Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן
29 בדצמבר 2009
אנו מתארים פרוטוקול יעיל להפקת "פילה" ההכנות של עוברים תסיסנית של גנוטיפים מסוימים. פרוטוקול זה מאפשר ביצוע יעיל של מגוון רחב של מסכי גנטית. זה גם מאפשר הדמיה מצוינת של מבנים בעובר מאוחר.
כאן אנו רואים את ההליך לאיסוף עוברים. העבירו זבובים מהמבחנות אל תוך הצינורות של תא איסוף בעל חמישה חללים. לאחר מכן, הניחו פלטת Agri של Grape מעל התא ואפשרו לזבובים להטיל ביצים במשך מספר שעות.
כאשר העוברים מגיעים לשלב המתאים, העבירו אותם מהלוחית בעזרת מכחול לסרט דביק דו-צדדי. כעת, גלגלו את העוברים מתוך התאים שלהם וסדרו אותם בשורה על גבי בלוק אגר בצד הבטני שלהם. במרכז, נראה שקופית עם מלבן שעווה וחתיכת סרט דביק דו-צדדי. באחד הקצוות, הפכו את הסרט הדביק הדו-צדדי מעל הבלוק עם העוברים המסודרים, והשחיקו אותו בעוברים כדי להעבירם לשקופית.
כעת הם יהיו פונים כלפי מעלה בצד הגבי. הוסף PBS לאזור השקף המוקף במלבן השעווה כך שיכסה את העוברים. החלק העליון מציג מבט צדי של השקף והחלק התחתון מציג מבט מלמעלה.
בצעו חתך לאורך קרומי ה-viel באמצעות מחט דיסקציה מזכוכית. דקרו את העוברים באזור המוח, הרימו אותם והעבירו אותם לשורות על הזכוכית. לאחר מכן, בצעו דיסקציה לכל עובר כדי ליצור פיליה (filet).
בסיום הפרוצדורה, תהיה בידך זכוכית עם שורות של עוברי דג filet. כעת היא מוכנה לקיבוע. שלום, אני פיטר לי, פוסט-דוקטורנט במעבדת קאיזן (Kaizens lab) בחטיבה לביולוגיה ב-Caltech.
שלום, אני אשלי רייט, סטודנטית לתואר שני ב-Caltech במעבדתו של קאיזן. אני קאיזן, פרופסור ב-Caltech, וקבוצת המחקר שלי עוסקת בפיתוח של מערכת העצבים בזבובים. היום נדגים לכם פרוצדורה לדיסקציה של עוברי opal חיים.
השתמשנו בשיטות אלו כדי לחפש ליגנדים עבור קולטנים שאינם מזוהים (orphan receptors). אנו עושים זאת על ידי סריקה של אוספי שורות תאים המבטאים באופן יתר חלבונים על פני השטח של התא, באמצעות צביעה חיה של עוברים עם חלבוני היתוך של קולטנים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה גם כדי לחקור פנוטיפים עובריים ולבצע סריקות גנטיות.
ביצעתי סקר חסר למעשים מוטוריים על פנוטיפים של הדרכה. אז בואו נתחיל. פיטר יראה לכם איך עושים זאת.
ראשית, השתמשו בשפכנה כדי להניח נקודה של משחת שמרים על לוח איסוף ביצים של ענבים (grape agri egg collection plate) המתאימה לכל אחד מהחביות של תא איסוף העוברים. לאחר מכן, הזריקו גז פחמן דו-חמצני אל מבחנות הזבובים כדי להרדימם. העבירו מספר מאות זבובים ישירות אל תא האיסוף.
לאחר מכן, כסו את התא עם פלטת איסוף הביצים ולחצו כלפי מטה. בעזרת רצועת סרט סימון באורך 20 אינץ', קשרו את התא ואת הפלטה יחד, החל מהמרכז של פלטת האגר. הסרט יחפוף על פלטת איסוף הביצים. לאחר שהזבובים יתעוררו, דגרו בטמפרטורת החדר בחשכה למשך שעתיים או שלוש במצב אופקי. לאחר הדגירה, הקישו את הזבובים כלפי מטה והחליפו את פלטת האיסוף.
אם קיימים פחות מ-100 עוברים בכל מגזר של הפלטה שהוסרה, המשיכו לבצע איסופים במרווחי זמן של שעתיים עד שייאספו מספיק עוברים. ניתן לאחד את העוברים שנאספו בהתאם להנחיות בפרוטוקול הכתוב המצורף.
כדי להבשיל את העובריים, הניחו פיסת נייר סינון עגולה בקוטר 90 מילימטר שהורטבה במכסה של צלחת פטרי, והניחו עליה את פלטת האיסוף עם העובריים כשהיא הפוכה. דגרו את הפלטה למשך הזמן הרצוי ובטמפרטורה הרצויה. הכינו תzריקה עבור שלבי התפתחות ומיון של העובריים על ידי הדבקת סרט דביק דו-צדדי על תזריקה. לאחר מכן, הניחו פרוסה מלבנית של אגר ענבים על התזריקה.
המדגר צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל חמש עד 10 שורות של 10 עד 15 עוברים. לאחר שהעוברים הגיעו לשלב הרצוי, הוצא אותם מהאינקובטור. העבר את העוברים המיושנים מלוחית האיסוף לסרט הדבק הדו-צדדי.
באמצעות מכחול רטוב, פרסו את העוברים באופן אחיד על גבי הסרט. תחת מיקרוסקופ דיסקציה עם GFP, סרקו את עוברי ה-SOAR כדי לזהות ביטוי GFP מתאים, המעיד על הגנוטיפ. בניסוי זה, הגנוטיפינג מבוצע על ידי בחירת עוברים שאין להם ביטוי של ה-balancer curly arm, GFP.
מכיוון שטיפוס הגנוטיפי (genotyping) של העוברים ישתנה בהתאם למאזן (balancer) שבו נעשה שימוש, אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף לקבלת מידע נוסף על ביצוע שלב זה. לאחר מכן, באמצעות מחט דיסקציה קהה, אספו את העוברים על ידי גלגול עדין שלהם על סרט דביק דו-צדדי. בשלב 16, המעי התחלק לשלושה פסים.
לאחר מכן, במעי מתחילים להתפתח פסים אלכסוניים ליד הזנב, לאחר מכן הוא מתגבע והעובר הופך לברור יותר. כעת, השתמש במחט הנתיחה כדי לגלגל כל עובר על גבי הקוריון או על גבי עוברים אחרים. הרם את העובר תוך הימנעות ממגע עם הסרט, והעבר אותו ללוח של אגר ענבים.
סדרו את העוברים המצופים על לוחית זו כך שצדם הגבי (dorsal) יהיה מופנה כלפי לוחית האגר וקצותיהם האחוריים יפנו כלפי מטה. לאחר מכן, הניחו את הזכוכית בתוך צלחת פטרי עם נייר סינון רטוב והדגירו את העוברים בטמפרטורת החדר עד שיגיעו לגיל הרצוי. לצורך ניתוח, הכינו זכוכית לניתוח חי על ידי גזירת חתיכה מלבנית קטנה של סרט דביק דו-צדדי. הדביקו את הסרט ליד אחד מקצותיה של זכוכית super frost plus באמצעות עט שעווה.
שרטטו מלבן ברוחב השקופית ובאורך של 30 עד 40 מילימטרים סביב הסרט. יש להשאיר רווח של כשלושה מילימטרים בין השעווה לסרט. לאחר מכן, העבירו את העוברים מלוח הפלטה הגדול אל הסרט על ידי היפוך השקופית והנחתה בעדינות על העוברים המסודרים, כך שהסרט יבוא איתם במגע.
יש להכווין את העוברי כך שקצותיהם האחוריים פונים כלפי מטה. לאחר ההעברה, העוברים ימוקמו על הזכוכית כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה; יש להוסיף מיד כמות אחת של XPBS מעל העוברים כדי למלא את מלבן השעווה באמצעות מחט ניתוח מזכוכית, המיוצרת במותח מחטים בדומה למחט הזרקה. יש לחתוך לאורך קו האמצע הגבי, החל מהקצה האחורי של העובר.
כעת דחפו את הקצה הקדמי של העובר והרימו אותו. החל מהחלק התחתון, העבירו את העובר לימין רצועת הסרט, תוך שמירתו בבופר. המשיכו בדיסקציה ובהעברת העוברים, כך שייווצר טור מסודר של עוברים על השקף, התואם לכל טור בלוח הגידול (agri slab).
בעזרת מחט הדיסקציה, דחפו בעדינות למטה את מקטעי דופן הגוף על גבי העששית. הימנעו ממתיחה או מהסרה של חומר מפני השטח שלהם. המחט צריכה לבוא במגע רק עם הפינות הקדמיות והאחוריות בשוליים הגבאיים של דופן הגוף.
מכיוון שאקסונים מוטוריים אינם מגיעים למרחק זה. בחלק הגבי, הימנעו מנגיעה במחטי השקופית, כיוון שהן יישברו לאחר שכל העוברים יועברו ויקובעו על השקופית. הסירו את המעי מכל עובר על ידי חיתוך ארבעת קשרי המעי מאזור המוח ומשיכת המעי כולו הרחק מהעובר.
הוציאו את המעי האחורי אל על העששית. לאחר השלמת כל שלבי הדיסקציה, השתמשו בשתי פיפטות פסטור כדי להוסיף בו-זמנית פורמלידהיד בריכוז 5% בטמפרטורת החדר לפינה אחת של המלבן שעשווה, ולהסיר את התמיסה מהפינה הנגדית. החליפו את תמיסת הקיבוע שלוש פעמים, תוך שימוש בנפח כולל של כ-six milliliters.
דגרו את העוברים בתמיסת הקיבוע למשך 45 דקות. חשוב מאוד למנוע מהמניסקוס לבוא במגע עם העוברים, שכן הדבר יגרום להרסם. השתמשו בפיפטת פסטור כדי להסיר את רוב תמיסת הקיבוע.
שטפו עם PBS שלוש פעמים באמצעות שיטת פיפטת העברה (pasture pipette). לאחר מכן, שטפו עם PBT שלוש פעמים כדי להחדיר את החומרים לעוברים (permeabilization). שלב זה גם הופך את העוברים לפחות רגישים למניסקוס.
לאחר השטיפה האחרונה, הסירו בזהירות את ה-PBT על ידי הטיית השקף, והתיקו קצרות עם נייר Kim wipe בפינת האזור המוקף בשמאע כדי להסיר עודפי תמיסה. בעזרת פיפט עם טעינה מראש, הוסיפו מיד 200 µL של תמיסת חסימה, וחסמו למשך 10 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את תמיסת החסימה באמצעות נייר Kim wipe.
לאחר מכן, הוסיפו מיד 200 µL מהנוגדן הראשוני הרצוי, המדולל בתמיסת חסימה. הניחו את השקופית בצלחת עם לחות והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. בניסוי זה, נעשה שימוש בנוגדן המונוקלונלי 1D4 כדי לסמן אקסונים מוטוריים.
למחרת, הוציאו את הצלחות מטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ושטפו את העובריים שלוש פעמים על פלטפורמה נדנדת באמצעות PBT למשך 15 דקות לפחות לכל שטיפה. בכל שלבי השטיפה, ודאו שיש מספיק PBT כדי להטביע את הזכוכית באופן מלא במהלך הנדנוד. לאחר שטיפת העובריים, בצעו חסימה של הזכוכית כפי שנעשה קודם לכן.
לאחר החסימה, הוסיפו מיד 200 µL של נוגדן משני ותמיסת חסימה והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר; כאן נעשה שימוש ב-Alexa 488 goat anti-US. הנוגדן המשני משמש בשילוב עם Rodine Phin לסיומון סיבי שריר. שוב, שטפו שלוש פעמים עם PBT על פלטפורמה נעה למשך 15 דקות לפחות לכל שטיפה.
העבירו את השקופיות למגש אחר כדי להסיר שאריות חומרי ניקוי. לאחר מכן, שטפו פעמיים ב-PBS למשך חמש דקות. הוציאו את השקופית מה-PBS, הסִירו את רוב ה-PBS שנותר בבאר בעזרת נייר ניגוב כימי (chem wipe), והוסיפו מיד 500 microliters של 70% glycerol.
מכיוון שלגליצרין יש את אותו מקדם שבירה כמו לעובר, ביצוע שלב זה יהפוך את הצביעה לנראית יותר; השאירו את העוברים בגלצרין למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C. לאחר מכן, הסירו את הגליצרין באמצעות נייר סופג (kim wipe). הסרה של כמעט כל הגליצרין תגרום לעוברים להשתוטח, בעוד שהסרה של כמות מועטה יותר של גליצרין תביא למבנה תלת-ממדי יותר.
לאחר הסרת הגליצרין, הניחו זכוכית כיסוי מספר 1. העוברים מוכנים להדמיה; ניתן להדמיות עוברים מנוסחים וצבועים באמצעות מיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה. כאן הוצג עובר מנוסח שצבעו עם הנוגדן 1D4 לסיומון אקסונים מוטוריים.
תמונה זו דומה במראהיה לתמונות הנפוצות יותר שבהן נעשה שימוש ב-HRP immunohistochemistry לצורך ויזואליזציה באמצעות immunofluorescence. ניתן להשיג תמונות באיכות גבוהה יותר שבהן פרטי ענפי האקסון המוטורים נראים בבירור רב יותר. צביעה משולבת עם phalloidin המסומן ב-rhodamine, הנקשר לאקטין, מאפשרת ויזואליזציה סימולטנית של השרירים.
זה נותן תמונה ברורה יותר של שכבות השריר והארגון שלהן מזו שניתן לקבל באמצעות צביעת HRP. כאן, אקסונים מוטוריים מוצגים בירוק, ושרירי ה-Fein מוצגים באדום. הרגע הדגמנו כיצד לנצח עוברים חיים של drosohpila מאוספי קווי מוטציות. כאשר אתם מבצעים את ההליכים הללו, חשוב להתחיל עם קווים קלים כמו lio, armadillo, GFP, balanced stocks, ולעבוד עם מספר קטן של קווים בכל פעם.
ככל שתהפכו למיומנים ומהירים יותר בביצוע ההיתוכים, תוכלו לטפל בעד 10 קווים ליום, דבר שיאפשר לכם לסרוק אוסף של כ-200 קווי מוטציה בפרק זמן של כ-20 ימים. לפיכך, זהו הליך יעיל מאוד ברגע שתרכשו מיומנות בביצוע כל השלבים. זה הכל, תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול יעיל להכנת דגימות מסוג "פילאט" (fillet) של עוברים של Drosophila מגנוטיפים ספציפיים. הפרוטוקול מקל על ביצוע יעיל של סריקות גנטיות שונות ומספק ויזואליזציה מצוינת של מבנים בעוברים בשלבים מאוחרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- עוברי Drosophila משמשים באופן נרחב במחקרים גנטיים.
- הכנות של פילוט (Fillet) מאפשרות בחינה מפורטת של מבנים עובריים.
- פרוטוקולים יעילים משפרים את היכולת לבצע סריקות גנטיות.
- טכניקות ויזואליזציה הן חיוניות להבנת תהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להכנת דגימות של חיתוך (fillet) של עוברי Drosophila.
- שיפור היעילות של שיטות סריקה גנטית.
- שיפור הוויזואליזציה של מבנים עובריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף עוברים באמצעות תא בעל חמישה תעלים.
- העברת עוברים לסרט דבק דו-צדדי לצורך יישור.
- שימוש בקוביות אגר למיקום העוברים.
- הפיכת הסרט להעברת העוברים על גבי זכוכיות עצירה לצורך תצפית.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר איסוף והכנה קלים של עוברים.
- ניתן ליישר את העוברים ביעילות לצורך ויזואליזציה.
- ניתן להשיג תמונות באיכות גבוהה של מבנים עובריים.
- השיטה תומכת ביישומים שונים של סריקה גנטית.
מסקנות
- פרוטוקול יעיל זה משפר את חקר העובר של Drosophila.
- הוא מהווה כלי בעל ערך לחוקרים המבצעים סריקות גנטיות.
- טכניקות ויזואליזציה משופרות תורמות להבנה טובה יותר של ביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פרוטוקול זה מאפשר סריקה פנוטיפית בעלת תפוקה גבוהה של אוספי מוטציות ב-Drosophila על ידי שילוב של דיסקציה חיה עם צביעה בנוגדנים, ובכך תומך בתיקוף מטרות במסלולים של התפתחות נוירולוגית. הוא מפחית את הזמן והעבודה בהשוואה לשיטות דיסקציה של רקמות מקובעות, ומאפשר סריקה של עד 10 קווים ליום עם דירוג כמותי של 4-7 עוברים מוטנטיים לכל קו. גישה זו מגבירה את הביטחון החזואי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הקלה בזיהוי של פנוטיפים עם חדירות נמוכה במאות של קווים מאוזנים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות סריקה פנוטיפית של אוספי מוטציות עבור מטרות להתפתחות עצבית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור הגנוטיפ לפנוטיפים נצפים של אקסונים ושרירים בעוברי חיים.
- ערך תרגומי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של פנוטיפים של ארגון שרירים והכוונה של אקסונים מוטוריים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מוכנות לבדיקה: מייצר הכנות סטנדרטיות של פילטים המתאימות לקריאות מבוססות נוגדנים של מבנים עצביים ושריריים.
- פלט כמותי: מאפשר דירוג של עד 70 המיסגמנטים (hemisegments) לקו בהגדלה גבוהה עם עדשה עם טבילה במים 40X לצורך כימות פנוטיפי חסון.
- סקילביליות: זרימת עבודה יעילה המאפשרת סריקה של מאות קווי מוטנטים מאוזנים במסכים גנטיים לליגנדים של קולטנים יתומים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מספק מערכת רלוונטית למחלה לבדיקת פנוטיפים של התפתחות נוירולוגית עם שימור של מסלולי הניווט האקסונליים האנושיים.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי הפיכת הפנוטיפיקה לעקבית משלבי הגילוי ועד לשלבי התיקוף.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר זיהוי של מוטציות עדינות עם חדירות נמוכה, שעשויות להדריך את בחירת המטרה והחלטות להפחתת סיכונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף השלב המוקדם של הגילוי, תומכת בבדיקת היפותזות בביולוגיה של התפתחות מערכת העצבים ומאפשרת סריקה ניתנת להרחבה לפני מאמצים לזיהוי מולקולות מובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות תצפית ישירה על פנוטיפים של אקסונים מוטוריים ושרירים בעוברי עוברים מוגדרים גנטית.
- סריקה: מספקת דגימות פילה מוכנות לבדיקה וניתנות לשחזור, עם קריאות אימונופלואורסצנציה כמותיות להערכת תרכובות או מודיפיקטורים גנטיים.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים פנוטיפיים כמותיים (למשל, תבניות התשעפות של אקסונים, ריבוד שרירים) המאפשרים ניתוח השוואתי בין תנאים גנטיים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לעבודה פרה-קלינית באמצעות שימור מנגנוני הדרכת אקסונים ומסלולי התפתחות שרירים הרלוונטיים להפרעות נוירו-התפתחותיות אצל בני אדם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת סריקה הניתנת לשימוש חוזר לאישור מטרות נוירו-התפתחותיות על פני פרויקטים מרובים ואוספי מוטנטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות שגויות שליליות באמצעות סריקה פנוטיפית בעלת תוכן גבוה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של דיסקציות עובריות בין משתמשים שונים ובין סדרות ניסויים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לסריקה של אוספי מוטנטים גדולים בלוחות זמנים דחוסים (למשל, 200 קווים ב-~20 ימים).
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי זיהוי פנוטיפים בעלי חדירות משתנה שעלולים להתפספס בבדיקות בעלות תפוקה נמוכה יותר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברי Drosophila, גנוטיפיקציה באמצעות סריקת מאזני GFP, וטכניקות של ניתוח מיקרו-כירורגי.
- תלוי בציוד הכולל מיקרוסקופים מורכבים עם עדשות טבילה במים של 40X, שקופיות מצופות שעווה, ותאי לחות להדגרת נוגדנים.
- מחייב סטנדרטיזציה של שלבי התפתחות העוברים (שלבים 14-17), תזמון הניתוח ופרוטוקולי צביעה בנוגדנים בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה למערכות מאזנים שונות (למשל GFP, Curly) המשפיעות על אסטרטגיות הגנוטיפיקציה.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך באנשי צוות מיומנים להשגת תפוקה אופטימלית (10 קווים ליום) ורגישות לבריאות העוברים ולדיוק בשלב ההתפתחותי.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:21
Introduction
2:14
Collection of Embryos From Fly Crosses
4:15
Staging Embryos and Sorting for GFP Expression
6:34
Drosophila Embryo Live Dissection
8:31
Embryo Fixation and Antibody Staining
12:11
Immunofluoresent Imaging of Dissected Drosophila Embryos
12:58
Conclusion
