הדמיה עצמים ללא עדשה על שבב של תאים מספק כלי חדש לביולוגיה-Cell תפוקה גבוהה ואבחון רפואי

בסרטון זה מוצגת הוכחת היתכנות עבור דימוי על-שבב באמצעות רשימת עדשות, המכונה Lucas. Lucas הוא ראשי תיבות של פלטפורמת מערך לניטור תאים עם שדה ראייה רחב במיוחד המבוססת על רשימת עדשות ודימוי צלליים. בניגוד למערכות דימוי קונבנציונליות, פלטפורמת Lucas אינה דורשת עדשות מיקרוסקופ או רכיבים אופטיים גודליים אחרים.

עבור Lucas, הדגימה הרלוונטית ממוקמת על זכוכית מיקרוסקופ וסגורה בעדינות על ידי כיסוי זכוכית זהה. באמצעות עט ואקום, הדגימה מועמדת על האזור הפעיל של מערך החיישנים האופטואלקטרוניים. לאחר מכן, פלטפורמת הדמיה מקליטה את הצלליות או את הולוגרמות הלנס-ליסט (lens list digital holograms) של כל תא רלוונטי בתוך שדה הראייה שלה.

עיבוד דיגיטלי אוטומטי של צלליות תאים אלו יכול לקבוע את סוג התאים, את מספרם ואת מיקומם היחסי בתוך התמיסה. שדה הראייה יכול להגיע לשטח של עד 18 centimeter squared עם עומק שדה של כחמישה מילימטרים. תמונות העקיפה שהתקבלו מעובדות לאחר מכן באופן דיגיטלי על ידי אלגוריתם החלטה שפותח במיוחד, כדי לאפשר הן אפיון והן זיהוי של תאי מטרה או חלקיקים.

Lucas מציעה פלטפורמה ממוזערת המפחיתה את העלות ומגבירה משמעותית את התפוקה עבור ניסויים מבוססי דימות, ובכך הופכת אותה לתואמת טכנולוגיות מתקדמות וחדשניות במיקרופלואידיקה ובמחקר ביולוגי. שלום, אני ממעבדת ROM Bio and Nano במחלקה להנדסת חשמל באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, ואני אנתוני ארלינגר, גם אני ממעבדת הננו-וביו-פוטוניקה. היום נראה לכם פרוצדורה בעלת תפוקה גבוהה ועדשה לדימות של תמיסת SA הטרוגנית, כגון דגימת דם מלאה.

נוהל זה במעבדתנו עושה שימוש בטכניקת דימות חדשנית, אותה אנו מכנים פלטפורמת ניטור מערך תאים בשדה רחב מאוד מבוססת רשימת עדשות ודימוי צל, ובקיצור Lucas. בואו נתחיל. כדי להתחיל בתהליך, השג 3 mL של דם מלא ומיקרו-חרוזי פוליסטירן בקטרים שונים, כגון 5, 10 ו-20 µm, והבא אותם לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

באמצעות פיפט סרולוגית, העבר שני מיליליטר של מדיום נוזלי RPMI 1640 classic כנוזל מיהול אל תוך מבחנה סטרילית מפוליפרופילן של חמישה מיליליטר. לאחר תקופת שיקוע של 30 דקות, שאב 10 microliters של דגימת אריתרוציטים מהחלק התחתון של מבחנת איסוף הדם השלם והעבר אותה אל תמיסת ה-RPMI. הוסף נפח כולל של 20 microliters של מיקרו-חרוזי פוליסטירן לדילול האריתרוציטים ב-RPMI, וערבב את תמיסת התאים על ידי פיפטור עדין. העבר 5 עד 15 microliters מהתמיסה ההטרוגנית אל על זכוכית כיסוי באמצעות פינצטה.

הניחו כיסוי זכוכית זהה שני מעל התמיסה. הדגימה צריכה להיות כלואה באופן אחיד בין שני כיסויי הזכוכית. לאחר מכן, באמצעות עט ואקום, טענו את הדגימה אל האזור הפעיל של מערך החיישנים לצורך הדמיה.

לאחר מכן, הכין את ריאגנט הצביעה הממיס על ידי שילוב של 0.1% buffered as SNY ותמיסת new methylene blue או NMB מהולה ביחס נפחי של שניים לאחד; יש לעיין בפרוטוקול הכתוב המצורף לפרטים על הכנת תמיסות as SNY ו-pum methylene blue. לאחר מכן, בתוך כלי כימי מפוליפרופילן, ערבב את ריאגנט הצביעה ACOA עם דגימת הדם השלמה ביחס נפחי של אחד לאחד, תוך שימוש בבמישה מגנטית למשך שתי דקות. לאחר מכן, דגור למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורת החדר, לאחר שהתמיסה דוגרה עם 1.99 milliliters של תמיסת RPMI 1640 classic liquid בתוך מבחנה מפוליפרופילן בנפח של חמישה מיליליטר.

בשלב הבא, העבירו 10 µL של תמיסת דם צבועה אל ה-RPMI כדי להגיע ליחס נפחים של 1 ל-200. לאחר מכן, ערבבו את התמיסה במכשיר vortex למשך 30 שניות, והעבירו באמצעות פיפט 10 עד 100 µL מתמיסת התאים הצבועה בין זכוכיות כיסוי או לתוך מאגר מיקרופלואידי. לבסוף, בעזרת עט ואקום, מקמו את הדגימה על האזור הפעיל של מערך החיישנים.

פלטפורמת Lucas עושה שימוש במערך חיישנים אופטואלקטרוניים כדי להקליט באופן דיגיטלי הולוגרמות של תאים ללא מגע. למטרה זו נעשה שימוש במתגי מטען, או CCDs, כדי לאפשר הארה באורך גל ניתן לכיוון; ניתן להשתמש במונוכרומטור עם מנורת xenon יחד עם סיב סיליקה מותכת בדרגה סטנדרטית, המורכב מצרור סיבים וחור סיכה בעובי של כ-100 מיקרומטר הממוקם בגובה של כ-5 עד 10 סנטימטרים מעל פני השטח של החיישן עבור הארה באורך גל ניתן לכיוון. הארה זו מספקת פלטפורמה גמישה שבה ניתן לכוון באופן מדויק את החתימות ההולוגרפיות של התאים, וניתן לסנתז חתימות דיגיטליות היברידיות על ידי מיזוג של יותר מאורך גל אחד כדי לשפר את יחס האות לרעש ואת הניגודיות של תמונת ה-Lucas.

לשם אפיון טוב יותר ומדויק יותר, דגימות דחוסות בין שתי זכוכיות כיסוי נטענות על האזור הפעיל של מערך החיישנים, המואר באופן אחיד על ידי מקור האור. הולוגרמות הדיפרקציה של כל תא או מיקרו-אובייקט בתוך תמיסה הטרוגנית נופלות על מערך החיישנים ויוצרות תמונת Lucas. תמונות הדיפרקציה של Lucas שנרכשו מעובדות על ידי אלגוריתם החלטה שפותח במיוחד, המשתמש בספריית תמונות דיפרקציה סטטיסטית לצורך אפיון וזיהוי אוטומטי של תאי מטרה או מיקרו-אובייקטים.

איור זה מציג תמונה רגילה שצולמה בעזרת עדשה עם הגדלה של 40x של תמיסה הטרוגנית המכילה מיקרו-חרוזי פוליסטירן בגדלים של 5, 10 ו-20 מיקרומטר, ותאי דם אדומים. המורפולוגיה התלת-ממדית, מקדם השבירה והמורכבות הבין-מרכיבית של חלקיקים אלו שונים זה מזה.

חלק ממאפיינים אלו ניתנים להבחנה תחת מיקרוסקופ קונבנציונלי, אך בשדה ראייה מוגבל מאוד של פחות מ-0.5 מילימטרים רבועים בפלטפורמת Lucas. כל המיקרו-חלקיקים הללו מציגים דפוסים הולוגרפיים שונים באופן ייחודי, בדומה לטביעת אצבע. לפיכך, ניתן לאפיין אותם ללא עמימות על בסיס המרקמים הדו-ממדיים שלהם.

Lucas יכולה לנטר שדה ראייה רחב במיוחד שניתן להרחיב עד ל-10 עד 20 סנטימטרים רבועים. זהו גודל הגדול בסדרי גודל ממיקרוסקופים סטנדרטיים המבוססים על עדשות. זוהי תמונה של דגימת דם מלא צבועה במיגדיל 40x באמצעות פלטפורמת Lucas.

מאפיינים פנימיים של תאי דם לבנים צבועים משתנים ביעילות על ידי שינוי מקדם השבירה ותכונות הפיזור של גרעיני התאים. דפוסי עקיפה ייחודיים של כל תא בודד נרשמים על ידי מערך החיישנים. הדבר מדגים יתרון נוסף של פלטפורמת Lucas ככלי רב עוצמה לציטומטריה בנקודת הטיפול (point-of-care) ולמטרות אבחוניות.

כפלטפורמה אוטומטית לחלוטין לאפיון מהיר של תאים רלוונטיים, תמונות דיפרקציה של לוקאס (Lucas) מעובדות דיגיטלית באמצעות תוכנת קבלת החלטות שפותחה במיוחד. באיור זה, תערובת הטרוגנית של כדוריות דם אדומות וחרוזי מיקרו (microbeads) מעובדת על ידי הממשק. האלגוריתם יעיל בזיהוי אזורים בעלי צפיפות גבוהה וכן חלקיקים עם יחס אות לרעש נמוך, כגון החרוזים בגודל 3 µm.

כאן מוצגת תמונה מעובדת בממשק המותאם של Lucas. התוכנה מאפשרת הזנה של מפרטים שונים, כגון גודל פיקסל של החיישן או אורך גל של התאורה. בנוסף, ניתן לבצע בחירות של אזורים בתמונה ולהגדיר תבניות תאים.

הדגימה נספרת על בסיס נתונים אלה והתמונה המסומנת מוצגת למשתמש. הרגע הצגנו כיצד לצלם ולאפיין תאים באמצעות הפלטפורמה בעלת התפוקה הגבוהה של Lucas. בביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ניתן ליישם את הניסויים שהודגמו על מגוון רחב של תאים ומיקרו-חלקיקים.

השיטה מאפשרת גם אפיון של תאים בפתרון הטרוגני בשטח רחב במיוחד ובתפוקה גבוהה. וזהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.