Name: תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למדו שיטת העשרה אוטומטית של תאים גרעיניים מדם באמצעות מכשיר מיקרו-זרימה. הפרוטוקול מבטיח בידוד דגימות באיכות גבוהה עם אובדן תאים מינימלי לניתוח זרימה ציטומטרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי קרן פרס ח &#39;וולאס קולטר קריירה בתחילת Translational מחקר. הודות טים ​​אנדרוז, להמטולוגיה / Oncology, לעזרה עם אוסף דגימת דם. כמו כן, הודות ד&quot;ר סם ולהאוזן, cytometry Core זרימה, ג&#39;יימס גרהאם בראון Cancer Center, עזרה בניהול תזרים cytometry דגימות.

חלק 1. המכשיר microfluidic ייצור עובש אב סיליקון של המכשיר תמוגה microfluidic נוצר באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי עם הציוד באוניברסיטת לואיוויל cleanroom [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, בסן רפאל, קליפורניה) שימש ליצור מסיכת שקיפות (Fineline הדמיה, קולורדו ספרינגס, CO) כדי ליצור העתקים שלילית של הערוצים. המכשיר תמוגה microfluidic היה מפוברק בין עובש האב סיליקון תוך שימוש בטכניקות ליתוגרפיות רך עם אלסטומר פולי (dimethylsiloxane) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). אלסטומר עם ערוצי משוכפל שוחרר, וגישה ערוץ נוקבו חורים עם מחט 20-מד (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה.). רקיק PDMS היה קשור באופן בלתי הפיך לשקופית זכוכית באמצעות פלזמה חמצן ונבדק לניסויים. חלק 2. פרוטוקול להפעלת המכשיר תמוגה אחרי המכשיר microfluidic כבר מפוברק ונבדק, ניסויים תמוגה כדורית אדומה מוכן להתחיל. פרטים בסעיף הבא את הפרוטוקול עבור המכשיר microfluidic. 2.1 לדוגמה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 4 מ"ל של דגימת דם מהעורק cubital חציון, על עורק הזרוע הקדמי של המטופל עם קרישה כמו הפרין בשני 2 vaccutainers מ"ל העליון ירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל הצינור הראשון 2 מ"ל מכיוון שהיא מכילה וחילצה לתאי אנדותל בוגרים (חיוביות שגויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הצינור השני לערבב הפרין עם דם על ידי סיבוב למעלה ולמטה; להציל מיד על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ"ל של דם צינור Eppendorf 1.5 מ"ל. תהליך דגימת דם באופן מיידי (תוך שעה אחת לאוסף). </li></ol> 2.2 המכשיר microfluidic ראש עם PBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מכשיר microfluidic קשור זכוכית. לחץ להתאמה גישה צינורות (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה) בקוטר של מעט יותר את פתחי הכניסה ועל היציאה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מחט מזרק 30-מד (חלקים קטנים, מיראמר, פלורידה) כדי צינורות על כל פתחי הכניסה, מספקת את ממשק מאקרו ומיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ"ל עם 1X PBS ולוודא להיפטר בועות על ידי מצליף את מחט המזרק. חבר את PBS טעון מזרק 1 מ"ל עד 1 כניסת למכשיר microfluidic. לחצו על מזרק המכיל את PBS 1X בעדינות ביד עד לפתרון זורם מתוך כניסת 2, ומיד תפס כניסת 2 עם קליפ קלסר משרדי רגיל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לדחוף את PBS 1X עד נוזל מגיע לנמל היציאה של המכשיר מיקרופלואידיקה. לאחר פתרון זורם מתוך משקע, מהדק את צינור מוצא עם קליפ אחר קלסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך לדחוף את המזרק עד 1 מ"ל PBS 1X זורם מתוך כניסת 3, מהדק את יציאת כניסת 3 עם קליפ אחר קלסר משרדי. המכשיר מיקרופלואידיקה כיום ערוכה באופן מלא. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סכמטי של המכשיר מראה פתחי הכניסה פתרונות בהתאמה לשקע. 2.3 הכנת משאבות מזרק פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכייל את משאבות בצע את הפעולות הבאות: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משאבת מזרק גדול הרווארד (Harvard, PhD חלק 22/2000 # 702000): הגדרת תצורת בקוטר 22.5 מ"מ, קצב הזרימה 600 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משאבת מזרק קטן הרווארד (Harvard, פיקו פלוס חלק # 702213): הגדרת תצורת בקוטר 4.61 מ"מ, קצב הזרימה 20 μl / min. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את אחד מזרק 30 מ"ל מים deionized סטרילית. ניתן להשיג זאת על ידי משיכת הפתרון ישירות מן הצינור חרוטי 50 מ"ל. (לייבל את המזרק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המזרק השני עם 30 מ"ל paraformaldehyde 2X פוספט שנאגרו-מלוחים, (PBS) 2% (PFA) באמצעות ההליך המתואר בשלב 9. (לייבל את המזרק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ"ל עם 1X PBS מן aliquots מאוחסנים 15 צינורות חרוטי מ"ל, באמצעות ההליך המתואר בשלב 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את 30 מ"ל מים deionized המזרק כניסת 2 ו 30 מ"ל 2X מזרק PBS על כניסת 3 (לוודא שאתה לא בועות לא מלכודת בצינור או ההתקן מיקרופלואידיקה). הסר את מהדק מ פתחי הכניסה 2 ו -3 ואת צינורות מוצא. חבר את 1X PBS 1 מ"ל מזרק לתוך מפרצון 1. הימנע מציגה בועות ידי מילוי מחט מזרק עם נוזל, לחבר את המזרק, והוא מצליף את מחט המזרק כדי להיפטר מבועות. </li></ol> 2.4 כדורית אדומה תמוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כל המזרקים על משאבות נאות הרווארד כמפורט להלן: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט שני מזרקים 30 מ"ל (אחד המכיל סטרילי, דה מיוננים מים והשני עם 2X PBS, PFA 2%) יחד על המשאבה הרווארד מזרק גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מזרק 1 מ"ל (המכיל 1X PBS) על המשאבה הרווארד מזרק קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את צינור מוצא ב אספן פסולת (50 מ"ל צינור חרוטי אשר מתויג waste). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד מזרק גדול (עם מזרקים 30 מ"ל) ולתת לו לרוץ במשך דקה אחת. (ודא שאין בועות ואין דליפה במכשיר או בצינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד מזרק קטן ולתת לו לרוץ במשך דקה נוספת. (ודא שאין בועות ואין דליפה במכשיר או בצינור). עצור את המשאבות. המכשיר מיקרופלואידיקה עכשיו הוא מוכן לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המזרק 1 מ"ל המכיל 1X PBS מהמשאבה הרווארד מזרק קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קבלת דגימת דם, למלא את המזרק עם 1 מ"ל של 0.05 מ"ל סטרילי 1X PBS ללא השמנה כל הבועות. בשלב הבא, למלא את המזרק עם 0.5 מ"ל של דם המתקבל הצינור Eppendorf. (מזרק 1 מ"ל כעת להכיל נפח הסופי של 0.55 מ"ל של דם ושל חיץ 1X PBS). הערה: שמור את המזרק אנכי בעת מילוי כדי למנוע ערבוב של 0.05 מ"ל PBS בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מזרק המכיל את הדם אל מפרצון 1 ו - הר את המזרק בזהירות (שלא לדחוף את הדם דרך צינורות לתוך המכשיר) על המשאבה הרווארד מזרק קטן (את המזרק הוא רכוב אנכי לתוך המשאבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור מוצא מהצינור פסולת לשים צינור נקי צנטריפוגה 50 מ"ל במקומו והניח אותה על דלי של קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד גדול מזרק הראשון ולתת לו לרוץ במשך דקה 1. התחל באיסוף מדגם משקע לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה הרווארד מזרק קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימת דם מזרק 1 מ"ל נסעה לחלוטין דרך המכשיר, לעצור שני משאבות. זה אמור לקחת בערך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם שנאספו במשך 5 דקות ב 350 XG בטמפרטורת החדר עם מהבלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ידי הצבת קצה פיפטה בצד הנגדי של גלולה לבנה. הסר כמו supernatant כמה פסולת, אפשרי תא אדום במיוחד, מבלי להפריע גלולה לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המדגם ב 1 מ"ל של חיץ זרימה (1X PBS, 1% BSA [שור אלבומין בסרום], 2% PFA) על ידי pipetting למעלה ולמטה. העברת מדגם צינור 1.5 Eppendorf מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge המדגם נאספו במשך 5 דקות על XG 4 בטמפרטורת החדר. השתמש דיוק כמו קודם להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend המדגם מ"ל 1 של חיץ תזרים ידי vortexing. </li></ol> 2.5 הכנה לניתוח זרימת cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח מדגם באמצעות cytometry זרימה, להוסיף 100 μl של מדגם צינור cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי μl 100 המדגם להוסיף נוגדן שצוין (להבטיח ריכוז נכונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המדגם כדי לדגור במשך 30 דקות ב 40 ג </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם חיץ תזרים לפני cytometry הזרימה. צעד לשטוף כוללת הוספת 250 μl של חיץ זרימה, vortexing, centrifuging במשך 5 דקות ב 350 XG, והסרת supernatant עם תור של צינור נוזל cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 250 μl של חיץ לזרום. לדוגמה מוכן לניתוח על ידי cytometry הזרימה. </li></ol> נציג תוצאות דם שלם הופעל דרך המכשיר תמוגה microfluidic שלאחר עיבוד פרוטוקול, ridding של אריתרוציטים ומעשיר במחזור התאים בעלי הגרעין (CNCs). תוצאות אידיאלי תניב תזרים נקי cytometry פיזור העלילה עם אוכלוסיות נפרדות CNC. הוצג להלן דמויות 2 ו -3 הם העלילה פיזור השוואות של דגימת דם שלם בלי תמוגה כדורית אדומה עם תמוגה כדורית אדומה ידי פרוטוקול microfluidic עם צירים כמו פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) אור. ניתן לראות כי פרוטוקול העשרה microfluidic הוא הכרחי כדי להשיג תזרים נקי cytometry העלילה פיזור. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Cytometry זרימה פיזור העלילה של כל דגימת דם ללא תמוגה כדורית אדומה עם FSC וגרזנים SSC. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Cytometry זרימת העלילה פיזור של מחזורי התאים בעלי הגרעין עם תמוגה כדורית אדומה microfluidic שכותרתו ידי אוכלוסיות עם FSC וגרזנים SSC. אזור 1 (אדום) מייצג לימפוציטים, אזור 2 (ירוק) מייצג מונוציטים, אזור 3 (כחול) מייצג גרנולוציטים, ואזור 4 (סגול) עדיין לא מאופיין. סילוק פסולת תא אדום על ידי פיפטה בפרוטוקול חשוב גם בעת הצורך. להלן באיור 4 הוא העלילה פיזור מראה עודף של פסולת תא אדום. למרות שלא ערפול העלילה פיזור כמו באיור 2, צריך להסביר את האירועים הוסיף בשל פסולת כדורית אדומה במהלך ניתוח הנתונים. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים פסולת תא אדום, כפי שניתן לראות באשכולאירועים באזור 5 (ציאן). תאים מכתים עבור סמנים פנוטיפ מסוים נוגדנים יהיה גם להפיק תוצאות אופייני. בנתונים הבאים פנוטיפ נוגדן כתמים עבור 3 אוכלוסיות לויקוציטים שונים: לימפוציטים, מונוציטים, ו גרנולוציטים. איור 5 מתאר אוכלוסיות לימפוציטים זממו עם גרזנים CD3 CD4 ו. גרנולוציטים ומונוציטים ו מוצגים איורים 6-7 עם צירים כמו FSC לעומת CD14 ו CD66b, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים לימפוציטים עם CD3 CD4 וגרזנים. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים מונוציטים עם FSC ו CD14 צירים. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7. Cytometry זרימת העלילה פיזור המתארים גרנולוציטים עם FSC וגרזנים CD66b.

<ol><li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+%28SCD%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li>
<li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li>
</ol>

תמוגה אוטומטיות microfluidic פרוטוקול בדם דווחה. בתוך הפרוטוקול הם צעדים קריטיים ראוי לציין. בסעיף P.2.1, חשוב להשליך את הבקבוקון הדם הראשונה שנאספו במדגם מכיל וחילצה לתאי אנדותל בוגרים מתנהג כמו חיוביות שגויות. ודאו גם להפעיל את דגימת דם בתוך שעה של אוסף. תחול המכשיר microfluidic בסעיף P.2.2, חשוב תחילה להיפטר הבועות. בנוסף, יש למנוע החדרת בועות בעת צירוף מזרקים חדשים המחטים לאורך הפרוטוקול. כאשר ממלאים את המזרק 1 מ&quot;ל דם בסעיף P.2.4, יש לזכור תחילה להוסיף 1X PBS ואת הדם, כל ...

תמוגה אוטומטי microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

בדו&quot;ח זה פרוטוקול עבור מכשיר אוטומטי תמוגה microfluidic דם מפורט. במחזור התאים בעלי הגרעין (CNCs), כולל לויקוציטים ותאי האנדותל, לספק פלטפורמה אידיאלית עבור מצב עדכנית על מצב המערכת החיסונית של אדם. פרוטוקול microfluidic מאפשרת העשרה של CNCs ללא הפסד תא סלקטיבית הכנת המדגם השתנות עקב המשתמש בתיווך צעדים. בקצרה, הפרוטוקול כולל ייצור המכשיר, אוסף מדגם, הגדרת המכשיר, והפעלה הדם דרך תא microfluidic. בתוך המכשיר הדם כולו מעורבב במהירות של כ 10 שניות בתוך 50 מיקרון ערוץ x 150 microfluidic מיקרון עם מים deionized. בזמן הזה הם אריתרוציטים תוחלת lysed בשל תנאי hypotonic. מבנים אדרה בתחתית הערוץ להבטיח ערבוב יסודי חשיפה של תאים לסביבה קבוע. התאים הנותרים הם חזרו לתנאים איזוטוני ביציאה של המכשיר, שימוש קבוע paraformaldehyde 2%, centrifuged להפריד פסולת כדורית אדומה מן CNCs, ותלויה חיץ זרימה עבור מכתים וניתוח על ידי cytometry הזרימה. תוצאות להראות נקי cytometry זרימה פיזור חלקות עם אוכלוסיות CNC נשמר. המשמעות של המכשיר הזה מגיע פרוטוקול במחקר והבנה של בהיווצרות המחלה על ידי ניתוח של אוכלוסיות CNC. לפיכך, אוטומציה, יעילות, ופשטות של פרוטוקול microfluidic הם הפגינו.

מכשיר אוטומטי microfluidic פותחה עבור במחזור העשרה תא גרעיני מן הדם ההיקפיים באמצעות תמוגה כדורית אדומה המבטיח בידוד המדגם באיכות גבוהה ללא אובדן התא.

תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

בדוח זה מפורט הפרוטוקול עבור התקן מיקרופלואידי אוטומטי להליזה של דם. תאים גרעיניים סירקולטוריים (CNCs), כולל לוקוציטים ו...

להעשרה של תאים גרעיים במחזור הדם מדגימות דם. תחילה מכינים את ההתקן המיקרופלואידי באמצעות שטיפה ב-one XPBS להסרת בועות; לאחר מכן מעבירים דרך ההתקן באמצעות משאבות מזרקה מים דה-יוניים ו-2%paraldehyde ב-two XPBS לפני טעינת דגימת הדם. לאחר מכן, הדם מעובד דרך ההתקן המיקרופלואידי ונאסף; עיבוד הדגימה לאחר הפעולה כולל סנטריפוגציה והסרה של העילאי.לבסוף, הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטריית זרימה ליצירת תרשימי fax. שלום, אני ויליאם וייט מהמעבדה לביוטכנולוגיה במיקרו-קנה מידה במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת וול. היום נראה לכם הליך להעשרה של תאי גרעין סובבים באמצעות ליזיס של דם מלא באמצעות מיקרופלואידיקה.אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור דלקת בתהליכי מחלה שונים, וזאת כדי להבטיח העשרה של לוקוציטים ותאים גרעיניים סחרריים אחרים ללא אובדן או הפעלה. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, התאימו צינור גישה שקוטרו גדול במעט מחורי הגישה של הערוץ בחורי הכניסה והיציאה.כדי לספק את הממשק בין המקרו למיקרו, חברו מחט מזריק במידה 30 gauge לצינור בכל אחת מהכניסות. לאחר מכן, מלאו מזריק של ਇੱਕ מיליליטר ב-one XPBS, תוךما וידוא שאין בועות אוויר. חברו את המזרק לכניסה אחת ודחפו את המזרק בעדינות ביד עד ש-one XPBS יזרום החוצה מכניסה שתיים.לאחר מכן, סגרו מיד את כניסה שתיים באמצעות תליש (binder clip). המשיכו לדחוף את המזרק עד שפתרון 1X PBS יגיע לפתח היציאה של המכשיר המיקרופלואידי. ברגע שהפתרון זורם מהיציאה, סגרו את צינור היציאה באמצעות תליש נוסף.המשיכו לדחף את מזרק ה-1 mL עד ש-XPBS יזרום החוצה מפתח כניסה 3, וסגרו את פתח כניסה 3 באמצעות תפס דפים שלישי. כעת התקן המיקרופלואידי מוכן ומלא בנוזל (primed). התחילו בכיול משאבות המזרקים עם משאבת המזרקים הגדולה של Harvard, כאשר הגדרת הקוטר היא 22.5 millimeters וקצב הזרימה הוא 600 µL per minute.עבור משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. הגדירו את תצורת הקוטר ל-4.61 millimeters ואת קצב הזרימה ל-20 microliters per minute. לאחר מכן, מלאו מזרק אחד של 30 milliliter במים דה-יוניים על ידי שאיבת תמיסה ישירות מהמבחנה הקונית של 50 milliliter.זכרו לסמן את המזרק, מלאו מזרק נוסף של 30 milliliter בתמיסת 2%paraform aldehyde ב-two XPBS. שוב, שאבו ישירות ממשפחית (conical tube) וסמנו את המזרק. כעת חברו את המזרק המכיל מים לכניסה שתיים ואת המזרק עם 2%para formaldehyde ב-two XPBS לכניסה שלוש, תוךما וידוא שאין בועות כלואות בצינוריות או במכשיר המיקרופלואידי.לאחר מכן, הסירו את התסמיכים מהכניסה השנייה, מהכניסה השלישית ומהצינור של היציאה, כאשר כל שלוש המזרקים מחוברים. המשיכו להניח את שני המזרקים הגדולים יחד על משאבת המזרקים הגדולה של Harvard והניחו את המזרק של 1 mL על משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. מקמו את צינור היציאה בתוך מבחנה קונית של 50 mL לאיסוף פסולת.כעת הפעילו את משאבת המזרקים הגדולה של Harvard המחזיקה את המזרקים בנפח 30 מיליליטר והניחו לה לפעול למשך דקה אחת. בדקו שאין בועות ושאין דליפות במכשיר או בצינוריות. לאחר מכן, הפעילו את משאבת המזרקים הקטנה של Harvard והניחו גם לה לפעול למשך דקה נוספת.בדיקה לנוכחות בועות ודליפות. עצירה של המשאבות לאחר שתי דקות. כעת, כאשר ההתקן המיקרופלואידי מוכן לשימוש עם דגימות דם, דגימות הדם המיועדות לניתוח נאספו כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, ונעשה בהן שימוש בתוך שעה אחת מרגע האיסוף.את המבחנה הראשונה של הדם שנאסף משליכים כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. הסירו את מזרק ה-one milliliter ממשאבת המזרקים הקטנה של Harvard, ולאחר מכן הגזירה XPBS אחת באמצעות מזרק ה-one milliliter תוך מילוי מחט המזרק. כדי למנוע כניסת בועות, מלאו מזרק one milliliter ב-50 microliters של XPBS אחת ללא כליאת בועות.לאחר מכן, מלאו את המזרק ב-0.5 milliliters של דם. החזיקו את המזרק במצב אנכי בזמן המילוי כדי למנוע ערבוב של ה-PBS עם הדם. לאחר מכן, חברו את המזרק המכיל את הדם חזרה לכניסה אחת.נגבו כל עודף של נוזל והרכיבו את המזרק בצורה אנכית על משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. היזהרו לא לדחוף את הדם דרך הפבינג אל תוך המכשיר. הוציאו את צינור היציאה מצינור הפסולת והניחו אותו בתוך מבחנת צנטריפוגה נקייה של 50 milliliter המונחת בדלי קרח.כעת התחילו את ההרצה; הפעילו תחילה את משאבת המזרקים הגדולה של Harvard והניחו לה לפעול במשך דקה אחת. לאחר מכן, הפעילו את משאבת המזרקים הקטנה של Harvard. הדגימה תתחיל להיאסף מצינור היציאה אל תוך מבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter.הניחו לדגימת הדם במזרק של מיליליטר אחד לעבור באופן מלא דרך המכשיר, פעולה שארכה כ-20 דקות. לאחר מכן הפסיקו את שתי המשאבות. כעת, כאשר ההרצה הושלמה, סבבו במערבל צנטריפוגי את הדגימה שנאספה למשך חמש דקות ב-350 ×g בטמפרטורת החדר ללא שימוש בבלם.הסר את הנוזל העליון (supernatant) על ידי הצבת קצה הפפטה בצד הנגדי למשקע הלבן. הסר כמה שיותר נוזל עליון, ובמיוחד שיירי תאי דם אדומים, מבלי להפריע למשקע הלבן. השהה מחדש את הדגימה ב-1 ml של flow buffer המכיל 1%BSA ו-2%para formaldehyde ב-one XPBS באמצעות פפיתה.העבירו את הדגימה לשפרוret מיקרו-צנטריפוז'ה בנפח 1.5 milliliter, וסבבו את הדגימה שנאספה למשך חמש דקות ב-4×g. בטמפרטורת החדר, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות, כפי שבוצע בשלב הצנטריפוגציה הקודם. לבסוף, הוסיפו 1 milliliter של flow buffer, ערבבו ב-vortex כדי לתלה מחדש את הדגימה, והמשיכו בניתוח הדגימה באמצעות flow cytometry.כעת נציג מספר תוצאות מייצגות בצורת תרשימי FACS מדגימת דם שהועשרה באמצעות המכשיר המיקרופלואידי, עם ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. את חשיבות ההעשרה באמצעות ליזיס ניתן לראות בתרשים FACS שבו תאי דם אדומים יוצרים ענן. תרשים הפיזור שהתקבל מפרוטוקול ההעשרה המיקרופלואידי הוא תרשים פיזור נקי עם אוכלוסיות מוגדרות של תאים גרעיים שנמצאו במחזור הדם.האזור האדום מייצג לימפוציטים, הירוק מייצג מונוציטים, הכחול מייצג גרנולוציטים, והאזור הסגול טרם אופיין. אי-הסרה של שאריות תאי דם אדומים בפרוטוקול גורמת להצטברות אירועים בגרף ה-fax הנראה באזור הציאן. ניתן להציג אוכלוסיות של תאים בגרפי fax נפרדים.לימפוציטים שזוהו באמצעות CD three ו-CD four. מונוציטים שזוהו באמצעות CD 14 וגרנולוציטים שזוהו באמצעות CD 66 P. הרגשנו הרגע כיצד להכין ולהריץ דגימת דם באמצעות מכשיר הליסיס המיקרופלואידי לדם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להריץ את דגימת הדם באופן מיידי כדי למנוע ערבוב של ה-PBS עם הדם לפני הכניסה למכשיר, וכדי למנוע חדירת בועות אוויר לתעלות המכשיר.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה לא אנזימטית מהירה של שברי רקמות אנושיות טריות לצורך הערכה איכותית וכמותית של תאי CD45+ (לימפוציטים/לויקוציטים) הקיימים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות. בנוסף, ניתן לאסוף ולאחסן את הסופרנטנט המתקבל מהרקמה הראשונית הומוגנטית לצורך ניתוח או ניסויים נוספים.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

מטרת פרוטוקול זה היא לייצר תאי T בדרגה קלינית ספציפיים לפתוגן באמצעות מכשיר העשרת תאים אוטומטי מהדור השני המשלב מערכת לכידת ציטוקינים סגורה ואינו דורש צוות ייעודי או שימוש במתקן GMP. תאי T ספציפיים ל-pp65 שנוצרו יכולים להינתן ישירות לחולים.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

במחקר זה, נדגים שיטה ללא תווית נויטרופילים ההפרדה מן הפרשות דרכי הנשימה קליניים באמצעות לולאה סגורה הפעולה של ספירלה מיקרופלואידיקה אינרציאלית. השיטה המוצעת ירחיב את מבחני קליניים במבחנה למחלות בדרכי הנשימה שונים.

העשרה ללא תווית נויטרופילים של הפרשת נגזר המטופל דרכי הנשימה באמצעות לולאה סגורה אינרציאלית מיקרופלואידיקה

האפיון של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) הוא נושא פופולרי במחקר טרנסלtional. פרוטוקול זה מתאר את הטיפול באופן אוטומטי למחצה החיסונית (IF) לאפיון PD-L1 וספירה של CTCs בסרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) מטופלים דגימות.

Semi-אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאים סרטניים במחזור בין שאינם קטנים תאים סרטן ריאות חולים על ידי Immunofluorescence

פרוטוקול זה מפרט שיטה תואמת אוטומציה בתפוקה גבוהה לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים למטרות ביו-בנקאות ולמטרות אחרות.

בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים ממעילי באפי באמצעות הפרדת חרוזים אימונומגנטית בתפוקה גבוהה

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.

שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה

למדו שיטת העשרה אוטומטית של תאים גרעיניים מדם באמצעות מכשיר מיקרו-זרימה. הפרוטוקול מבטיח בידוד דגימות באיכות גבוהה עם אובדן תאים מינימלי לניתוח זרימה ציטומטרית.

תמוגה אוטומטי Microfluidic דם פרוטוקול העשרה של מחזורי תאים גרעיני

גלה סרטונים נוספים