Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

כאן אנו רואים את הליך איסוף העוברים. מעבירים זבובים מבקבוקונים לצינורות של תא איסוף בעל חמש חביות. לאחר מכן הניחו צלחת אגרי ענבים על גבי החדר ואפשרו לזבובים להטיל ביצים למשך מספר שעות.

כאשר העוברים נמצאים בשלב הנכון, העבירו אותם מאטה הענבים לסרט דבק כפול בעזרת מברשת. כעת גלגלו את העוברים מהקונים שלהם וסדרו אותם על גוש אגר עם צידי הגחון שלהם. למעלה באמצע, אנו רואים שקופית עם מלבן שעווה ופיסת סרט מקל כפול בקצה אחד, הפוך את סרט המקל הכפול מעל הבלוק עם העוברים המסודרים וגע בו לעוברים כדי להעביר אותם למגלשה.

כעת הם יהיו בצד הגב כלפי מעלה באופן מיידי. הוסף PBS לאזור המגלשה המוקף במלבן השעווה כדי לכסות את העוברים. החלק העליון מציג תצוגה צדדית של השקף והחלק התחתון מציג תצוגה עליונה.

חותכים חריץ לאורך קרום הוויל בעזרת מחט חיתוך זכוכית. תקעו את העוברים באזור המוח, הרימו אותם והעבירו אותם לשורות על הזכוכית. לאחר מכן מנתחים כל עובר להכנת פילה.

בסוף ההליך, תהיה לך שקופית עם שורות של עוברי פילה. עכשיו זה מוכן לתיקון. היי, אני פיטר לי, פוסטר במעבדת Kaizens במחלקה לביולוגיה ב-Caltech.

היי, אני אשלי רייט, סטודנטית לתואר שני ב-Caltech במעבדת Kaizens. אני קאייזן, פרופסור במכון הטכנולוגי של קליפורניה, וקבוצת המחקר שלי עובדת על התפתחות מערכת העצבים בזבובי פירות. היום נראה לכם נוהל לניתוח עוברי אופל חיים.

השתמשנו בשיטות אלה כדי לחפש ליגנדים של קולטנים יתומים. אנו עושים זאת על ידי סינון אוספי קווים על פני חלבוני פני התא המבטאים על ידי צביעה חיה של עוברים עם חלבוני היתוך קולטנים. אנו משתמשים בהליך זה גם במעבדה כדי לחקור פנוטיפים עובריים ולבצע בדיקות גנטיות.

ערכתי בדיקת חסר לפעולות מוטוריות על פנוטיפים מנחים. אז בואו נתחיל. פיטר הולך להראות לך איך זה נעשה.

כדי להתחיל, השתמש במרית כדי להניח נקודה של רסק שמרים על צלחת איסוף ביצי ענבים המתאימה לכל אחת מהחביות של תא איסוף עוברים. לאחר מכן, הזריקו גז פחמן דו חמצני לבקבוקוני הזבובים כדי להרדים את הזבובים. מעבירים כמה מאות זבובים ישירות לתא האיסוף.

לאחר מכן מכסים את החדר בצלחת איסוף הביצים ולוחצים כלפי מטה בעזרת רצועה באורך 20 אינץ 'של סרט תיוג רצועה את החדר והצלחת יחד החל מאמצע צלחת האגר. הקלטת תחפוף על צלחת איסוף הביצים. לאחר שהזבובים מתעוררים, דגרו בטמפרטורת החדר בחושך במשך שעתיים-שלוש במצב אופקי לאחר הדגירה, הקישו על הזבובים כלפי מטה והחליפו את לוחית האיסוף.

אם יש פחות מ-100 עוברים בכל מגזר של הצלחת שהוסרה. המשך לבצע איסוף של שעתיים עד שייאספו מספיק עוברים. ניתן לאגד את העוברים שנאספו על פי המפרט בפרוטוקול הכתוב הנלווה.

כדי ליישן את העוברים, הניחו חתיכה רטובה של נייר סינון עיגול 90 מילימטר במכסה של צלחת פטרי והניחו עליה את צלחת האיסוף עם העוברים הפוכים. דגרו את הצלחת למשך הזמן הרצוי ובטמפרטורה הרצויה, הכינו שקופית לבימוי ומיון עוברים על ידי הנחת סרט דביק דו צדדי על שקופית. לאחר מכן הניחו לוח מלבני של אגר ענבים על שקופית S.

הביצה צריכה להיות גדולה מספיק כדי להכיל חמש עד 10 שורות של 10 עד 15 עוברים. לאחר שהעוברים הגיעו לשלב הרצוי, הוציאו את העוברים מהחממה. העבירו את העוברים המזדקנים מצלחת האיסוף לסרט הדביק הדו-צדדי.

בעזרת מברשת צבע רטובה, מורחים את העוברים באופן שווה על פני הסרט. תחת מיקרוסקופ GFP מנתח עוברי SOAR לביטוי GFP מתאים, המעיד על גנוטיפ. בניסוי זה, הגנוטיפ מבוצע על ידי בחירת עוברים חסרי ביטוי של הזרוע המתולתלת המאזנת, GFP.

מכיוון שהגנוטיפ של העובר ישתנה בהתאם לאיזון בו נעשה שימוש, אנא עיין בפרוטוקול הכתוב המצורף למידע נוסף על ביצוע זה. צעד. לאחר מכן, בעזרת מחט מנתח קהה מצפים את העוברים על ידי גלגולם בעדינות על פני הסרט הדביק הדו-צדדי. בשלב 16, המעיים התפצלו לשלוש רצועות.

לאחר מכן, המעי מתחיל לפתח רצועות אלכסוניות ליד הזנב ואז מתפתל והעובר נעשה צלול יותר. לאחר מכן, השתמש במחט החיתוך כדי לגלגל כל עובר על גבי הקוריון או עוברים אחרים. הימנע ממגע עם הקלטת, הרם את העובר והעביר אותו ללוח אגר הענבים.

יישר את העוברים המצופים על לוח זה כשהצדדים הגביים שלהם כנגד לוח האגר והקצוות האחוריים פונים כלפי מטה. לאחר מכן הניחו את השקופית בצלחת פטרי עם נייר סינון רטוב ודגרו את העוברים בטמפרטורת החדר עד שהם מגיעים לגיל הרצוי לדיסקציה, הכינו שקופית לדיסקציה חיה על ידי חיתוך חתיכה מלבנית קטנה של סרט דביק דו צדדי. הנח את הסרט ליד קצה אחד של שקופית סופר כפור פלוס בעזרת עט שעווה.

צייר מלבן ברוחב השקופית ובאורך של 30 עד 40 מילימטרים סביב הסרט. צריך להיות מרווח של כשלושה מילימטרים בין השעווה לקלטת. לאחר מכן העבירו את העוברים מלוח הצלחת הגדול אל הסרט על ידי היפוך השקופית והורדתה בעדינות על העוברים המסודרים כך שהסרט יבוא איתם במגע.

העוברים צריכים להיות מכוונים עם קצוות אחוריים כלפי מטה. לאחר ההעברה, העוברים ימוקמו בצד הגב כלפי מעלה על המגלשה מיד יוסיפו XPBS אחד מעל העוברים כדי למלא את מלבן השעווה באמצעות מחט חיתוך זכוכית, המיוצרת על מושך מחט כמו מחט הזרקה. חותכים לאורך קו האמצע הגבי החל מהקצה האחורי של העובר.

כעת תקעו את הקצה הקדמי של העובר והרימו אותו למעלה. החל מלמטה, העבירו את העובר מימין לרצועת הסרט, ושמרו אותו במאגר. המשיכו לנתח ולהעביר עוברים, וצרו שורה מסודרת של עוברים על השקופית התואמת לכל שורה בלוח החקלאי.

בעזרת מחט הניתוח, דחף בעדינות כלפי מטה את דשי דופן הגוף אל המגלשה. הימנעות ממתיחה או הסרת חומר מפני השטח שלהם. המחט צריכה ליצור קשר רק עם הפינות הקדמיות והאחוריות בקצוות הגביים של דופן הגוף.

מכיוון שאקסונים מוטוריים אינם משתרעים עד כדי כך. מבחינה גבית, הימנע מלגעת במחטי המגלשה מכיוון שהיא תישבר לאחר שכל העוברים הועברו והוצמדו למגלשה. הסר את המעיים מכל עובר על ידי ניתוק ארבעת המעיים מאזור המוח ומשיכת המעי כולו מהעובר.

העקר את המעי האחורי החוצה אל המגלשה. לאחר השלמת כל הנתיחות, השתמש בשתי פיפטות קודמות כדי לספק בו זמנית את טמפרטורת החדר, 5% פורמלדהיד לפינה אחת של השעווה, המלבן, והסר את התמיסה מהפינה הנגדית. החלף את תמיסת הקיבוע שלוש פעמים באמצעות נפח כולל של כשישה מיליליטר.

דגרו את העוברים בתמיסה המקבעת למשך 45 דקות. חשוב מאוד לא לאפשר למניסקוס ליצור קשר עם העוברים מכיוון שהדבר יהרוס אותם. השתמש בעבר הפיפטה שלך כדי להסיר את רוב תמיסת הקיבוע.

שטפו עם PB S3 פעמים בשיטת שני פיפטות מרעה. לאחר מכן שטפו עם PBT שלוש פעמים כדי לחלחל את העוברים. שלב זה גם הופך את העוברים לפחות רגישים למניסקוס.

לאחר הכביסה האחרונה, הסר בזהירות את ה-PBT על ידי הטיית השקופית וגע במגבון קים קצרות לפינת האזור הסגור בשעווה כדי להסיר עודפי תמיסה. בעזרת איש פיפט טעון מראש הוסף מיד 200 מיקרוליטר של בלוק תמיסת חסימה למשך 10 עד 30 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסת החסימה באמצעות מגבון קים.

לאחר מכן מוסיפים מיד 200 מיקרוליטר של הנוגדן הראשוני הרצוי המדולל בתמיסת חסימה. מניחים את השקופית בצלחת לחה ודוגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. בניסוי זה, הנוגדן החד-שבטי 1D four משמש לתיוג אקסונים מוטוריים.

למחרת, הוציאו את הכלים מארבע מעלות צלזיוס ושטפו את העוברים שלוש פעמים על משטח נדנדה עם PBT למשך 15 דקות לפחות בכל שטיפה. עבור כל שלבי הכביסה, ודא שיש מספיק PBT כדי לטבול לחלוטין את המגלשה במהלך הנדנדה. לאחר שטיפת העוברים, חסום את המגלשה כמו קודם.

לאחר החסימה יש להוסיף מיד 200 מיקרוליטר של נוגדן משני ותמיסת חסימה ולדגור שעתיים בטמפרטורת החדר כאן Alexa 4 88 הולך אנטי ארה"ב. משני משמש בשילוב עם רודין פין לתיוג סיבי שריר. שוב, שטפו שלוש פעמים עם PBT על משטח הנדנדה למשך 15 דקות לפחות בכל כביסה.

העבירו את השקופיות למגש אחר כדי להסיר שאריות חומר ניקוי. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים עם PBS למשך חמש דקות. הסר את השקופית מעלילת ה- PBS את רוב ה- PBS שנותרו מהבאר בעזרת מגבון כימי, והוסף מיד 500 מיקרוליטר של 70% גליצרול.

מכיוון שלגליצרול יש את אותו מקדם שבירה כמו לעובר, ביצוע שלב זה יהפוך את הצביעה לגלויה יותר, נקה את העוברים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הגליצרול בעזרת מגבון קים. הסרת כמעט כל הגליצרול תשטח את העוברים בעוד שהסרת פחות גליצרול תביא למבנה תלת מימדי יותר.

לאחר הסרת הגליצרול, הניחו פתק כיסוי מספר אחת. העוברים מוכנים להדמיה ניתן להמחשה של עוברים מנותחים ומוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי. כאן עובר מנותח הוכתם בנוגדני תיוג האקסון המוטורי 1D 4.

תמונה זו דומה במראה לתמונות הנפוצות יותר בהן נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה HRP להדמיה באמצעות אימונופלואורסצנטיות. ניתן לקבל תמונות באיכות גבוהה יותר בהן נראים בצורה ברורה יותר הפרטים של ענפי האקסון המוטורי. צביעת Cos עם phin שכותרתו rho domine, הקושר אקטין, מאפשרת הדמיה בו זמנית של השרירים.

זה נותן תמונה ברורה יותר של שכבות השריר וארגונו ואז ניתן לקבל עם צביעת HRP כאן, 1D ארבע או אקסונים מוטוריים מוצגים בירוק פיין או שריר מוצג באדום. זה עתה הדגמנו כיצד לנתח עוברי דרוזופילה חיים מאוספים של קווים מוטנטיים. כאשר אתה מבצע את ההליכים האלה, חשוב להתחיל עם קווים קלים כמו lio, armadillo, GFP, מניות מאוזנות, ופשוט לעשות כמה שורות בכל פעם.

ככל שתהפכו למומחים ומהירים יותר עם הנתיחות, תוכלו לעשות עד 10 קווים ביום וזה יאפשר לכם לסנן אוסף של כ-200 קווים מוטנטיים בתקופה של 20 יום בערך. אז זה באמת הליך יעיל מאוד ברגע שאתה הופך למומחה בביצוע כל השלבים. אז זהו, ותודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.