Name: תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: למדו טכניקת רישום תא בודד מקוניות עכבר באמצעות אלקטרודת שאיבה. השיטה כוללת ניתוח רשתית ורישום תגובות פלאש לחקר פיזיולוגיה רטינלית ומחלות עין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של מחקר כדי למנוע עיוורון, NIH מענק EY 019312, ולהעניק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון ו EY 02,687 (מחלקת עיניים &amp; חזותית למדעים באוניברסיטת וושינגטון).

ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את האלקטרודות הקלטה באמצעות חולץ micropipette וללטש את האלקטרודות עם נימה חימום תחת מיקרוסקופ. להקלטת עכבר תא בודד חרוט יניקה, הקוטר הפנימי על קצה האלקטרודה הוא כ 6-7 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות התייחסות. לשקול אגר 1% מים מזוקקים. ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו את pipettes זכוכית (L = 100 מ&quot;מ, OD / ID = 1/0.75 מ&quot;מ) עם אגר 1% באמצעות מזרק. לחזק את אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את pipettes לחצאים באמצעות סכין יהלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את האלקטרודות בתמיסה התייחסות התייחסות לפחות 24 שעות 4 ° C. </li></ol> הגדרת הניסוי <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dark להסתגל עכבר בכלוב שחור לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל התייחסות פתרון 1 זלוף L פתרון (ראה להלן) ולסנן את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים BSA 0.1% ו 10 מ&quot;מ פתרון גלוקוז 20 מ&quot;ל התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את עוצמת האור של ממריץ האופטי באמצעות פוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית הקלטה על הבמה של המיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה זלוף פתרון עם 95% O 2 / 5% CO 2, דגירה אותו באמבט 40 מעלות צלזיוס מים כדי להגדיל את מסיסות של CO2. הפתרון זורם מהבקבוק לתא הקלטה עובר דרך הנגד קרמיקה ההתחממות אותה 36-38 ° C. החימום צריך להיות ממוקם קרוב לתא הקלטה ככל האפשר, רצוי בשלב של המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את ווסת הזרימה עבור קצב זרימה של כ 1-1.5 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את האלקטרודה פתרון ההקלטה עם הפניה. הכנס את אלקטרודה בעל אלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה. הר בעל על headstage של המגבר. חבר את מחזיק למכשיר שאיבה, אשר בנויה על ידי חיבור צינורות מלא חלקית עם שמן מינרלי לנמל בצד של בעל אלקטרודה. בקצה השני של הצינור מחובר מאגר קטן של שמן מינרלי, שבה הלחץ יכול להיות מיושם על ידי הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה התייחסות הקוטב השני של headstage. Bind הזוג תרמית (TC) אל האלקטרודה התייחסות. ודא טיפים אלקטרודה TC הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב לתא האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תאורה אינפרא אדום כדי להמחיש את האלקטרודה. אלקטרודה היא נצפים על ידי מצלמת אינפרא אדום המחובר לצג. במרכז התמונה אלקטרודה על שדה הראייה של המסך באמצעות מניפולטור מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקום של קרוב אלקטרודה קצה הפניה (2-4 מ&quot;מ) אל קצה האלקטרודה ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח DC עבור החימום כך את הטמפרטורה של הפתרון הוא על 36-38 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל בדיקה חותם כדי לבדוק את ההתנגדות של האלקטרודה הקלטה, בדרך כלל על 900 kΩ. </li></ol> בידוד הרשתית העכבר <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר מותאם כהה עם CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. סמן את העיניים בעזרת קצה של לפיד מתכת לוהטת על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין מעט. Enucleate את העיניים בעזרת מספריים. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect את העיניים תחת מיקרוסקופ עם תאורה אינפרא אדום וממירים התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר כמה שיותר הזגוגית האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקליט M-חרוט התגובות, להסיר את החלק הגחוני של עיינית 4 בסכין גילוח אם לשפוט על פי סימן כויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הרשתית מהשכבה אפיתל הפיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחו את הרשתית ולשים אותו על החלק התחתון של צלחת פטרי מלאות פתרון מ&quot;ל 1-2 התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את הרשתית לחתיכות קטנות דק בעזרת סכין גילוח ו דגירה הכנת בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור. </li></ol> הקלטות <ol start="25" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבו את התנור באופן זמני. החלף את זרימת זלוף אל צינור עוקף כדי למנוע את תא מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את רוב הפתרון בחדר באמצעות פיסת רקמה Kimwipe. מעבירים את ההשעיה הרשתית לתא הקלטה בעזרת פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כ -2 דקות עד פרוסות הרשתית להתיישב. כבה את זלוף בחזרה. הפעל את החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תאורה אינפרא אדום כדי להמחיש את ההכנה. חיפוש עבור פיסת של הרשתית שוכב על החדר עם פלחי photoreceptor החיצוני בולטות (ראה איור למשל). צייר חלקים פנימיים בעדינות לתוך האלקטרודה על ידי יניקה. בתצורה זו, כמה גרעינים וקטעי הפנימי צריך להיגרר האלקטרודה. הקלט את photoresponse להבהב בהיר כדי לבדוק אם קטע חרוט הפנימי הוא האלקטרודה והאם התא לרפאכמוך, אם לשפוט לפי התגובה קינטיקה משרעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את מאגר המינרלים להפעיל לחץ שלילי קל עד קצה האלקטרודה כדי לעזור להחזיק את פלח הפנימית האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן פלאש שיא ותגובות עמום לעוצמת בהיר פעם תא טוב נמצא. גלי מבחן ניתנים מתוך גירוי אופטי מכויל 5. עוצמת פלאש הגל נשלטים על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי וצר התערבות מסננים הלהקה, בהתאמה. מבחן משך פלאש (20 מילישניות) נשלטת על ידי מחשב מונחה התריסים. </li></ol> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף פתרון עכבר: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinate, 0.5 mM Na גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטה עכבר פתרון אלקטרודה: 140 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 3 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4), 0.02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

תא בודד הקלטה יניקה מן התאים קולטי האור פותחה 3 עשורים. זה מאפשר לנו להקליט קרום טרנס השינוי הנוכחי המושרה על ידי גירוי האור מבלי לחדור קרום התא. בגלל הידבקות תאים תאים גבוהה, קשה לבודד את מוט יחיד חרוט בריא מן הרשתית כמו עכבר הרשתית דוחי וקשה למצוא קונוסים בודדים בשל אחוז נמוך (3%) וגודל קטן. קטע הפנימית ב-(IS-in) שיטת הקלטה מתגבר על קושי זה על ידי הקלטה הנוכחי מן המגזרים הפנימי של photoreceptors כמה, ביניהם חרוט יכול להיכלל. בשנת העכבר סוג בר, התגובה צריכה להיות שילוב של מוטות ק...

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

רוד חרוט קולטני האור ברשתית אחראים לגילוי האור. בחושך, מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) ערוצי בקטע החיצוני פתוחים ולאפשר קטיונים לזרום פנימה בהדרגה על פני קרום, depolarizing התא. חשיפה לאור מעורר את סגירת הערוצים CNG, חוסם את זרימת קטיון פנימה הנוכחי, ולכן התוצאות hyperpolarization התא. בהתבסס על הקוטביות של קולטני האור, שיטת ההקלטה יניקה פותחה בשנות ה -1970, שבניגוד טכניקת התיקון-clamp קלאסי, אינו מחייב לחדור הממברנה הפלסמטית<sup&gt; 1</sup&gt;. ציור קטע החיצוני לתוך פיפטה כוס בחוזקה, הולם מלאים פתרון תאיים מאפשר הקלטה השינויים הנוכחית תאים בודדים בחשיפה מבחן פלאש. עם זאת, ומבוססת &quot;החיצוני פלח-in (OS-in)&quot; הקלטה יניקה אינו מתאים הקלטות חרוט העכבר, בגלל האחוז הנמוך של חרוטים ברשתית העכבר (3%) ואת הקשיים בזיהוי חרוט החיצוני מגזרים. לאחרונה, קטע הפנימית ב-(IS-in) הקלטה תצורה פותחה כדי לצייר את המקטע הפנימי / אזור הגרעין של photoreceptor לתוך פיפטה הקלטה<sup&gt; 2,3</sup&gt;. בסרטון הזה, אנו מראים כיצד להקליט מאדם חרוט photoresponses עכבר באמצעות תא יחיד אלקטרודה יניקה.

אנחנו נראה איך להקליט תגובות פלאש מן קונוסים עכבר בודד באמצעות אלקטרודה יניקה.

פוטורצפטורים מסוג פיתון (rod) וקונוס (cone) ברשתית אחראים על גילוי אור. בחשיכה, תעלות מופעלות על ידי נוקלאוטיד מחזורי (CNG) במקטע החיצוני...

סרטון זה מדגים את נתיח רשתית העין של עכבר ואת ההקלטה העוקבת של תאי קונוס (cones) בשיטת suction recording של תא בודד. גלובולי העין של עכבר שהורדה בשיטה הומנית לאחר התאמה לחושך נצרבות בחלק הדורסלי ומוצא מהן הגרעין תחת תאורה אדומה עמומה. לאחר מכן, גלובולי העין נחתכות לחצאים.לאורך הקו המשווה, מסירים את הקרנית ואת החלקים הגבניים (ventral) של גלגלי העיניים. את הרשתית הגבנית (dorsal) מפרידים משכבת אפיתל הפיגמנט, וחותכים לחתיכות קטנות ודקות באמצעות להב תער. פרוסות הרשתית מונחות לאחר מכן בתא ההקלטה המותאם לשולחן המיקרוסקופ.מספר גופי תאים של פוטורצפטורים נשאבים לתוך אלקטרודת ההקלטה. כאשר פוטורצפטור מסוג קונוס נשאב לאלקטרודה, הבזק בדיקה בהיר יעורר תגובה פוטית עם אמפליטודה הגבוהה מ-4 picoamps. שלום, אני ג'ין מהמעבדה של ד"ר מיר קופס במחלקה לאופתלמולוגיה וחושים חזותיים באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.היום נציג בפניכם פרוצדורה להקלטת תגובות פוטו-אלקטריות מפטורצפטורי Moscon בודדים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את תכונות ההסתגלות של קונוסים (cones) ביונקים, שהם הפטורצפטורים המתווכים את הראייה שלנו בשעות היום. אז בואו נתחיל.יום אחד לפני ההקלטה, בצעו התאמה לחושך. התאימו עכבר על ידי הנחתו בכלוב אטום לאור למשך הלילה. השתמשו בשובך מיקרו-פיפטות כדי לייצר אלקטרודות הקלטה מצינוריות זכוכית בורוסיליקט תחת מיקרוסקופ פתוח.השתמשו בחוט חימום כדי לשרוף. לטשו את קצה כל אלקטרודה כדי להחליקו ולהקטין את פתחו לקוטר הרצוי. עבור שאיבה של תא בודד בקונוס של עכבר, הקוטר הפנימי בקצה האלקטרודה צריך להיות כ-6 עד 7 µm.הכינו תמיסת אגר בריכוז 1% במים מזוקקים. הניחו את התמיסה במים רותחים כדי להמיס את האגר. לאחר שהאגר נמס, העבירו אותו למזרק ומלאו את הפפטות הזכוכית בתמיסה.להכנת אלקטרודות ייחוס, יש להמתין 10 דקות בטמפרטורת החדר עד להתגבשות. לאחר שהאגר התגבש, השתמש בסכין יהלום כדי לחתוך כל פיפטה לחצי ליצירת שתי אלקטרודות ייחוס. הנח את אלקטרודות הייחוס במבחורת סינטילציה מלאה בתמיסת ייחוס והשרה אותן למשך 24 שעות לפחות בטמפרטורה של 4 °C כדי לאפשר לתמיסה לחלחל אל ג'ל האגר.ניתן להשתמש באלקטרודות ייחוס עד שלושה חודשים ממועד ההכנה. אלקטרודות משומשות נשלפות ומושלכות לאחר הניסוי. מערכת ההקלטה מורכבת ממיקרוסקופ הפוך המותקן על שולחן עם בולם זעזועים פניאומטי להפחתת רעשי רעידות, המוגן על ידי כלוב פראדיי להפחתת רעשים אלקטרומגנטיים.מיקרו-מניפולטור ממוטור הוא משמש למיקום של אלקטרודת ההקלטה. הסטיםולטור האופטי מורכב מפילימנט טונגסטן, תריסים המופעלים על ידי מחשב ומסננים אופטיים לשליטה באורך הגל ובעוצמת האור. מגבר patch clamp משמש לזיהוי זרמי ממברנה מתאי פוטורספטורים בודדים.במהלך ההקלטות, הרקמה תהיה תחת פרפוזיה. הניחו ליטר אחד של תמיפת פרפוזיה מוכנה באמבט מים בטמפרטורה של 40 °C סמוך למערכת ההקלטה. לאחר מכן, באמצעות צינוריות, חברו את תמיפת הפרפוזיה ל-95% oxygen ו-5% carbon dioxide כך שייווצרו בועות באופן רציף.באמצעות פוטומטר, מדדו את הספק האור ללא הנחתה מהסטימולטור האופטי; יש להניח את הגלאי של הפוטומטר על במה של המיקרוסקופ במישור שבו תונח הדגימה. לאחר מכן, המירו את הקריאה הניתנת במיקרו-וואט למספר הפוטונים לסמימטרי מיקרומטר רבוע לשנייה, כדי להעריך את מספר הפוטונים בכל פולס, תוך התחשבות בהנחתת האור על ידי מסנני צפיפות ניטרלית.לאחר מדידת הספק האור ללא הניחות, הסירו את הפוטומטר מהבמה והרכיבו על במת המיקרוסקופ ההפוך את תא ההקלטה שישמש את הניסויים. בעזרת צינוריות, חברו את בקבוק תמיסות הפרפוזיה לתא ההקלטה דרך שסתום ויסות. נתבו את הצינוריות דרך נגד חימום.ודאו שנגד החימום ממוקם מיד לפני תא ההקלטה. לאחר מכן, חברו את צינור העקיפה משסתום הוויסות לתא ההקלטה. התחילו את הפרופוזיה על ידי פתיחה וכיוונון של שסתום ויסות הזרימה לקצב זרימה של 1 עד 1.5 milliliters per minute.תמיסת הפרפוזיה מתנקזת מתא ההקלטה אל בקבוק איסוף באמצעות כוח הכבידה. השתמש במזרק עם מחט קהה כדי למלא את מחזיקי האלקטרודות בתמיסת ייחוס. באמצעות מחט של מזרק microfill, מלא ושטוף את אלקטרודת ההקלטה בתמיסת ייחוס, תוך וידוא שאין בועות בתוך האלקטרודה.החדירו את אלקטרודת הייחוס למחזיק אלקטרודות וחברו אותה לקוטב הייחוס של שלב הראש של המגבר. השתמשו בטבעת גומי כדי לקשור את הזוג התרמי לאלקטרודת הייחוס. ודאו כי קצות האלקטרודה והזוג התרמי ממוקמים קרוב זה לזה כדי להבטיח שקריאת הטמפרטורה תתבצע קרוב ככל האפשר לתא.לאחר מכן, הכניסו את אלקטרודת ההקלטה למחזיק אלקטרודות והרכיבו את המחזיק על שלב הראש (head stage) של המגבר. בעזרת צינורית, חברו מאגר קטן של שמן מינרלי לפתח הצד של מחזיק האלקטרודה. שאיבה עדינה באמצעות הפה דרך הצינורית המחוברת למאגר תמשוך את התא אל תוך האלקטרודה.באמצעות תוכנת המחשב, פתח את אחד התריסים של הגירוי האופטי. כדי להדמיא את שטח קרן הבזק הבדיקה על בסיס המיקרוסקופ, בצע מיקוד של המיקרוסקופ לתחתית תא ההקלטה. באמצעות המיקרו-מניפולטור, העבר את האלקטרודה למרכז שטח קרן בזק הבדיקה.מקם את אלקטרודת הייחוס קרוב לקצה של אלקטרודת ההקלטה. כוון את המתח עבור המחמם כך שטמפרטורת התמיסה בתא ההקלטה תהיה כ-36 עד 38 °C. בצע בדיקת אטימה (seal test), המודדת מתח למשרעת זרם שנקבעה מראש, כדי לחשב את ההתנגדות ולבדוק את ההתנגדות של אלקטרודת ההקלטה, שהיא בדרך כלל כ-900 kΩ.בדיקת האיטום מאפשרת זיהוי בועות באלקטרודות ההקלטה או הייחוס, או זיהוי גודל קצה לא מתאים של אלקטרודת ההקלטה. בדיקת האיטום נשלטת תוכניתית על ידי תוכנת הרכישה clamp X. קריאת ההתנגדות מוצגת על מסך המחשב. אם ההתנגדות נמוכה מדי, פחות מ-500 kilo ohms, קצה האלקטרודה כנראה גדול מדי ויהיה צורך להתקין אלקטרודה חדשה.אם ההתנגדות גבוהה מ-one milli ohm, ייתכן שקיימת בועה באלקטרודה או שהקצה שלה צר מדי, ובמקרה כזה יהיה צורך לשטוף את האלקטרודה או להחליפה. לאחר שמכשירי ההקלטה מוכנים לשימוש, הכין את פרוסות הרשתית לניסוי תחת תאורה אדומה עמומה; השתמש בקצה מחט הדיסקציה החמה כדי לצרוב את הסקלרה בנקודה הדורסלית ביותר של כל גלגל עין של עכבר שעבר הרדמה והיה מותאם לחושך. לאחר מכן, בצע גרעיון (nucleate) לגלגלי העיניים באמצעות מספריים.השתמשו בפינצטה קהה כדי להעביר את גלובולי העין למיקרוסקופ דיסקציה המצויד בתאורת אינפרא-אדום וממירי תמונה באינפרא-אדום. כל פעולות הדיסקציה הבאות יבוצעו תחת אור אינפרא-אדום. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-מספריים, חתכו את גלובול העין לאורכו של קו המשווה, למעט בנקודת הצריבה.השתמשו בפינצטה חדה כדי להסיר את העדשה. לאחר מכן, הסירו כמה שיותר מהזגוגית (vitreous), כאשר נקודת הצריבה תשמש כנקודת ייחוס. השתמשו בלהב תער כדי להסיר את החלק הוונטרלי של גביע העין.לאחר מכן הסר את הקרנית. בשלב הבא, השתמש בפינצטה כדי לקלף את הרשתית הגבית (dorsal retina) משכבת אפיתל הפיגמנט. לאחר מכן, הנח את הרשתית כאשר צד הקולטנים פונה כלפי מעלה בתחתית של צלחת פטרי חדשה הממולאת ב-1 עד 2 מיליליטר של תמיסת ייחוס גלוקוז 10 millimolar עם 0.1%BSA, ולחץ בעדינות על הרשתית באמצעות להב תער כדי לשטחה.חתוכו את הרשתית לחתיכות קטנות ודקות. לאחר מכן, הדגרימו את התכשיר בתיבה מסוג תא תאורה הרוויה באופן רציף בחמצן טהור, לפני הוספת פרוסות הרשתית לתא ההקלטה. כבו את המחמם באופן זמני.העבירו את זרימת הפרופוזיה (profusion) לצינור המעקף. לאחר מכן, בעזרת נייר ניגוב Kimwipe, נקזו את מרבית התמיסה מהתא. הדליקו את התאורה האינפרא-אדומה.הוצא את תרחיף הרשתית מהאינקובטור והעבר את הפרוסות לתא ההקלטה. באמצעות פיפט העברה בעל פיה רחבה, אפשר לפרוסות לשקוע במשך שתי דקות. לאחר שפרוסות הרשתית שקעו, הפעל מחדש את הפרופזיה הישירה ואת המחמם.זהו חלק מהרשתית שבו המקטעים החיצוניים של הפוטורצפטורים בולטים החוצה. מקם את קצה אלקטרודת ההקלטה מעל השכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית באמצעות שאיבה עם הפה. משוך בעדינות מספר גופי תאים של פוטורצפטורים לתוך האלקטרודה, כאשר התאים נשאבים אל תוכה.בצעו הבזק בדיקה של 20 millisecond באורך גל של 500 nanometer. השינוי בזרם הזורם דרך הפוטורספטור כתוצאה מהאור מייצג את התגובה להבזק הבדיקה. קונוס בריא יפיק אמפליטודת תגובה מקסימלית של ארבע עד שבע pA או pA.בזמן גירוי עם פולס בדיקה לא מנחף. ברגע שנמצא תא מתאים, הורד בעדינות את מאגר שמן המינרלים באופן ידני כדי להפעיל לחץ שלילי קל על קצה האלקטרודה, ובכך לסייע בקיבוע המקטע הפנימי של התא בתוך האלקטרודה. אם התא מגיב, רשום סדרה של תגובות לפולסי בדיקה בעצימות הנעה מהסף ועד לרוויה.באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לקבל תגובות פוטו-חשמליות של קונוסים מפרוסות רשתית של עכבר בעזרת אלקטרודת יניקה. כאן מוצגת חפיפה של מספר הקלטות מאותו תא. תגובות פוטו-חשמליות של קונוס בודד הושרה על ידי הבזקי בדיקה בעוצמה עולה, החל מעוצמה חלשה, המייצרת תגובת סף של כ-1 pA, ועד לעוצמה חזקה, המייצרת תגובה רוויה של כ-5.5 pA.ככל שעוצמת ההבזק עולה, כך גוברת אמפליטודת התגובה הפוטו-חשמלית עד להגעה לרוויה. ההבזקים ניתנים בזמן ששווה לאפס. אנו נדגים כיצד להקליט תגובות פוטו-חשמליות מפוטורצפטורים בודדים של moscon באמצעות אלקטרודת יניקה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להוציא את החלק הרלוונטי של הרשתית, לחתוך את הרשתית לפרוסות דקות, לשמור על האלקטרודה נקייה מבועות ולמזער רעשים מכניים ואלקטרומגנטיים כאחד. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

single-cell-suction-recordings-from-mouse-cone-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

מקור: Kulkarni, M. et al. הדמיה Ca2+ דינמיקה במסופי אקסון קולטני אור חרוטים של רשתית העכבר. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ דו-פוטוני לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור חרוטים של רשתית עכבר טרנסגנית. הוא מתאר את השלבים להכנת פרוסות רשתית, הדמיית חיישני סידן מבוססי FRET וניתוח שינויים פלואורסצנטיים כדי לכמת את רמות הסידן תחת תאורת רקע וגירוי אור.

מיקרוסקופיה דו-פוטונית לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור של חרוט רשתית עכבר

אנו מתארים את ההכנה של פרוסות רשתית דקות ממימיות נמר סלמנדרות...

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

נדגים כיצד להכין פרוסות רשתית מעין העכבר ולתעד תגובות אור בתאי עצב ברשתית. ההליך כולו מתנהל בתנאים מותאמים לחושך.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר דינמיקת 2 + Ca במסופים האקסון של קולטני האור חרוט באמצעות הכנת פרוסה לשעבר vivo של רשתית העכבר. פרוטוקול זה מאפשר מחקרים מקיפים של איתות קונוס Ca 2 + במערכת מודל של יונקים חשוב, העכבר.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

אנו מתארים שיטה להשגת תרבויות ראשוניות של קולטני חרוטים מהרשתית של עוברי עוף והשימוש בה להקרנת תוכן גבוה.

תרבויות מועשרות חרוט מן הרשתית של עוברי עוף ללמוד מוט כדי חרוט אינטראקציות הסלולר

למדו טכניקת רישום תא בודד מקוניות עכבר באמצעות אלקטרודת שאיבה. השיטה כוללת ניתוח רשתית ורישום תגובות פלאש לחקר פיזיולוגיה רטינלית ומחלות עין.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

גלה סרטונים נוספים