ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

למכשיר ההכנסה ההיפוקסי יש שישה עמודים המקננים לבארות של שישה. גז צלחת באר זורם על פני הרשת המיקרופלואידית בבסיס העמוד ויכול להתפזר על פני קרום ה-PDMS החדיר לגז, ולהפריד בין רשת הגז לאמצעי התרבית. מכשיר זה ממזער את אורך נתיב הדיפוזיה בין מקור החמצן, הרשת המיקרופלואידית בבסיס העמוד והתאים ומאפשר ריכוז חמצן מהיר יותר. שיווי משקל.

המכשיר גם מאפשר שליטה רבה יותר על הדפוס המרחבי של החמצן החשוף לתאים, אשר נקבע על ידי תכנון רשת הגז המיקרופלואידי שנעשה על ידי פוטוליתוגרפיה סטנדרטית באמצעות מסכות צילום. היי, אני שון ארד מהמעבדה של ד"ר דיוויד אדינגטון במחלקה לביו-הנדסה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. היי, אני גם אלי ממעבדת אדינגטון.

היום נראה לך כיצד לייצר, לאמת ולהשתמש במכשיר מותאם אישית כדי לחשוף תרביות תאים במבחנה בצלחת פי שישה לריכוזי חמצן שונים. השתמשנו בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את השפעת החמצן על ריפוי פצעים, יצירת מיני חמצן תגובתיים ונדידה. אז בואו נתחיל.

כדי להתחיל בייצור של התוספת המחמצנת, הכינו פולימתיל סלואן או PDMS ביחס של 10 לאחד בין קדם פולימר לחומר ריפוי. על פי הוראות היצרן, תערובת ה-PDMS מתווספת לתבנית מעובדת בעבר של Dell בדוגמת חיקוי הצורה של צלחת תרבית סטנדרטית של שש בארות. לאחר ריפוי ב-75 מעלות צלזיוס בן לילה, מערך העמודים היצוק המשוכפל שנוצר יהווה את הראשון מבין שלושת המרכיבים המרכיבים את התוספת המחמצנת על מנת לייצר את מרכיב המפתח השני של התוספת המחמצנת.

מאסטר SU 8 מוכן על ידי סיבוב ראשון SU 8 21 50. על פרוסת סיליקון מורחים מסכת צילום על הפרוסה וה-SU 8 נחשף ל-UV דרך מסכת הצילום ליצירת תבנית מאסטר בעובי מיקרו-ערוץ של 300 מיקרומטר. יוצקים PDMS על גבי ה-SU 8 Master ומרפאים במשך שעתיים ב-75 מעלות צלזיוס כדי להניב תבנית חיובית שבסופו של דבר תיצור את המיקרו-תעלות בתחתית כל עמוד.

הרכיב השלישי של המכשיר מיוצר על ידי סיבוב PDMS על פרוסת סיליקון ב-500 סל"ד למשך 10 שניות, ולאחר מכן 900 סל"ד למשך 30 שניות כדי להשיג מוח ממברנה בעובי 100 מיקרומטר. מכיוון ש-PDMs חדירים לגז, ניתן להעביר חמצן לתעלות המיקרו ישירות דרך ממברנה זו. לאחר הכנת כל הרכיבים, כל משטח מליטה נתון לטיפול בפלזמת חמצן למשך דקה אחת.

באמצעות מכשיר פלזמה כף יד חבר תחילה את ששת רכיבי המיקרו-ערוצים למערך העמודים, ולאחר מכן נקב שני חורים בכל עמוד כדי לשמש ככניסות ויציאות הגז. לבסוף הצמידו את הממברנה לתחתית המיקרו-ערוץ כדי להקל על ההדבקה ולגרש בועות. המשטחים המטופלים בפלזמה נלחצים זה לזה במשך כדקה באמצעות התערובת, קצה של זוג פינצטה, ממתינים שעה בין כל הדבקה כדי להבטיח שהמכשיר מחובר לחלוטין וניתן לכיול.

לאחר ייצור מכשיר שלם, יש לכייל את רמת החמצן המתקבלת על ידי התאים בעת שימוש בתוספת החמצן בניסויים בפועל. לצורך כיול השתמש בחיישן חמצן פלואורסצנטי או בשקופית פוקסי, המכילה ציפוי צבע רותניום פלואורסצנטי המרווה על ידי חמצן. שקופיות פוקסי נחתכות מראש כך שיתאימו לתחתית צלחת שש בארות.

יש לחתוך את המגלשה השועלית כדי לכסות כמה שיותר משטח הבאר. מכיוון שהמגלשה השועלית בעובי של כמילימטר אחד, שנה את המכשיר כדי לשמור על המרחק הרצוי לקרום מתאים. דיפוזיה של שקופיות.

מרחק זה תלוי בניסוי, אך ברוב המקרים צריך להיות מתחת למילימטר אחד באמצעות מכשיר הפלזמה הידני בונד ארבע חתך מיקרוסקופ זכוכית בעובי מילימטר אחד. עמודי החלק באורך של כשישה מילימטרים ורוחב של ארבעה מילימטרים לתחתית המכשיר. המכשיר יונח על עמודים על גבי חתך השקופיות.

ניתן להשתמש בהחלקות כיסוי זכוכית גם לפער דיפוזיה של 0.17 מילימטרים כדי לאמת את השימוש בחמצן. בשלושה מיליליטר של מים נטולי יונים בטמפרטורת החדר לבארות של צלחת שש הבארות שם יימדד החמצן. הנח את המכשיר בצלחת ובאמצעות תוכנת metamorph, בחר את המספר והמיקום של המיקומים הרצויים בחיישן השועל.

החלק כדי לבדוק את ריכוזי החמצן. חבר צינורות אקדח טאי בין מיכל גז החמצן למכשיר ההכנסה ההיפוקסי. ווסת זרימה מדויק המוגדר לקצב זרימה של 50 עד 100 מיליליטר לדקה משמש לבקרה עדינה של הגז המועבר.

ודא שווסת הזרימה המדויק סגור. פתח תחילה את הרגולטור העליון של המיכל, ולאחר מכן את הרגולטור המדויק. הפחת את קצב הזרימה בין 10 ל-20 לדקה לאחר 15 דקות.

כדי להימנע מיצירת בועות במים, צפה מקרוב בערך קצב הזרימה במהלך השעה הקרובה ובצע התאמות לפי הצורך מכיוון שירידת הלחץ תשתנה בזמן שהמערכת מאזנת ומשנה את קצב הזרימה כדי ללכוד תמונות של הצלחת וחיישני השועל. נעשה שימוש במיקרוסקופ אולימפוס IX 71 המצויד בפלואורסצנטיות, מצלמת מכשיר זוג טעינה מתוכנת רכישת התמונות Q Imaging Tiga, SRV ו-Metamorpho. המיקרוסקופ מצויד באולימפוס 3 1 0 2 0, מסנן פלורסנט תואם פוקסי עם אורך גל עירור של 475 ננומטר ואורך גל פליטה של 600 ננומטר.

כדי לבדוק את זמן שיווי המשקל ואת מידת החמצון של המכשיר, בחר שלוש נקודות במגלשה השועלית בהן ניתן למדוד את ריכוז החמצן. צלם תמונה של השקופית מיד לפני תחילת זרימת הגז. צלם תמונות ומרווחים של 10 שניות במשך 30 דקות כאשר הגז זורם דרך המכשיר כדי לבדוק הטרוגניות ואספקת חמצן.

קבע מספר נקודות במרווחים של מילימטר אחד המשתרעים על רוחב התעלה ומדוד את ריכוז החמצן על פני הבאר באמצעות מטמורפה. ייצא את עוצמת התמונה הממוצעת עבור כל מיקום והתווה את ריכוז החמצון בהתאם לעוצמת הקרינה. צור עקומת כיול על ידי התאמת עקומות ליניאריות לקו האפס עד 10% וקו 10 עד 21% המתייחס לעוצמת הקרינה לריכוז החמצן עבור כל עמדה נמדדת ניתן לייצא נתוני עוצמה גולמית ממטמורף ולנתח אותם עוד יותר באמצעות Microsoft Excel או תוכנה סטטיסטית אחרת.

לאחר כיול המכשיר, ניסויים כגון מבחני ריפוי פצעים יכולים להתחיל בחיטוי התוספת המכוילת ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות תוך 24 שעות לפני הניסוי ולעבוד איתו במכסה תרבית זרימה למינרית כדי למנוע זיהום לאחר מכן. השרו את תוספת ה-PDMS המעוקרת במדיום נטול סרום למשך 24 שעות כדי לעכב בועות גז בעת החדרה לתרבית בארות הצלחת, תאי MDCK או תאים דבקים אחרים לשטף של 100% בצלחת שש בארות ליצור שריטות ישרות בשכבות המונו עם קצה פיפטה P 200. השריטות מדמות פצעים בשכבה החד-שכבתית הדביקה.

שאפו את המדיה התאית מבלי להפריע לשכבה החד-שכבתית ושטפו עם חמישה מיליליטר מדיה. שאפו שוב ומלאו את הבארות בשלושה מיליליטר סרום חינם. בינוני הכנס בעדינות את המכשיר לצלחת, הקפד להימנע מבועות.

זווית המכשיר במהלך ההחדרה עוזרת להוציא בועות מצד אחד. היזהר להימנע מהפעלת לחץ עודף על המכשיר, שעלול לעוות את ה-PDMS מספיק כדי לרסק את התאים הבסיסיים. הנח את הצלחת והמכשיר על מיקרוסקופ מחומם של 37 מעלות צלזיוס tagה וחבר צינורות ממיכל הגז המקורי ליציאות הכניסה והיציאה של המכשיר.

בחממת התרבית צריך להיות חור כדי לאפשר כניסת צינורות ויש לחבר את הצינור לאחר הכנסת המכשיר לחממה, בצע את אותו הליך להתחלת זרימת הגז כפי שתואר קודם לכן כדי להעריך ריפוי פצעים לכידת תמונות זמן-lapse של התאים כל 20 דקות למשך 15 עד 18 שעות באמצעות ציוד ותוכנת הדמיה כמתואר קודם לכן, ניתן להשתמש באלגוריתם למדידת פצעים כדי לנתח את שטח הפנים הלא נרפא לאחר משך הניסוי הרצוי. עצור את זרימת הגז, הסר את הצלחת והמשך לעיבוד תאים נוסף במידת הצורך. מכשיר ההחדרה ההיפוקסי דורש פחות משתי דקות כדי להתייצב ל-0.5% חמצן כפי שמוצג כאן.

גודל הפער התחתון של ממברנת המכשיר היה גורם קריטי בקביעת יעילות שיווי המשקל עם גדלי פער גדולים יותר הדורשים זמן רב יותר להגיע לערכי ריכוז חמצן במצב יציב. המכשיר גם מאפשר שליטה רבה על החמצון המרחבי בבאר אחת, ומאפשר היווצרות תנאים מרובים ואף יצירת פרופיל חמצן מחזורי על פני הבאר. חד-שכבות של תאי MDCK נחשפו ל-10% או 21% חמצן ושטח הפנים של הפצע נותח לאורך זמן באמצעות אלגוריתם זנב פצע שריטות MATLAB Ts.

לאחר 11 שעות מתוך 17 שעות בסך הכל, 6.87% מהפצע המקורי נשאר כאשר נחשף ל-10% חמצן בעוד ש-64.4% מהפצע נשאר מתחת ל-21%כפי שמוצג כאן, ריכוזי החמצן נמצאים בקורלציה שלילית עם השטח הפתוח של הפצע עבור שני ריכוזי החמצן. למשך הניסוי, זה עתה הראינו לך כיצד לייצר, לאמת ולהשתמש במכשיר ההכנסה ההיפוקסי לבדיקת ריפוי פצעי שריטות. המכשיר מציע מספר יתרונות על פני מערכות חמצון אחרות כגון טביעת רגל מעבדתית קטנה יותר ושליטה גדולה בהרבה על החמצון המרחבי והזמני על פני התא.

המכשיר יכול לשמש כמעט כל מעבדה שחוקרת את ההשפעה של חמצן או גזים אחרים כמו פחמן דו חמצני על תרביות תאים במבחנה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשרות את המכשיר המעוקר ואמצעי התרבות למשך הלילה, למזער את היווצרות הבועות במהלך הניסוי. בנוסף, אפשר למערכת להשוות לפני תחילת הניסוי.

הסיבה לכך היא שקצב הזרימה משתנה ככל שהלחץ במערכת שווה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.