Name: ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-06T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: למד לייצר ולהפעיל התקן היפוקסי לבקרת חמצן מדויקת בתרביות תאים. השיטה מאפשרת חקר השפעת רמות חמצן שונות על תהליכים ביולוגיים כמו ריפוי פצעים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי מחלקת אילינוי לבריאות הציבור של הקרן הלאומית למדע (DBI-0852416).

1. התקן פונקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשיר להכניס hypoxic מכיל 6 עמודים כי קן לתוך צלחת 6-היטב סטנדרטי. הגז זורם לתוך העמוד, ברשת microfluidic בבסיס העמוד, זורם בחזרה מתוך המכשיר. בבסיס העמוד להרכיב את הקיר התחתון של microchannel הוא קרום עבה 100 מיקרומטר גז חדיר PDMS המאפשר דיפוזיה חמצן בין הגז microchannel והתקשורת והתרבות. לכן, המכשיר פועל על ידי יצירת שיפוע הריכוז שמניע את ריכוז החמצן התקשורת לקראת הערך הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשיר מציע מספר יתרונות על פני החדר hypoxic אחרים חמצון מערכות תאים: 1) ממזער את דיפוזיה חמצן נתיב המאפשר שליטה הזמני מהר יותר, 2) משפר את השליטה במרחב מעל חמצון, כמו תלויים על עיצוב עמוד microchannel, 3) הוא בעל טביעת מעבדה קטנות תפוקה גבוהה יותר כדי להגביר את יעילות הניסוי, ו 4) מסתגל נפוץ בתרבות כלים התא (לדוגמא צלחת multiwell) ללא צורך בידע ציוד מיוחדים. </li></ol> 2. התקן ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית מערך האומנה היא העתק יצוק עם PDMS בדפוס Delran במכונה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא הגז microchannel בתחתית כל עמוד הוא מפוברק באמצעות תקן SU-8 photolithography דפוס PDMS העתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז קרום חדיר הוא מפוברק על ידי ספינינג מוגדרת של PDMS על פרוסות סיליקון כדי להגיע לעובי הרצוי. בדוגמה זו אנו משתמשים קרום 100 מיקרומטר עבה אשר היה מפוברק ספינינג 500 סל"ד למשך 10 שניות ולאחר מכן 900 סל"ד למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הרכיבים מחוברים יחד לאחר טיפול חמצן פלזמה עם מכשיר פלזמה כף יד (דגם BD-20, אלקטרו טכני מוצרים). </li></ol> 3. התקן ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות לתוך הצלחת המכשיר, ולוודא כדי למנוע בועות. Angling את המכשיר במהלך הכניסה עוזר לגרש את בועות צד אחד. עבור מבוססי תאים ניסויים בפועל, צעד זה חייב להיעשות בתוך ברדס זרימה למינרית סטרילי. הסיכויים הם זיהום מופחת במידה ניכרת פעם את המכשיר מוכנס, כך ההרכבה יכולה להתבצע מעל החממה בסביבה לא סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינור הגז מטנק מקור ליציאות מפרצון ו לשקע של המכשיר. עבור מבוססי תאים ניסויים, בחממה תרבות צריכה חור כדי לאפשר כניסה צינורות, צינורות צריך להיות מחובר לאחר שנשא את המכשיר ומעמידים אותו לתוך החממה. היזהר, כדי למנוע הפעלת לחץ עודף על המכשיר, אשר יכול לעוות PDMS מספיק כדי למחוץ את התאים הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא וסת זרימה דיוק סגור לפני פתיחת הרגולטור גופייה להימנע גדותיו את המכשיר. הפעל את זרימת הגז. בעדינות דיוק לפתוח זרימת הרגולטור על קצב הזרימה הרצוי (5-10 mL / min). צפה ערך מקרוב בשעה הקרובה ולבצע התאמות כנדרש, שכן ירידה בלחץ ישתנה בזמן שהמערכת המאזן, לשנות את קצב הזרימה. כדי למנוע היווצרות של בועות בתקשורת, להקטין את קצב זרימת דקות בין 10-20 מ"ל / אחרי משך 15 דקות הראשונית איזון עם קצב זרימה גבוה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הניסוי הרצוי, לעצור זרימת הגז, להסיר את צלחת, ותאי תהליך בהתאם (למשל lyse, כתם, לספור וכו '). </li></ol> 4. התקן אימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר ומיקום עמדות על החמצן פלורסנט (שועלי) להחליק חיישן (בהתאם לדרישות אימות) אשר ישמשו למדידת חמצן. שקופית מכיל רותניום פלורסנט צבע ציפוי כי הוא הרווה על ידי חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף שקופית ישירות 0, 10, חמצן 21% מטנק גז לצלם תמונות אחרי 5 דקות של איזון נאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא עוצמת התמונה מתכוון לכל תפקיד ואת חמצון ריכוז העלילה כמו תלויה בעוצמת ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת עקומת כיול על ידי עקומות ליניארי מתאים לקו 0-10% ו קו 10-21%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטרוגניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת מספר רב של נקודות פורש את רוחב הערוץ במרווח מוגדר (למשל, כל 1 מ"מ). שים לב כי ייתכן שיש חפיפה של תמונות בהתאם המרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ריכוז החמצן על פני השטח גם דרך המכשיר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שלוש נקודות בשקופית שועלי בו כדי למדוד את ריכוז החמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר לכידת התמונה הראשונה ברמות החמצן הסביבה, לפתוח את זרימת דיוק הרגולטור כדי להתחיל לזרום גז לתוך המכשיר. צלמו תמונות בהפרש המתאים כדי להעריך את משך הזמן והיקף concentr חמצןאיזון ation (למשל כל 10 שניות למשך 30 דקות). </li></ol></li></ol> 5. יישומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפוי פצעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניסוי, להשרות את הכנס מעוקרים PDMS במדיום סרום ללא לצמצם את לדכא היווצרות בועות הגז בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים 100% confluency בצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור שריטות ישר monolayers עם טיפ פיפטה p200 לדמות פצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת הסלולרי, לשטוף עם 5 מ"ל התקשורת, ואת לשאוב שוב. חשוב לא להפריע monolayer של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי בארות בינוני עם 4 בסרום ללא מ"ל כדי להפחית שגשוג תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להכניס לתוך בארות ולהתחבר כל טוב ריכוז החמצן המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 6 גם להוסיף צלחת עם על הבמה מחומם על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת זמן לשגות תמונות של התאים במרווח הרצוי משך מוחלט. T_Scratch של MATLAB, אלגוריתם למדידת הפצע, ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את פני השטח נרפאו. </li></ol></li></ol> 6. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן אימות המכשיר להכניס hypoxic תערוכות שיפורים גדולים מעל תא hypoxic במונחים של זמן חמצן איזון וההיקף, הדורשים פחות מ 2 דקות כדי לייצב לחמצן 0.5%. קרום גם מכשיר בגודל הפער בתחתית היה גורם מכריע בקביעת יעילות איזון, עם פער גדול בגדלים הדורשים יותר זמן כדי להגיע היציב ריכוז חמצן ערכים. המכשיר גם מאפשר מידה רבה של שליטה על חמצון המרחבי היטב יחיד, ומאפשר היווצרות של מספר תנאים, ואף יצירת פרופיל חמצן מחזורית פני הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפוי פצע Monolayers Cell נחשפו חמצן 10% או 21% ואת שטח הפנים של הפצע נותח במשך הזמן. שריטות נחשף לחמצן 21% סגר את האיטי ביותר ו -10% בקצב המהיר ביותר. איור 1 מציג תמונות של שריטה במשך 17 שעות. הגרפים באיור 5 מראים את אחוז השטח פצע פתוח לשני ריכוזי חמצן למשך הניסוי. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"></a> באיור 1. סכמטי ודיאגרמות הממחישות תכונות המכשיר. המכשיר להכניס חמצן הוא מפוברק על ידי photolithography קונבנציונאלי (רשת microfluidic) דפוס העתק (רשת microfluidic והכנס הפיגום), ומוגדר ספינינג של PDMS (גז קרום חדיר). א) מכשיר חמצן מקוננות לתוך צלחת 6 באר. ב) דוגמאות של 24 ו 96, גם מערכים העמוד. ג) סכמטית חתך של עמוד. חמצן זורם לתוך המכשיר דרך כניסת ונוסע ברשת microfluidic בתחתית העמוד. חמצן יכול באופן חופשי מפוזר על פני קרום חדיר PDMS גז בתחתית העמוד ולפרוץ התקשורת והתרבות. ד) תמונת מיקרוסקופ מראה את התכונות השונות של עמוד ערוץ אחד מלמעלה, עם הודעות זכוכית מלוכדות עבור מחקרים איזון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"></a> איור 2. אימות של המכשיר עם חיישני חמצן. מתח חמצן היטב בתוך כל התאפיינה באמצעות חיישן חמצן מישוריים רותניום. כל התערובות הכילו חמצן וחנקן מאוזנת 5% CO 2 עבור חציצה התקשורת. א) מגרש הממחישות את ההשפעה של גובה לפרסם, מרחק דיפוזיה חמצן וכך בין קרום ותאים, על הזמן איזון ויעילות. הייטס הוקמו על ידי בדולח ההודעות כבול אל החלק התחתון של המכשיר. כל שלושת הגדלים לפרסם תשואה פעמים איזון משופר הרבה מעל חדר היפוקסי. שים לב כי הזמן הוא בקנה מידה יומן. ב) עלילה המתארת ​​את החמצן מהיר איזון זמן תגובה של המכשיר 0.2 מ"מ הפער. ג) Multi-עמדת linescans נלקחו גם תחת microchannel ברחבי היטב כדי להבטיח הומוגניות של ריכוז החמצן הוצג על ידי המכשיר. גרף המתאר את ריכוז החמצן שנמדד לאחר יציקת 0%, 10%, חמצן 21% עבור 10 דקות. ד) התקן ביעילות שומרת חמצן 10% על פני 5 ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"></a> איור 3. ניסויים עם עיצובים מורכבים יותר חמצן microchannel. א) הגדרת מצב Dual-microchannel מניב יציב 0% ופרופיל חמצן 21% לעומת 14 ימים. ב) דפוס interdigitated ומפותלת של 500 מיקרומטר רוחב microchannels הארכת ברחבי הדואר תוצאות עמוד הפרופיל חמצן מחזורית. שים לב כי הנתונים רק משפט אחד מתאר נציג כמו יישור microchannel היה קשה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"></a> איור 4. תמונות Timelapse סגירת הפצע 0, 7, ו - 17 שעות לאחר שריטה הראשונית. תאים נמסרו חמצן 21% לאורך משך הניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="איור 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"></a> איור 5. השפעת ריכוז החמצן על קצב ריפוי הפצע assay שריטה.

המכשיר הוא מפוברק על ידי photolithography SU-8 סטנדרטי, דפוס העתק, ומוגדר ספינינג עשוי כולו polydimethylsiloxane. הגז מוחדר מכשיר להקים שיפוע הריכוז בין העמוד microchannel והתקשורת תרבות, הנהיגה את המערכת לכיוון ריכוז החמצן הרצויה שיווי משקל. המכשיר הוכח ביעילות לווסת את החמצון של זמן ומרחב בתוך היטב, וכן לווסת התנהגות הסלולר בהתאם. דפוסים מרחביים של חמצון מוגדר על ידי microchannel בבסיס העמוד, כך מגוון רחב של עיצובים יכול להיות מיושם ב crafting photomask. בנוסף, עירוי של גז הרצוי לשלב גז הבאר צפוי לשפר את זמן איזון וההיקף של היפוקסיה. רשת ערבוב microfluidic יכול להיות מותאם המכשיר כדי לספק אמצעי כדי לייצר תערובות גז הרומן של רק כמה מיכלי גז המניות. לבסוף, מנגנון התקשורת החליפין היה מבטל את הצורך להסיר את המכשיר מהצלחת multiwell, אשר התאים עשויים להגיב. המכשיר כולל יישומים בכל במבחנה או ניסוי לשעבר vivo הדורשים שליטה על ריכוז החמצן. כמו חמצן הוא משתנה פיזיולוגי חשוב המשפיע על רוב רובם של מסלולי איתות, תחומי המחקר שתועיל מוגבל על ידי יצירה של החוקר. כמה שדות ירוויחו השליטה הזמני משופרת של ריכוז החמצן כוללים גרורות סרטן, דום נשימה בשינה, פגיעה לבבית reperfusion איסכמיה, בקרב רבים אחרים. לדוגמה, היפוקסיה לסירוגין כבר בקורלציה עם סרטן פולשני יותר, upregulating מספר metastastis הקשורים גנים ביחס היפוקסיה normoxia רציפה. השליטה במרחב חשוב גם, כפי הדרגתיים חמצן הם קריטיים בהתפתחות, zonation כבד, רעילות התרופה, ואת הנישה בתאי גזע. המכשיר שהוצג במאמר זה ייהנו מספר תחומים של מחקר על ידי מתן מערכת עם טביעת רגל קטנה מעבדה, דרישות מבצעיות פשוטות יחסית, וכן שליטה רבה יותר על חשיפה חמצן לתאים.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חיישן Planar FOXY</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>זכוכית מיקרוסקופ מצופה</td></tr><tr><td>בקר גז</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>גז</td><td>Airgas</td><td>תערובות מותאמות אישית</td><td>כולן מכילות 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצע גידול MDCK עם L-Glutamine</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (Fetal Bovine Serum)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

החמצן הוא אפנן המפתח של מסלולים סלולריים רבים, אך המכשירים הנוכחי המתיר<em&gt; במבחנה</em&gt; אפנון חמצן מצליחים לענות על הצרכים של מחקר ביו. חדר היפוקסי מציע מערכת פשוטה לשליטה חמצון בכלי תרבות רגילה, אך חסר שליטה של ​​זמן ומרחב מדויק על ריכוז החמצן על פני השטח של התא, דבר המונע יישומה בלימוד מגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות. מערכות אחרות השתפרו על חדר היפוקסי, אך דורשים ידע ציוד מיוחד עבור המבצע שלהם, מה שהופך אותם מאיימת לחוקר הממוצע. הכנס microfabricated עבור צלחות multiwell פותחה כדי לשלוט באופן יעיל יותר את ריכוז החמצן ומרחב לתופעות פיזיולוגיות מצאו מודל טוב יותר<em&gt; In vivo</em&gt;. הפלטפורמה כוללת להוסיף polydimethylsiloxane כי קינים לתוך צלחת multiwell רגיל ומשמש רשת הגז פסיבי microfluidic עם קרום חדיר גז שנועד לווסת את אספקת החמצן לתאים חסיד. המכשיר פשוט לשימוש מחובר מיכלי גז המספקים את הלחץ כדי להציג את ריכוז החמצן הרצויה לתוך הרציף. ייצור כולל שילוב של photolithography SU-8 סטנדרטי, דפוס העתק, ו PDMS מוגדר ספינינג על פרוסות סיליקון. הרכיבים של המכשיר מודבקים לאחר טיפול פני השטח באמצעות מערכת המוחזק ביד פלזמה. אימות מושגת באמצעות חיישן חמצן מישוריים ניאון. זמן איזון הוא בסדר גודל של דקות, מגוון רחב של פרופילים החמצן ניתן להשיג מבוסס על עיצוב המכשיר, כגון פרופיל מחזורית שהושג במחקר זה, ואפילו הדרגתיים חמצן לחקות את אלה שנמצאו<em&gt; In vivo</em&gt;. המכשיר יכול לעקר עבור תרבית תאים באמצעות השיטות הנפוצות ללא אובדן תפקוד. של התקן הישימות ללימוד<em&gt; במבחנה</em&gt; ריפוי הפצע התגובה יהיה הפגינו.

ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.

חמצן הוא וסת מפתח של מסלולים תאיים רבים, אך מכשירים קיימים המאפשרים ויסות חמצן במערכת in vitro אינם עונים על הצרכים של מחקרים ביו-רפואיים...

התקן ההכנסה להיפוקסיה כולל שישה עמודים המתאימים לבארות של פלטת 6 בארות. גז זורם דרך הרשת המיקרופלואידית בבסיס העמוד ויכול לד diffuse דרך ממברנת PDMS חדירה לגז, המפרידה בין רשת הגז למצע התרבית. התקן זה ממזער את אורך נתיב הדיפוזיה בין מקור החמצן, הרשת המיקרופלואידית בבסיס העמוד והתאים, מה שמאפשר שיווי משקל מהיר יותר של ריכוז החמצן.המכשיר מאפשר גם שליטה רבה הרבה יותר בתבנית המרחבית של החמצן החשוף לתאים, אשר נקבעת על ידי תכנון רשת הגז המיקרופלואידית המיוצרת באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית עם מסכות פוטו. שלום, אני שון ארד ממעבדתו של ד"ר דייוויד אדינגטון במחלקה לביו-הנדסה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. שלום, אני אלי, גם אני ממעבדתו של אדינגטון.היום נראה לכם כיצד לייצר, לתקף ולהשתמש במכשיר מותאם אישית לחשיפת תרביות תאים in vitro בלוח של שישה בארות לריכוזי חמצן שונים. השתמשנו בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור את השפעת החמצן על ריפוי פצעים, יצירת מיני חמצן רהאקטיביים ונדידה. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בייצור של התוסף מחמצן, הכינו Polymethyl Sloane או PDMS ביחס של 10 ל-1 בין הפולימר המקדים (pre polymer) לחומר המקשה (curing agent). בהתאם להוראות היצרן, תערובת ה-PDMS מוספת לתבנית Dell ran שעובדה מראש ותוכננה כך שתחקה את הצורה של פלטת תרבית סטנדרטית של שישה בארות. לאחר הקשיה בטמפרטורה של 75 °C למשך לילה, מערך העמודים המודפס שיתקבל יהווה את הרכיב הראשון מתוך שלושה רכיבים המרכיבים את התוסף מחמצן, לצורך ייצור הרכיב המרכזי השני של התוסף מחמצן.תבנית מאסטר של SU-8 מוכנה תחילה על ידי ספינ-קוטינג (spinning) של SU-8 2150. על גבי פרוסת סיליקון מונחת מסכת פוטומסקה, וה-SU-8 נחשף ל-UV דרך המסכה כדי ליצור תבנית מאסטר עם עובי מיקרו-ערוץ של 300 µm. שופכים PDMS מעל תבנית המאסטר של ה-SU-8 ומקשחים למשך שעתיים בטמפרטורה של 75 °C כדי לקבל תבנית חיובית שתיצור בסופו של דבר את המיקרו-ערוצים בתחתית כל עמוד.את הרכיב השלישי של ההתקן מייצרים על ידי סבב (spinning) של PDMS על פרוסת סיליקון במהירות של 500 RPMs למשך 10 שניות, ולאחריה 900 RPMs למשך 30 שניות, כדי להשיג ממברנה בעובי של 100 מיקרומטר. מכיוון ש-PDMS חדיר לגזים, ניתן להזרים חמצן לתוך המיקרו-תעלות ישירות דרך ממברנה זו. לאחר הכנת כל הרכיבים, כל משטח חיבור עובר טיפול בפלזמה של חמצן למשך דקה אחת.באמצעות מכשיר פלזמה ידני, הצמד תחילה את ששת רכיבי המיקרו-תעלות למערך העמודים, ולאחר מכן נקב שני חורים בכל עמוד שישמשו כפתחי כניסה ויציאה של הגז. לבסוף, הצמד את הממברנה לתחתית המיקרו-תעלה כדי להקל על ההדבקה ולנקז בועות אוויר. את המשטחים שעברו טיפול בפלזמה לוחצים זה אל זה למשך כדקה באמצעות קצה של פינצטה; המתן שעה אחת בין כל פעולת הדבקה כדי להבטיח שהמכשיר מודבק לחלוטין וניתן לכיול.לאחר שהמכשיר הושלם, יש לכייל את רמת החמצן שהתאים מקבלים בעת שימוש ברכיב החמצון (oxygenating insert) בניסויים בפועל. לצורך הכיול, השתמשו בחיישן חמצן פלואורסצנטי או ב-foxy slide, המכילים ציפוי של צבע רותניום פלואורסצנטי שעובר כיבוי (quenching) על ידי חמצן. ה-Foxy slides חתוכים מראש כדי להתאים לתחתית של פלטה בעלת שישה בארות (six well plate).יש לחתוך את הזכוכית המכסה כך שתכסה חלק נרחב ככל האפשר מפני השטח של הבאר. מכיוון שלזכוכית המכסה יש עובי של כ-1 millimeter, יש להתאים את המכשיר כדי לשמור על המרחק הרצוי לצורך דיפוזיה נאותה של הממברנה.מרחק זה תלוי בניסוי, אך ברוב המקרים הוא צריך להיות נמוך מ-one millimeter. באמצעות מכשיר פלזמה ידני, חתוך רגליים משקופית מיקרוסקופ מזכוכית בעובי one millimeter, באורך של כ-six millimeters וברוחב של four millimeters, והצמד אותן לתחתית המכשיר. המכשיר ינוח על הרגליים מעל השקופית.ניתן להשתמש גם בלוחיות כיסוי מזכוכית עבור מרווח דיפוזיה של 0.17 millimeters כדי לתקף את צריכת החמצן. העבירו שלוש milliliters של מים דה-יוניזציה בטמפרטורת החדר אל בארות של פלטת שש בארות שבה יימדד החמצן. הניחו את המכשיר בפלטה ובאמצעות תוכנת metamorph, בחרו את מספר ומיקום העמדות הרצויות בחיישן ה-foxy.החליקו את השקופית לבדיקת ריכוזי החמצן. חברו את צינורות ה-tai gun בין מיכל גז החמצן למכשיר ההחדרה ההיפוקסי. עבור בקרה מדויקת של הגז המסופק, נעשה שימוש בווסת זרימה מדויק המכוון לקצב זרימה של 50 עד 100 milliliters per minute.יש לוודא שווסת הזרימה המדויק סגור. פתח תחילה את הווסת העליון של המכל, ולאחר מכן את הווסת המדויק. לאחר 15 דקות, הפחת את קצב הזרימה לטווח של 10 עד 20 לדקה.כדי למנוע היווצרות בועות במים, יש לעקוב מקרוב אחר ערך קצב הזרימה במהלך השעה הבאה ולבצע התאמות לפי הצורך, כיוון שנפילת הלחץ תשתנה בעוד המערכת מגיעה לשיווי משקל, דבר שישנה את קצב הזרימה לצורך לכידת תמונות של הפלטה וחיישני ה-foxy. נעשה שימוש במיקרוסקופ Olympus IX 71 המצויד במערכת פלואורסצנציה, במצלמת CCD של Q Imaging Tiga, ובתוכנות לרכישת תמונות מסוג SRV ו-Metamorpho. המיקרוסקופ מצויד ב-Olympus 3 1 0 2 0, פילטר פלואורסצנציה תואם ל-foxy עם אורך גל עירור של 475 nanometers ואורך גל פליטה של 600 nanometers.כדי לבחון את זמן ההגעה לשיווי משקל ואת מידת החמצון של המכשיר, בחרו שלוש נקודות על שקופית ה-foxy שבהן תמדדו את ריכוז החמצן. צלמו תמונה של השקופית מיד לפני תחילת זרימת הגז. צלמו תמונות במרווחים של 10 שניות במשך 30 דקות בזמן שהגז זורם דרך המכשיר, כדי לבחון את ההומוגניות ואת אספקת החמצן.הגדירו נקודות רבבות במרווחים של מילימטר אחד לאורך רוחב התעלה, ומדדו את ריכוז החמצן על פני השטח של הבאר באמצעות metamorph. ייצאו את עוצמת התמונה הממוצעת עבור כל מיקום, ושרטטו את ריכוז החמצן כפונקציה של עוצמת הפלואורסצנציה. צרו עקומת כיול על ידי התאמת עקומות ליניאריות לקו שבין 0% ל-10% ולקו שבין 10% ל-21%, המקשרות בין עוצמת הפלואורסצנציה לריכוז החמצן. עבור כל מיקום שנמדד, ניתן לייצא נתוני עוצמה גולמיים מ-metamorph ולנתח אותם בהמשך באמצעות Microsoft Excel או תוכנה סטטיסטית אחרת.לאחר כיול המכשיר, ניתן להתחיל בניסויים כגון בדיקות ריפוי פצעים; יש לבצע עיקור באוטוקלאב לרכיב המכויל בטמפרטורה של 121 °C למשך 15 דקות בתוך 24 שעות לפני הניסוי, ולהשתמש בו במabilis זרימה למינרית (laminar flow culture hood) כדי למנוע זיהום מאוחר יותר. השרו את רכיב ה-PDMS המעוקר בתווך ללא סרום למשך 24 שעות כדי למנוע היווצרות בועות גז בעת ההכנסה לבארי הפלטה; תרבתו תאי MDCK או תאים נצמדים אחרים עד להגעה ל-100% confluence בפלטה של שש בארות, וצרו שריטות ישרות בשכבות התאים החד-שכבתיות (monolayers) באמצעות טיפ של פיפט P 200. השריטות מדמות פצעים בשכבה החד-שכבתית הנצמדת.שאבו את מצע התרבית של התאים ללא הפרעה לשכבה החד-שכבתית (monolayer) ושטפו עם חמישה מיליליטר של מצע. שאבו שוב ומלאו מחדש את הבארים בשלושה מיליליטר של מצע ללא סרום. הכניסו בעדינות את המכשיר אל הפלטה, תוך הקפדה להימנע מבועות.הטיה של המכשיר במהלך ההחדרה מסייעת להוצאת בועות מצד אחד. יש להיזהר שלא להפעיל לחץ מופרז על המכשיר, שעלול לעוות את ה-PDMS במידה שתמעץ את התאים שמתחתיו. הנח את הפלטה ואת המכשיר על במה של מיקרוסקופ מחוממת ל-37 degree Celsius וחבר צינורות ממיכל הגז למכניס (inlet) ולמוצא (outlet) של המכשיר.באינקובטור התרביות צריכה להיות חור המאפשר כניסת צינוריות, והצינוריות צריכות להיות מחוברות. לאחר הנחת המכשיר בתוך האינקובטור, בצע את אותו הליך להפעלת זרימת הגז כפי שתואר קודם לכן להערכת ריפוי פצעים. צלם תמונות time-lapse של התאים כל 20 דקות למשך 15 עד 18 שעות באמצעות הציוד ותוכנת ההדמיה שתוארו קודם לכן. ניתן להשתמש באלגוריתם למדידת שריטות (T scratch) כדי לנתח את שטח הפנים שטרם החלים לאחר משך הזמן הניסויי הרצוי. הפסק את זרימת הגז, הוצא את הצלחת והמשך בעיבוד תאים נוסף במידת הצורך. מכשיר המבואן ההיפוקסי דורש פחות משתי דקות כדי להתייצב ל-0.5% oxygen כפי שמוצג כאן.גודל המרווח בתחתית באר ממבברת המכשיר היה גורם קריטי בקביעת יעילות השיווי המשקל, כאשר מרווחים גדולים יותר דרשו זמן רב יותר להגעה לערכי ריכוז חמצן במצב יציב. המכשיר מאפשר גם מידה רבה של שליטה על החמצון המרחבי בתוך באר אחת, דבר המאפשר יצירה של תנאים מרובים ואף יצירת פרופיל חמצן מחזורי על פני שטח הפנים של הבאר. שכבות מונו-שכבה של תאי MDCK נחשפו ל-10% או 21% חמצן, ושטח הפנים של הפצע נותח לאורך זמן באמצעות אלגוריתם מעקב אחר פצעי שריטה של MATLAB Ts.לאחר 11 שעות מתוך 17 שעות סה"כ, נותר 6.87% מהפצע המקורי כאשר הוא נחשף ל-10% oxygen, בעוד ש-64.4% מהפצע נותרו תחת 21% oxygen. כפי שמוצג כאן, ריכוזי החמצן נמצאים במתאם שלילי עם שטח הפצע הפתוח עבור שני ריכוזי החמצן. למשך משך הניסוי, הרגשנו לכם כיצד לייצר, לתקף ולהשתמש בהתקן ההכנסה ההיפוקסי עבור בדיקת ריפוי פצע שריטה. ההתקן מציע מספר יתרונות על פני מערכות חמצון אחרות, כגון תפיסת מקום קטנה יותר במעבדה ושליטה רבה הרבה יותר בחמצון המרחבי והזמני על פני שטח התא.ניתן להשתמש במכשיר כמעט בכל מעבדה החוקרת את השפעת החמצן או גזים אחרים, כגון פחמן דו-חמצני, על תרביות תאים in vitro. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשרות את המכשיר המעוקר ואת מצעי התרבית למשך לילה, כדי למזער את היווצרות הבועות במהלך הניסוי. בנוסף, יש לאפשר למערכת להגיע לשיווי משקל לפני תחילת הניסוי.זאת משום שקצב הזרימה משתנה כאשר הלחץ במערכת מתאזן. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מבוא לתוך פרוטוקול הטכנולוגיה, וטיפול של כלי HYPERStack קורנינג ואביזרים המשמשים תרבית תאים תשואה גבוהה חסיד. פרוטוקול יציג כיצד להשתמש בכלי מערכת סגורה לקציר תא הגדלת מעל הנוכחי מוצרים מוערמים צלחת.

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Fermentors משמשים כדי להגדיל את תשואת התרבות והפרודוקטיביות של תאים מהונדסים גנטיים. לאחר הקרנת מועמדי תרבית תאים של חיידקים או של בעלי חיים רבים בצלוחיות לרעוד, הצעד ההגיוני הבא הוא להגדיל ביומסה של התרבות שנבחרה עם fermentor. סרטון זה מדגים את ההקמה ותפעול של מערכת bioreactor המעבדתיים אופיינית.

מבצע של Bioreactor Benchtop

ההתנהגות התפקודית של תאים בתרבית ניתן לשפר על ידי culturing בלמעלה in vivo-כמו 3 ממדי סביבות תרבות 16-21. כתב יד זה מתאר את פעולת הגדרה ושל מערכת bioreactor סיבים חלולה עבור in vivo-כמו בתרבית רקמה יונקת.

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

באורגניזמים רב-תאיים, גורמים מסיסים המופרשים מעוררים תגובות מסוגי תאים שונים כתוצאה מאיתות פרקריני. מערכות תרבית משותפת מציעות דרך פשוטה להעריך את השינויים המתווכים על ידי גורמים מסיסים המופרשים בהיעדר מגע תא-תא.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

השליטה בשיפועים כימיים וחמצן חיונית לתרביות תאים. מאמר זה מדווח על מכשיר מיקרופלואידי-נוזלי פולידימתילסילוקסן-פוליקרבונט (PDMS-PC) המסוגל לייצר באופן אמין שילובים של שיפועים כימיים וחמצן למחקרי נדידת תאים, שניתן להשתמש בהם באופן מעשי במעבדות ביולוגיות ללא מכשור מתוחכם.

Polydimethylsiloxane-פוליקרבונט התקני microfluidic הכימי בניצב תחת מחקרי נדידת תאים והדרגות חמצן

כאן, אנו מציגים עבור ex-vivo ריאות סרטן מודל מחקה את השלבים של התקדמות הגידול ומסייעת לבודד גידול ראשוני, פרוטוקול מחזורי תאים סרטניים נגעים גרורתי.

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

הפרוטוקול מתאר יצירת כדוריות בתפוקה גבוהה להדפסה ביולוגית באמצעות ניתוח רב-פרמטרי של החמצון שלהם ומוות התאים שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. ניתן ליישם גישה זו כדי לשלוט בכדאיות הספרואידים ולבצע סטנדרטיזציה, החשובה במידול רקמה תלת-ממדית, מיקרו-סביבה של הגידול וביו-פבריקציה מוצלחת (מיקרו)של רקמות.

מיקרופריקציה ביולוגית בסיוע מיקרוסקופיית חמצן במחיר סביר של ספרואידים רב-תאיים

במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

אנו מציגים מכשיר חדשני למדידת קצבי צריכת חמצן (OCR) בתרביות אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE). המכשיר יכול למדוד OCR במשך שבועות בכל פעם על RPE גדל על לוחות תרבית תאים סטנדרטיים עם מדיה סטנדרטית בעוד הלוחות נמצאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי.

ניטור ארוך טווח של שיעורי צריכת החמצן בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית מובחנות ומקוטבות מאוד

פרוטוקול זה מציג שיטה לייצור שבב מיקרופלואידי דו-שכבתי ולניתוח צמיחה מיקרוביאלית תחת תנודות חמצן מהירות. ביצועי המכשיר אומתו באמצעות חישת חמצן בתעלות נוזלים וגידול מיקרוביאלי.

יצירת תנודות חמצן מהירות בניתוח צמיחה מיקרוביאלית של תא בודד באמצעות מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתית

למד לייצר ולהפעיל התקן היפוקסי לבקרת חמצן מדויקת בתרביות תאים. השיטה מאפשרת חקר השפעת רמות חמצן שונות על תהליכים ביולוגיים כמו ריפוי פצעים.

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

גלה סרטונים נוספים