תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

להעשרה של תאים גרעיים במחזור הדם מדגימות דם. תחילה מכינים את ההתקן המיקרופלואידי באמצעות שטיפה ב-one XPBS להסרת בועות; לאחר מכן מעבירים דרך ההתקן באמצעות משאבות מזרקה מים דה-יוניים ו-2%paraldehyde ב-two XPBS לפני טעינת דגימת הדם. לאחר מכן, הדם מעובד דרך ההתקן המיקרופלואידי ונאסף; עיבוד הדגימה לאחר הפעולה כולל סנטריפוגציה והסרה של העילאי.

לבסוף, הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטריית זרימה ליצירת תרשימי fax. שלום, אני ויליאם וייט מהמעבדה לביוטכנולוגיה במיקרו-קנה מידה במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת וול. היום נראה לכם הליך להעשרה של תאי גרעין סובבים באמצעות ליזיס של דם מלא באמצעות מיקרופלואידיקה.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור דלקת בתהליכי מחלה שונים, וזאת כדי להבטיח העשרה של לוקוציטים ותאים גרעיניים סחרריים אחרים ללא אובדן או הפעלה. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, התאימו צינור גישה שקוטרו גדול במעט מחורי הגישה של הערוץ בחורי הכניסה והיציאה.

כדי לספק את הממשק בין המקרו למיקרו, חברו מחט מזריק במידה 30 gauge לצינור בכל אחת מהכניסות. לאחר מכן, מלאו מזריק של ਇੱਕ מיליליטר ב-one XPBS, תוךما וידוא שאין בועות אוויר. חברו את המזרק לכניסה אחת ודחפו את המזרק בעדינות ביד עד ש-one XPBS יזרום החוצה מכניסה שתיים.

לאחר מכן, סגרו מיד את כניסה שתיים באמצעות תליש (binder clip). המשיכו לדחוף את המזרק עד שפתרון 1X PBS יגיע לפתח היציאה של המכשיר המיקרופלואידי. ברגע שהפתרון זורם מהיציאה, סגרו את צינור היציאה באמצעות תליש נוסף.

המשיכו לדחף את מזרק ה-1 mL עד ש-XPBS יזרום החוצה מפתח כניסה 3, וסגרו את פתח כניסה 3 באמצעות תפס דפים שלישי. כעת התקן המיקרופלואידי מוכן ומלא בנוזל (primed). התחילו בכיול משאבות המזרקים עם משאבת המזרקים הגדולה של Harvard, כאשר הגדרת הקוטר היא 22.5 millimeters וקצב הזרימה הוא 600 µL per minute.

עבור משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. הגדירו את תצורת הקוטר ל-4.61 millimeters ואת קצב הזרימה ל-20 microliters per minute. לאחר מכן, מלאו מזרק אחד של 30 milliliter במים דה-יוניים על ידי שאיבת תמיסה ישירות מהמבחנה הקונית של 50 milliliter.

זכרו לסמן את המזרק, מלאו מזרק נוסף של 30 milliliter בתמיסת 2%paraform aldehyde ב-two XPBS. שוב, שאבו ישירות ממשפחית (conical tube) וסמנו את המזרק. כעת חברו את המזרק המכיל מים לכניסה שתיים ואת המזרק עם 2%para formaldehyde ב-two XPBS לכניסה שלוש, תוךما וידוא שאין בועות כלואות בצינוריות או במכשיר המיקרופלואידי.

לאחר מכן, הסירו את התסמיכים מהכניסה השנייה, מהכניסה השלישית ומהצינור של היציאה, כאשר כל שלוש המזרקים מחוברים. המשיכו להניח את שני המזרקים הגדולים יחד על משאבת המזרקים הגדולה של Harvard והניחו את המזרק של 1 mL על משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. מקמו את צינור היציאה בתוך מבחנה קונית של 50 mL לאיסוף פסולת.

כעת הפעילו את משאבת המזרקים הגדולה של Harvard המחזיקה את המזרקים בנפח 30 מיליליטר והניחו לה לפעול למשך דקה אחת. בדקו שאין בועות ושאין דליפות במכשיר או בצינוריות. לאחר מכן, הפעילו את משאבת המזרקים הקטנה של Harvard והניחו גם לה לפעול למשך דקה נוספת.

בדיקה לנוכחות בועות ודליפות. עצירה של המשאבות לאחר שתי דקות. כעת, כאשר ההתקן המיקרופלואידי מוכן לשימוש עם דגימות דם, דגימות הדם המיועדות לניתוח נאספו כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ונעשה בהן שימוש בתוך שעה אחת מרגע האיסוף.

את המבחנה הראשונה של הדם שנאסף משליכים כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. הסירו את מזרק ה-one milliliter ממשאבת המזרקים הקטנה של Harvard, ולאחר מכן הגזירה XPBS אחת באמצעות מזרק ה-one milliliter תוך מילוי מחט המזרק. כדי למנוע כניסת בועות, מלאו מזרק one milliliter ב-50 microliters של XPBS אחת ללא כליאת בועות.

לאחר מכן, מלאו את המזרק ב-0.5 milliliters של דם. החזיקו את המזרק במצב אנכי בזמן המילוי כדי למנוע ערבוב של ה-PBS עם הדם. לאחר מכן, חברו את המזרק המכיל את הדם חזרה לכניסה אחת.

נגבו כל עודף של נוזל והרכיבו את המזרק בצורה אנכית על משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. היזהרו לא לדחוף את הדם דרך הפבינג אל תוך המכשיר. הוציאו את צינור היציאה מצינור הפסולת והניחו אותו בתוך מבחנת צנטריפוגה נקייה של 50 milliliter המונחת בדלי קרח.

כעת התחילו את ההרצה; הפעילו תחילה את משאבת המזרקים הגדולה של Harvard והניחו לה לפעול במשך דקה אחת. לאחר מכן, הפעילו את משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. הדגימה תתחיל להיאסף מצינור היציאה אל תוך מבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter.

הניחו לדגימת הדם במזרק של מיליליטר אחד לעבור באופן מלא דרך המכשיר, פעולה שארכה כ-20 דקות. לאחר מכן הפסיקו את שתי המשאבות. כעת, כאשר ההרצה הושלמה, סבבו במערבל צנטריפוגי את הדגימה שנאספה למשך חמש דקות ב-350 ×g בטמפרטורת החדר ללא שימוש בבלם.

הסר את הנוזל העליון (supernatant) על ידי הצבת קצה הפפטה בצד הנגדי למשקע הלבן. הסר כמה שיותר נוזל עליון, ובמיוחד שיירי תאי דם אדומים, מבלי להפריע למשקע הלבן. השהה מחדש את הדגימה ב-1 ml של flow buffer המכיל 1%BSA ו-2%para formaldehyde ב-one XPBS באמצעות פפיתה.

העבירו את הדגימה לשפרוret מיקרו-צנטריפוז'ה בנפח 1.5 milliliter, וסבבו את הדגימה שנאספה למשך חמש דקות ב-4×g. בטמפרטורת החדר, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות, כפי שבוצע בשלב הצנטריפוגציה הקודם. לבסוף, הוסיפו 1 milliliter של flow buffer, ערבבו ב-vortex כדי לתלה מחדש את הדגימה, והמשיכו בניתוח הדגימה באמצעות flow cytometry.

כעת נציג מספר תוצאות מייצגות בצורת תרשימי FACS מדגימת דם שהועשרה באמצעות המכשיר המיקרופלואידי, עם ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. את חשיבות ההעשרה באמצעות ליזיס ניתן לראות בתרשים FACS שבו תאי דם אדומים יוצרים ענן. תרשים הפיזור שהתקבל מפרוטוקול ההעשרה המיקרופלואידי הוא תרשים פיזור נקי עם אוכלוסיות מוגדרות של תאים גרעיים שנמצאו במחזור הדם.

האזור האדום מייצג לימפוציטים, הירוק מייצג מונוציטים, הכחול מייצג גרנולוציטים, והאזור הסגול טרם אופיין. אי-הסרה של שאריות תאי דם אדומים בפרוטוקול גורמת להצטברות אירועים בגרף ה-fax הנראה באזור הציאן. ניתן להציג אוכלוסיות של תאים בגרפי fax נפרדים.

לימפוציטים שזוהו באמצעות CD three ו-CD four. מונוציטים שזוהו באמצעות CD 14 וגרנולוציטים שזוהו באמצעות CD 66 P. הרגשנו הרגע כיצד להכין ולהריץ דגימת דם באמצעות מכשיר הליסיס המיקרופלואידי לדם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להריץ את דגימת הדם באופן מיידי כדי למנוע ערבוב של ה-PBS עם הדם לפני הכניסה למכשיר, וכדי למנוע חדירת בועות אוויר לתעלות המכשיר.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.