חזרה לרמה הנמוכה הקודמת, והפלואורסצנציה מנוטרת בעוד המולקולות שעברו פוטו-הלבנה מפעפפות החוצה ומוחלפות במולקולות פלואורסצנטיות המגיעות מחוץ לנפח המוקד. עקומת הפלואורסצנציה המתקבלת כפונקציה של זמן מנותחת כדי להפיק את מקדם הדיפוזיה.שלום, אני קלי סאליבן מהמעבדה של אדוארד בראון במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת רוצ'סטר. היום נדגים לכם כיצד לבצע התאוששות פלואורסצנציה רב-פוטונית לאחר הלבנה פוטוכימית (multi photon fluorescence recovery after photobleaching). אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור דיפוזיה במערכות ביולוגיות הן in vitro והן in vivo.אז בואו נתחיל. ראשית, הגדירו את אורך הגל הרצוי של הלייזר והכניסו את המסנן המתאים לפני שפופרת הכפל הפוטואלקטרי או ה-PMT. לאחר מכן, כדי למנוע נזק לתא ה-pcal, כוון את הספק הלייזר ל-200 milliwatts או פחות.שתי מראות מכוונות בצורת הספרה ארבע במעלה הזרם של תא ה-pcal. מראות אלו נחוצות ומספיקות כדי ליישר את קרן הלייזר דרך תא ה-pcal. הגדירו את היסט המתח (voltage offset) בבקר ההטיה של תא ה-pcal לאפס, וכווננו את נתיב הלייזר דרך תא ה-pcal כך שהלייזר יהיה ממורכז בחלונות הקדמיים והאחוריים.השתמש במראה שמעלה בסידור ה-figure four כדי למרכז את הקרן בחלון הקדמי, ובמראה שמתחת בסידור ה-figure four כדי לממרכז את הקרן בחלון האחורי. כעת הגדר את המתח על גבי גביש תא ה-pcal לערך המקסימלי. הערך המתאים תלוי באורכי הגל וניתן למצוא אותו במדריך ההוראות של תא ה-pcal.כווננו את המראות באיור 4, שמימון לתא ה-pcal, עד שההספק שיוצא מתא ה-pcal יהיה מקסימלי. כעת השביתו את המתח על הגביש (מתח אפס) וכווננו את היסט המתח (voltage offset) בבקר ההטיה כדי למזער את ההספק שיוצא מתא ה-pcal. החזירו את הספק הלייזר הפוגע בתא ה-pcal לערך הנדרש עבור הניסוי.כעת נעבור למיקרוסקופ ונבצע מיקוד ויזואלי תקין של דגימה פלורסצנטית סטנדרטית. במקרה זה אנו משתמשים בגרגירי פולן פלורסצנטיים מקובעים. לאחר המיקוד, אטמו את המיקרוסקופ וכווננו את עוצמת הלייזר לרמה המתאימה לדימוי הדגימה באמצעות שינוי המתח על גבי גביש תא ה-pcal.לבסוף, כבו את האורות והפעילו את ה-PMT. התחילו בסריקת תמונה חוזרת של הדגימה הסטנדרטית וכוונו את המראות במורד הזרם של תא ה-pcal עד לקבלת תמונה חדה של הדגימה. כעת נבחן כיצד לקבוע הספקי ניטור בטוחים במיקוד בתוך הדגימה.לצורך סרטון זה, נשתמש בדגימה של צבע מימי המוחזקת בתוך שקע בלוחית זכוכית ומכוסה בזכוכית כיסוי. הנמיכו את עוצמת הלייזר לרמה נמוכה אך סבירה ליצירת פלואורסצנציה בתוך הדגימה. אטמו את המיקרוסקופ והפנו את הפלט מה-PMT למונה הפוטונים.כבו את האורות, הפעילו את ה-PMT והתחילו בסריקת נקודות (point Scan) בתוכנת המיקרוסקופ. הגדירו את מונה הפוטונים לבצע אינטגרציה על פני פרק זמן ארוך בהרבה מזמן ההתאוששות הפלואורסצנציה הצפוי, והקליטו מספר סביר של נקודות נתונים. הגבירו את העוצמה והקליטו סדרה נוספת של נתוני ספירת פוטונים.המשיכו להעלות את ההספק עד שנראה כי העלייה במניין הפוטונים פוחתת באופן משמעותי. ביחס לגרף עליית ההספק, לוגריתם מניין הפוטונים כפונקציה של לוגריתם ההספק. כל סטייה משיפוע של 2 מעידה על הבהרה (bleaching).במהלך הניטור, בחרו הספק ניטור סביר הנמוך מערך סף זה. כעת נקבע את פרמטרי הקלט עבור הסופר הרב-ערוצי (multichannel scaler) ומחולל הפולסים. במחולל הפולסים.הגדירו את זמן ההוראה המוקדמת (pre-teach time) להיות גדול פי אחד עד שניים מזמן מחצית ההתאוששות הצפוי, ואת זמן ההלבנה (bleach time) להיות עשירית מזמן מחצית ההתאוששות הצפוי בסקאלר (scaler). הגדירו את רוחב הסל (bin width) לכמחצית ממשך ההלבנה, והגדירו את מספר הסלים לרישום (bins per record), כך שהמכפלה של רוחב הסל שנבחר ומספר הסלים לרישום תהיה גדולה מזמן ההתאוששות המלא הצפוי. הוסיפו את זמני ה-preble וההלבנה, חזרו למחולל הפולסים והגדירו את התדירות של רצף ה-preble וההלבנה להיות שווה לערך שקטן במעט מההופכי של המכפלה של רוחב הסל כפול מספר הסלים לרישום.לבסוף, הגדירו את מספר הרשומות לסריקה במספר (scaler) בהתבסס על עוצמת האות בהספק הניטור שבחרתם. כעת, הגדירו את הספק הניטור לרמה בטוחה והגדירו את הספק ההלבנה לסביבות 200 milliwatts מעל סף ההלבנה שנקבע במהלך בדיקת הלבנת הניטור. הספקים הללו מוגדרים שניהם כמתחים שונים על פני אטם הגביש של תא ה-al, וכיבו את האורות במיקרוסקופ.הפעילו את ה-PMT. התחילו סריקת נקודות (point scan) בתוכנת הדימות. לאחר מכן, הפעילו את מחולל הפולסים ואת הסקאלר.כדי לנתח את עקומת ההתאוששות שהתקבלה, סמנו שלוש נקודות חשובות: הפלואורסצנציה לפני ההלבנה, הפלואורסצנציה מיד לאחר ההלבנה והפלואורסצנציה בסוף מערך הנתונים. השתמשו בערכי הפלואורסצנציה שלפני ההלבנה ומיד אחריה כדי להעריך טוב יותר את זמן מחצית ההתאוששות.כעת, השתמשו בכללים שפורטו בשלבים קודמים כדי לעדכן את הערכים עבור ה-preble bleach ומשכי ה-begin width. קחו עקומה חדשה והמשיכו לדייק את הפרמטרים עד שהעקומה המתקבלת תראה bleach חזק והתאוששות חלקה. בדקו אם קיימת רוויית עירור על ידי שרטוט הלוגריתם של פרמטר עומק ה-bleach כפונקציה של הלוגריתם של ההספק.כל סטייה משיפוע של שני מעידה על רוויית עירור. בחרו עוצמת הלבנה שתניב הלבנה חזקה אך לא תגרום לרוויה. לבסוף, לאחר קביעת הפרמטרים המתאימים, המשיכו בביצוע עקומות התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטונית רב-פוטונית (MP FP) של הדגימה הרלוונטית.כעת נציג תוצאות מייצגות הן של נתוני ה-FRAP הגולמיים של ה-MP והן של עקומת MP F מנורמלת שעברה התאמה כדי לקבוע את מקדם הדיפוזיה. נתוני ה-MP F FRAP הגולמיים מראים הבהרה חזקה והתאוששות חלקה. ההתאוששות המלאה מדווחת עבור המחצית השנייה של הנתונים כדי להתאימם. ראשית אנו מנורמלים את ההתאוששות לממוצע הפלואורסצנציה לפני ההבהרה, ולאחר מכן מבצעים התאמה לא-לינארית בשיטת הריבועים הפחותים.ביחס למודל המתאים. שני מערכי הנתונים נלקחו בפלואורסקין מימי ומניבים מקדמי דיפוזיה. בהתאם לספרות המקצועית, הרגע הראינו לכם כיצד לבצע ניסוי של התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטונית (FRAP) באמצעות רב-פוטונים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על הגדרת הפרמטרים הניסיוניים, ובמיוחד את משך ההסרת הצבע (bleach duration) ואת עוצמות ההסרה והניטור, לגבולות הבטוחים המוגדרים בפרוטוקול. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

measuring-diffusion-coefficients-via-two-photon-fluorescence-recovery

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את השימוש בספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות כדי לזהות את האינטראקציה בין חלבוני פני התא במגעים בין תאי התא. על ידי ביטוי קולטן ההידבקות הטרנסממברנה של עניין המסומן בחלבון פלואורסצנטי וערבוב שתי אוכלוסיות תאים שונות המכילות שתי תוויות פלואורסצנטיות מופרדות ספקטרלית, האינטראקציה הטרנסית בין קולטנים של שני תאים שכנים בעלי פלואורסצנטיות בצבעים שונים מוערכת באמצעות מתאם צולב בתנודות של עוצמת הפלואורסצנטיות.

ספקטרוסקופיית תנודות פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של חלבונים במגעים עם תאים

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

אנו מציגים טכניקה חדשה למדידת הדיפוזיה הרוחבית של מין פעיל על פני השטח בממשק נוזל-נוזל על ידי מיזוג חד-שכבת טיפה על חד-שכבה שטוחה.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

מתוארת שיטה למדידת דיפוזיה של חלבון בממברנות של תאי חיסון ראשוניים באמצעות ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS). במאמר זה מודגם השימוש בנוגדנים לסימון פלואורסצנטי.

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

אנו מציגים תהליך עבודה ניסיוני של פרוטוקול וניתוח נתונים לביצוע פלואורסצנטיות צולבת של תאים חיים (FCCS) בשילוב עם העברת אנרגיה תהודה של Förster (FRET) כדי לחקור דינמיקה של קולטני ממברנה בתאים חיים באמצעות טכניקות תיוג פלואורסצנטיות מודרניות.

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

מאמר זה מציג שיטה לניתוח spatiotemporal של נייד, מולקולה אחת Förster העברת אנרגיה תהודה (smFRET) מבוסס בדיקות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. ערכת הכלים החדשה שפותחה מאפשרת לקבוע עקבות זמן smFRET של בדיקות נעות, כולל היעילות הנכונה של FRET ואת העמדות המולקולריות, כפונקציות של זמן.

ניתוח ספטיוטמפורלי דו-ממדי אוטומטי של בדיקות FRET ניידות בעלות מולקולה אחת

למד מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור פלואורסצנציה דו-פוטוני לאחר photobleaching. שיטה זו מאפשרת חקר דינמיקה מולקולרית במערכות ביולוגיות in vitro ו-in vivo באמצעות ניתוח עקומות שחזור.

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

גלה סרטונים נוספים