Name: הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למד הדמיה של תעבורת RNA בזמן אמת בביציות Xenopus באמצעות תיוג פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקה של RNA ומיקומו התת-תאי בפיתוח מוקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה שלנו על לוקליזציה RNA נתמכת על ידי מענק מ-NIH (R01GM071049) כדי KLM.

חלק 1: שעתוק של mRNA שכותרתו fluorescently. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize DNA פלסמיד המכיל את הרכיב לוקליזציה RNA או רצף רלוונטיים אחרים ואת resuspend ב 1 מיקרוגרם / μl עם DEPC שטופלו H 2 O. תבנית ה-DNA חייב להיות מקדם אתרים במעלה עבור שעתוק על ידי T7, SP6, או T3 RNA פולימראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ריאגנטים הבא צינור 1.5mL סטרילי: <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> א 10X Tx חוצץ (ראה M &amp; M) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> ב 20X כובע / NTP לערבב (ראה M &amp; M) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ג 1 mM אלקסה פלואוריד 546-14-UTP (Invitrogen) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ד UTP, [α P-32] (1 μCi / μl) (פרקין אלמר) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ה DEPC-H 2 O </td><td> 11 μl </td></tr><tr><td> ו 0.2 מ DTT </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ז RNasin (Promega) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> ח תבנית ה-DNA ליניארי </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> i. RNA פולימראז (Promega) </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות ריאגנטים צנטריפוגות קצרה (10 שניות. Microcentrifuge ב א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2-4 שעות ב 37 ° C, המכסה את הצינור עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע photobleaching של fluorophore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl 1 מ"ג / מ"ל ​​RNase ללא DNase (Promega) לבזות תבנית ה-DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 79 μl 20 mM EDTA (pH 8.0) כדי לעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר μl 1 לצינור נפרד, שכותרתו "קלט" ולשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התגובה דרך טור 1 G50 מ"ל (ראה חומרים ושיטות), אשר יכלול נוקלאוטידים מאוגדים תוך למעט mRNA באורך מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את הרנ"א על ​​ידי המשקעים אתנול: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl 100% אתנול, 10 μl 7m CH 3 COONH 4, 1 המוביל μl RNA (tRNA שמרים, 10 מיקרוגרם / μl) או 1 הגליקוגן μl (20 מ"ג / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב עד להקפיא מוצק ב -80 מעלות צלזיוס למשך&gt; 30 דקות או על קרח יבש במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במהירות המרבית microcentrifuge במשך 15 דקות, supernatant למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו עם 150 μl של אתנול 75%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 3 דקות במהירות המרבית supernatant microcentrifuge, למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את גלולה בשעה 37 ° C במשך 3 דקות, להבטיח כי כל אתנול התאדו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 11 μl DEPC-H 2 O ולהסיר 1 μl אל צינור נפרד, שכותרתו "שילב". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ההתאגדות אחוזים לדלל את RNA ל 50 ננומטר (ראו חומרים ושיטות חישוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA צריך להיות קפוא 5 aliquots μl, לשימוש יחיד כדי למנוע הקפאה / הפשרה מחזורי והוא יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות ב -80 ° C. </li></ol> חלק 2: הכנת Microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RNA אופן ההכנה: הפשירי aliquot של רנ"א (50 ננומטר), ו לפגל את הרנ"א על ​​70 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות. ספין במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge במהירות המרבית כדי להסיר חלקיקים, ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביצית אופן ההכנה: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח להסרת השחלות מ Xenopus laevis הנקבות (נסקו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך לחתיכות של השחלה laevis Xenopus לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של תמיסת collagenase (ראה חומרים ושיטות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער בעדינות על 18 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, או עד ביציות מופרדות בבירור מן השחלה. בשל אצווה וריאציה אצווה, זמן collagenase הטיפול עשוי להשתנות ולהיות במעקב צמוד באמצעות בדיקה ויזואלית על מנת להבטיח defoliculation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ביציות להתיישב צינור, להסיר ולשטוף פתרון ביציות עם חיץ MBSH (ראה חומרים ושיטות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעמיים נוספות עבור סכום כולל של שלושה שוטף. זה פרוטוקול בידוד הביצית דומה לזה המפורט כהן ואח'. 2009. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית בשלב המיון III / IV ביציות (דומון, 1972) במאגר MBSH תחת מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי. שלב III ביציות הן אטומות לחלוטין אך לבן, ואילו השלב הרביעי ביציות נעשים קצת יותר גדולים ומנוקדים פיגמנט. ביציות כי הם שקופים מעט צעירים מדי וביציות כי פיגמנט מלא או הפצה מקוטב התערוכה פיגמנט הם זקנים מדי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט אופן ההכנה: Pull and שפוע מחטים לקוטר החיצוני של 0.05 מ"מ ~. (אנו משתמשים דראמונד מדעי 3.5 אינטש נימים (סדר # 3-000-203-G / X), ושות כלי סאטר micropipette חולץ וכן חברת WPI beveller). </li></ol> חלק 3: Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול מחט עם DEPC-H 2 O 2 nl לספק לכל זריקה. אנחנו מול עומס מחט שלנו באמצעות גז מונחה microinjector (ראה חומרים ושיטות), ו לכייל גודל טיפה באמצעות מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען RNA לתוך מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מיון ביציות לתוך צלחת זריקה המכילה מאגר MBSH. אנו microinject על צלחת עם שכבה של גומי מוקצף שחור. ביציות חיוור להתבלט גם על backgrou לבןnd. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזריק כל הביצית עם 2 nl של רנ"א על ​​50 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרש RNA, לשטוף עם מחט DEPC-H 2 O, ו לטעון RNA הבא להזרקה. </li></ol> חלק 4: תרבות הביצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ביציות בבאר צלחת 24 סטרילית היטב (Sigma Aldrich). אנחנו תרבות של עד אלף ביציות לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ ולהחליף 400 μl O ocyte C ulture M edium (OCM; לראות חומרים ושיטות) לכל טוב. מניחים צלחת בתוך התרבות מיכל אוויר חזק פלסטיק עם מגבת נייר רטוב כדי לשמור על סביבה לחה במהלך התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ביציות בגיל 18 ° C עבור נקודות זמן הנעים בין 8 ל 48 שעות. </li></ol> חלק 5:, קיבוע התייבשות ואחסון של ביציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את כל ביציות מת במקום ביציות לשרוד צלוחיות זכוכית. אנחנו באופן שגרתי להתבונן&gt; הישרדות 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום ביציות ב MEMFA מקבע (ראה חומרים ושיטות) ורוק במשך 20 דקות. הגנו על ביציות מן האור על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביציות ידי הסרת מקבע והחלפת עם נפח שווה של חיץ MBSH. חזור על פעולה זו עוד פעם לשטוף עבור סכום כולל של שני שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביציות לתוך מתנול anhydrous: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חצי נפח, להחליף עם מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב "a" פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הפתרון, להחליף עם מתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכנים התמונה. </li></ol> חלק 6: הדמיה לוקליזציה RNA באמצעות מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה, להוסיף סליקה של מוריי בינוני (02:01 בנזיל בנזואט, בנזיל אלכוהול) כדי FluoroDish כוס התחתונה (WPI Inc) כדי לכסות את פני השטח הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת ביציות של מתנול כדי FluoroDish, צמצום נפח של מתנול העבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה על מיקרוסקופ confocal הפוכה (השתמשנו בהצלחה LSM510 Zeiss ו TCS לייקה SP2). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1704/1704fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1:.. ויזואליזציה של לוקליזציה RNA subcellular ידי Microinjection מדביקים לו תווית של תמלילי fluorescently microinjection א בעקבות, RNA שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 546 מוגבל בתחילה לגרעין B. אחרי שמונה שעות של תרבות, RNA שכותרתו fluorescently השליטה ניתן לראות באופן אחיד מופץ הציטופלסמה של הביצית. C. עם זאת, RNA שכותרתו fluorescently המכיל רצפים כי לגייס את מכונות התחבורה ניתן לראות תהליך של לוקליזציה subcellular לקוטב הצמחי של הביצית (לכיוון למטה). בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol><li>Cohen, S., Au, S., Pant, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> JoVE. 24, (2009).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J. Morphol. 136, 153-179 (1972).</li>
<li>Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+transport+in+ovo%3A+Simultaneous+visualization+of+two+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA transport in ovo: Simultaneous visualization of two RNAs.</a> Mol Reprod Dev. 76, 1115-1115 (2009).</li>
<li>Gautreau, D., Cote, C. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+copies+of+a+subelement+from+the+Vg1+RNA+localization+sequence+are+sufficient+to+direct+vegetal+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two copies of a subelement from the Vg1 RNA localization sequence are sufficient to direct vegetal localization in Xenopus oocytes.</a> Development. 124, 5013-5020 (1997).</li>
<li>Lewis, R. A., Gagnon, J. A., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTB%2FhnRNP+I+is+required+for+RNP+remodeling+during+RNA+localization+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PTB/hnRNP I is required for RNP remodeling during RNA localization in Xenopus oocytes.</a> Mol Cell Biol. 28, 678-6786 (2008).</li>
<li>Messitt, T. J., Gagnon, J. A., Kreiling, J. A., Pratt, C. A., Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+kinesin+motors+coordinate+cytoplasmic+RNA+transport+on+a+subpopulation+of+microtubules+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple kinesin motors coordinate cytoplasmic RNA transport on a subpopulation of microtubules in Xenopus oocytes.</a> Dev Cell. 15, 426-436 (2008).</li>
<li>Mowry, K. L., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegetal+messenger+RNA+localization+directed+by+a+340-nt+RNA+sequence+element+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vegetal messenger RNA localization directed by a 340-nt RNA sequence element in Xenopus oocytes.</a> Science. 255, 991-994 (1992).</li>
<li>Yoon, Y. J., Mowry, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Staufen+is+a+component+of+a+ribonucleoprotein+complex+containing+Vg1+RNA+and+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vg1 RNA and kinesin.</a> Development. 131, 3035-3045 (2004).</li>
</ol>

ניסויים בעזרת חיות מעבדה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת בראון.

כאן יש לנו הציגה פרוטוקול המאפשר הדמיה לוקליזציה mRNA ב ביציות Xenopus. שיטה זו, באמצעות שכותרתו fluorescently תעתיקי רנ&quot;א יש אות גבוה יחס רעש ממה שהושג בעבר עם digoxigenin שכותרתו תמלילי והוא פשוט יותר מהר מאשר ב-situ גישות מבוסס (Mowry ו מלטון, 1992, Gautreau et al. 1997). באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להנדס רצף הרנ&quot;א מוטציות במהירות לבדיקת תפקוד vivo. יתר על כן, באמצעות נוסף Alexa-UTP fluorophores, מספר מינים RNA יכול להיות הביצית דמיינו את אותו הדבר. ...

A correction to the step 2 of Part 1 for article Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes.

Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

חיץ 10X Tx <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 מ&quot;מ MgCl 2 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ spermidine-HCl </li></ul> 20x כובע / NTP לערבב <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM CTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM ATP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 9 מ&quot;מ UTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ GTP </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ G (PPP) G שווי אנלוגי (ניו אינגלנד Biolabs) </li></ul> G-50 טור <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מימה גרם Sephadex G-50 חרוזים (Sigma Aldrich) ב 100 מ&quot;ל deionized H 2 O. DEPC לטיפול למשך 30 דקות. ו החיטוי. חנות מניות שלם בטמפרטורת החדר. לפני השימוש, מוסיפים את הבאים RNase ללא פתרונות: </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 0.2 M EDTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ל 1 M טריס pH 8.0 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ&quot;ל 20% SDS </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות להשלים G-50 פתרון ב 4 ° C. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לבטל את הבוכנה של מזרק 3 מ&quot;ל (BD Biosciences) והמקום חבית של המזרק לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל חרוטי (קורנינג). הכנס את המזרק עם כמות קטנה של צמר זכוכית (תוסף בערך בגודל חצי פרוטה). </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים מערבולת ה-G-50 הפתרון resuspend חרוזים. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל G-50 הפתרון בעמודה ריקה. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דקה 1 ב 1000 x g בצנטריפוגה benchtop. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl DEPC שטופלו deionized H 2 O כל עמודה. ספין. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעמיים נוספות עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחבית המזרק צינור טרי 15 מ&quot;ל חרוטי. </li></ul> Collagenase פתרון <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 מ&quot;ג collagenase מ Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 מ&quot;ל 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4) </li></ul> MBSH חיץ <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 88 mM NaCl </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM KCl </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.4 mM NaHCO 3 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.82 mM MgSO 4 X 7H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.41 mM CaCl 2 X 2 O 6 שעות </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 10 מ&quot;מ (pH 7.6) </li></ul> תרבות הביצית בינוני <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50% L15 בינוני </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 15 מ&quot;מ (pH 7.6) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אינסולין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גנטמיצין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / ml nystatin </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / ml פניצילין </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין </li></ul> MEMFA פתרון <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1 מ מגבים (pH 7.4) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;מ EGTA </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM MgSO 4 </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.7% פורמלדהיד </li></ul> מחשוב תשואה RNA <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע לאלף הופעות &quot;קלט&quot; ו &quot;שילב&quot; דגימות באמצעות מונה נצנץ סטנדרטי. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב = (&quot;שילב&quot;) / (10 x &quot;קלט&quot;) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> שילוב ערכים אופייניים נעים בין ~ 0.03 ו 0.10. </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> התשואות התיאורטיות מירבי polymerases שונים: T7, T3, SP6 - 2.64 מיקרוגרם </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובת התשואה מיקרוגרם = (תשואה מקסימלית של פולימראז בשימוש) X (שילוב) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל RNA ל 50 ננומטר = (מיקרוגרם RNA) / 320 / (אורך של רנ&quot;א בבסיסי) / (5X10 -8) </li><li class="none" style=";text-align:right;direction:rtl"> התגובה בדרך כלל תשואות ~ 50-100 μl של רנ&quot;א על ​​50 ננומטר. </li></ul>

הדמיה ב-rna לוקליזציה xenopus ביציות

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

לוקליזציה RNA הוא מנגנון שימור של הקמת הקוטביות בתא. Vg1 mRNA localizes לקוטב הצמחי של ביציות Xenopus laevis ופועלת במרחב להגביל ביטוי גנים של חלבון Vg1. פיקוח הדוק של הפצה Vg1 באופן זה נדרש מפרט שכבת נאות נבט בעובר המתפתח. אלמנטים RNA הרצף UTR 3 &quot;של ה-mRNA, את אלמנט Vg1 לוקליזציה (VLE) נדרשים ומספיקים להעביר ישירות. כדי לחקור את ההכרה והובלה של mRNA Vg1 in vivo, פיתחנו טכניקה הדמיה המאפשרת ניתוח נרחב של טרנס גורם מנגנוני הובלה מכוונת דרך readout ויזואלית פשוטה. כדי להמחיש לוקליזציה RNA, אנו לסנתז שכותרתו fluorescently RNA VLE ו microinject זו תעתיק לתוך ביציות בודדים. אחרי תרבות הביצית כדי לאפשר הובלה של RNA מוזרק, ביציות הן קבועות מיובש לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ויזואליזציה של דפוסי לוקליזציה mRNA מספק readout לניטור מסלול שלם של רנ&quot;א התחבורה לזיהוי תפקידים בהכוונת RNA תחבורה cis-משחק גורמים בתוך התמליל ואת טרנס משחק הגורמים לאגד את VLE (Lewis et al. 2008, Messitt et al. 2008). הרחבנו את הטכניקה הזו באמצעות לוקליזציה בשיתוף עם RNAs נוספים חלבונים (גניון ו Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), בשילוב עם הפרעה של חלבונים המנוע את cytoskeleton (Messitt et al. 2008) לחקור המנגנונים לוקליזציה mRNA.

ויזואליזציה של<em&gt; In vivo</em&gt; RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ&quot;א שכותרתו fluorescently לתוך<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

מיקום של RNA הוא מנגנון שמור להקמת קוטביות תאית. mRNA של Vg1 ממוקם בקוטב הצמיחתי של ציטות (oocytes) של *Xenopus laevis* ופועל כדי...

בפרוצדורה זו, מוזרקים תסריטי RNA המסומנים פלואורסצנטית לתוך ציטות של XUS ומיקומם מנוטר. ראשית, ה-RNA מסומן עם נוקלאוטידים פלואורסצנטיים.בתגובת תמלול in vitro, ה-RNA נטען לאחר מכן למכשיר מיקרו-הזרקה. הביציות מונחות בצלחת הזרקה ועוברות מיקרו-הזרקה בזהירות. לבסוף, הביציות נתרחמות כדי לאפשר להתרחשות לוקליזציה של ה-RNA לפני הדמיה במיקרוסקופ קונפוקאלי.שלום, אני ג'יימס גניאן מהמעבדה של ד"ר קימברלי מלורי במחלקה לביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא וביוכימיה באוניברסיטת בראון. היום נדגים לכם פרוצדורה להדמיה של לוקליזציה סוב-צלולרית של RNA באוציט של Xap. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור את ארכיטקטורת ה-RNA ואת הגורמים החלבוניים הדרושים ללוקליזציה של RNA במהלך התפתחות מוקדמת של חולייתנים.אם כן, בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, בצעו תמלול של mRNA, המסומן הן רדיואקטיבית והן פלואורסצנטית כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. הוסיפו DNase כדי לפרק את ה-DNA התבנית, ולאחר מכן עצרו את התגובה על ידי הוספת EDTA.הסר נוקלאוטידים שלא נקשרו ומולקולות קטנות אחרות על ידי סבב (spinning) דרך עמודת G 50. לאחר מכן רכז את ה-RNA באמצעות שקיעת אתנול, שטוף אותו והמס אותו מחדש. לאחר קביעת הריכוז באמצעות ספירה ניצוטית (scintillation counting), דלל את ה-RNA ל-50 nano molar ואחסן במנות (aliquots) של five microliter בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.בעת ההכנה לביצוע המיקרו-הזרקה, הפשיר אלקווא (Eloqua) של ה-RNA המסומן והדנאטורה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, סובב במשך 10 דקות במהירות מרבית במיקרו-צנטריפוגה בטמפרטורה של חדר כדי להסיר חלקיקים, ושמור על קרח. כעת, בודד את התאים: העבר חתיכות של שחלה מ-*Xenopus laevis* לתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 25 מיליליטר של 3 מיליגרם למילליטר.Collagenase בבופר פוספט פוטסיום 0.1 מולרי ב-pH 7.4. נערו בעדינות בטמפרטורה של 18 degrees Celsius בשל שונות בין סדרות ייצור. זמן הטיפול ב-Collagenase עשוי להשתנות ויש לנטרו בקפידה באמצעות בדיקה ויזואלית.כדי להבטיח הפלה של העלים, המשיכו לנער במשך 15 דקות או עד שהציטות יופרדו באופן גלוי מהשחלה, ואפשרו לציטות לשקוע לתחתית הפרועת הקונית. הסירו את התמיסה והחליפו אותה בבופר MBSH. חזרו על פעולה זו, ושטפו פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות.בשלב הבא, מיין ידנית תאי ביצה (CYTES) בשלב שלושה עד ארבעה ובפר ביומב (MBSH buffer) תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. תאי ביצה בשלב שלושה הם אטומים לחלוטין, אך לבנים. בעוד שתאי ביצה בשלב ארבעה גדולים מעט יותר ומנוקדים בפיגמנט.ציטות השקופות במקצת הן צעירות מדי, וציטות בעלות פיגמנטציה מלאה או כאלה המראות התפלגות פיגמנטים מקוטבת הן ישנות מדי. לבסוף, הכינו את המחטים להזרקה זעירה (microinjection) באמצעות קפילריות של שלושה וחצי אינץ', על ידי משיכה והשחזה כדי ליצור מחטים בעלות קוטר חיצוני של כ-0.05 millimeters. כעת, כאשר ה-mRNA, הציטות והמחטים מוכנים, עברו לשלב ההזרקה הזעירה.התחילו בכיול המחט עם מי תהסמיה (desy water) כדי להחדיר שני ננומטרים בכל הזרקה. טענו את המחט באמצעות מיקרו-מזרק מבוקר גז וכיילו את גודל הטיפה באמצעות מיקרומטר. לאחר הכיול, טענו את ה-RNA המיועד להזרקה לתוך המחט. לאחר מכן, הניחו את הביציות הממוינות על צלחת הזרקה בבופר MBSH; הצלחת מכילה שכבה של גומי-ספוג שחור.הציטות הלבנות בולטות היטב על רקע שחור. לאחר מכן, מזריקו בזהירות לכל ציטה 2 liters של RNA בריכוז 50 nanomolar. ודאו שאתם מזריקים לכל ציטה פעם אחת בלבד, ובדקו את המחט באופן קבוע לאטימה לאחר השלמת ההזרקה.רוקנו את שארית ה-RNA, שטפו את המחט במים מזוקקים וטענו את ה-RNA הבא להזרקה. לאחר ההזרקה, העבירו את התאים המוזרקים לבאר של פלטת 24 בארות סטרילית; ניתן לתרבת עד אלף תאים בכל באר.הסיר את התמיכה והחלפה אותה ב-400 µL של מצע גידול לתאי cyte לכל באר. לאחר מכן, הנח את פלטת התרבית בתוך מיכל פלסטיק עם נייר סופג רטוב כדי לשמור על סביבה לחה במהלך התרבית, והדגר את הציטות בטמפרטורה של 18 °C למשך נקודות זמן שנעות בין שמונה ל-48 שעות לאחר תקופת ההדגרה הרצויה. ניתן להכין את הציטות למיקרוסקופיה לאחר הדגרת הציטות המוזרקות.הפרידו את התאים המתים והניחו את התאים השורדים בתוך מבחנות זכוכית. באופן שגרתי נצפה שיעור הישרדות של יותר מ-90% מהתאים. החליפו את התמיכה בקיבוע M-E-M-F-A וטלטלו את התאים במשך 20 דקות.הגנו את הביציות מאור שמש במהלך הקיבוע ולאחר סיום תקופת הקיבוע. שטפו את הביציות על ידי הסרת חומר הקיבוע והחלפתו בנפח שווה של תמיסת MBSH. חזרו על שטיפה זו פעם נוספת, לסה"כ שתי שטיפות.בשלב הבא, שטפו את ה-oocytes למתנול אנहाइडרוס. ראשית, הסירו מחצית מהנפח והחליפו אותו במתנול. חזרו על פעולה זו פעמיים נוספות.לאחר שטיפות אלו, הסירו את כל התמיסה והחליפו אותה במתנול. חזרו על שטיפת מתנול זו פעם אחת נוספת. ניתן לאחסן את הביציות המקובעות והמוסלקות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד הצילום.לפני ההדמיה, הוסיפו את תמיסת הבירוח של מארי (Marie's clearing medium) לצלוחית פלואורו של WPI עם תחתית זכוכית כדי לכסות את משטח ההדמיה. העבירו בזהירות את הביציות מהמתנול לצלוחית הפלואורו, תוך מזעור נפח המתנול המועבר, והדמיאו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך; הן ה-Zeiss LSM 510 וה-Aica TCS SP מספקים תוצאות טובות. כעת נראה מספר תמויות מייצגות של לוקליזציה של RNA תת-תאית מיד לאחר מיקרו-הזרקה; RNA פלואורסצנטי נראה בגרעין לאחר שמונה שעות של תרבית של ביקורת מסומנת פלואורסצנטית.ניתן לראות RNA מפוזר באופן אחיד בציטופלזמה של הביצית. עם זאת, RNA המסומן פלואורסצנטית המכיל רצפים המגייסים את מכבש ההובלה, ניתן להבחין בו בתהליך של לוקליזציה סוב-סלולרית לקוטב הצמחי של הביצית. הרגע הצגנו כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של RNA המסומן פלואורסצנטית לתוך ביציות של Xenopus ולהתבונן בלוקליזציה של ה-RNA באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בתמיסות שעברו טיפול ב-DEPC כדי למנוע זיהום של ה-RNA, לגדל את ה-oocytes ב-OCM המכיל אנטיביוטיקה, ולהגן על ה-oocytes מאור שמש ככל הניתן כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photo bleaching). זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

visualizing-rna-localization-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

אנו מתארים את האוסף של...

ייצור של<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; ביצה מחלץ לזהות RNAs microtubule הקשורים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד להחדיר מיקרוקל DNA/dotap תערובת לתוך eyebuds של יום אחד xenopus זריזה העוברים, וכיצד התמונה ולשחזר חלבון פלורסנט בודדים ירוק (gfp) המבטא האופטית סיבי סוכת ב tectal מידות של . שלמים וחיים של...

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .

קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

אנו מתארים שיטות להמחשת שעתוק ראשוני במהלך הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים במהלך העובר המוקדם.

המחשת הפעלת הגנום הזיגוטי בתאים בודדים של עוברים מוקדמים

למד הדמיה של תעבורת RNA בזמן אמת בביציות Xenopus באמצעות תיוג פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקה של RNA ומיקומו התת-תאי בפיתוח מוקדם.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

גלה סרטונים נוספים