הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות
14 בינואר 2010
ויזואליזציה של In vivo RNA תחבורה מושגת על ידי microinjection של תעתיקי רנ"א שכותרתו fluorescently לתוך Xenopus ביציות, ואחריו מיקרוסקופיה confocal.
בהליך זה, RNA מתויג פלואורסצנטי. תעתיקים מוזרקים לתוך XUS Cytes ולוקליזציה שלהם מנוטרת. ראשית, ה-RNA מסומן בנוקלאוטידים פלואורסצנטיים.
בתגובת שעתוק במבחנה, ה-RNA נטען לאחר מכן למנגנון מיקרו-הזרקה. הביציות מונחות על צלחת הזרקה ומזריקות בזהירות מיקרו. לבסוף, הביציות עוברות תרבית כדי לאפשר לוקליזציה של RNA להתרחש לפני הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.
היי, אני ג'יימס גניאן מהמעבדה של ד"ר קימברלי מלורי במחלקה לביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה של התא וביוכימיה באוניברסיטת בראון. היום אנו הולכים להראות לכם הליך להדמיית לוקליזציה של RNA תת-תאי בביציות Xap. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את ארכיטקטורת ה-RNA וגורמי החלבון הנדרשים ללוקליזציה של RNA במהלך התפתחות מוקדמת של בעלי חוליות.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, תמלל mRNA, המסומן הן רדיואקטיבית והן פלואורסצנטית כמתואר בפרוטוקול הכתוב הנלווה. הוסף DS כדי לפגוע ב-DNA של התבנית, ולאחר מכן עצור את התגובה על ידי הוספת EDTA.
הסר נוקלאוטידים לא משולבים ומולקולות קטנות אחרות על ידי סיבוב דרך עמודת G 50. לאחר מכן ה-RNA מרוכז על ידי משקעי אתנול, נשטף ומושעה מחדש. לאחר קביעת הריכוז על ידי ספירת נצנוץ, יש לדלל את ה-RNA ל-50 ננו מולאר ולאחסן בחמישה מיקרוליטר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.
כאשר הם מוכנים לבצע את המיקרו-הזרקה, הפשירו Eloqua של דנטורציה RNA מסומנת ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן סובב במשך 10 דקות במהירות מקסימלית במיקרו צנטריפוגה בטמפרטורת החדר כדי להסיר חלקיקים ולשמור על קרח. לאחר מכן, בודדו את חתיכות גזם הציטים של שחלת xap post lavu לשניים חרוטיים של 50 מיליליטר המכילים 25 מיליליטר של שלושה מיליגרם למיליליטר.
קולגנאז במאגר אשלגן פוספט 0.1 מולרי ב-pH 7.4. יש לנער בעדינות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס עקב שינויים בין אצווה לאצווה. זמן הטיפול בקולגנאז עשוי להשתנות ויש לעקוב אחריו בקפידה באמצעות בדיקה ויזואלית.
כדי להבטיח את הסרת העלים המשך לרעוד במשך 15 דקות או עד שהביציות מופרדות באופן נראה לעין מהשחלה, הניחו לביציות להתיישב בתחתית הצינור החרוטי. הסר את התמיסה והחלף במאגר MBSH. חזור על זה, שטוף פעמיים נוספות בסך הכל שלוש כביסות.
לאחר מכן, מיינו ידנית את שלב 3 עד 4 CYTES ומאגר MBSH תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי. ציטים בשלב 3 הם אטומים לחלוטין, אך לבנים. בעוד שציטים בשלב 4 מעט גדולים יותר ומנומרים בפיגמנט.
ציטים מעט שקופים הם צעירים מדי וציטים בעלי פיגמנט מלא או מציגים פיזור פיגמנט מקוטב הם זקנים מדי. לבסוף, הכינו את המחטים למיקרו-הזרקה באמצעות נימים של שלושה וחצי אינץ' המושכים ומשופעים ליצירת מחטים בקוטר חיצוני של כ-0.05 מילימטרים. כעת, כשהביציות והמחטים של ה-mRNA מוכנות, המשך למיקרו-הזרקה.
התחל בכיול המחט במי desy כדי לספק שני ננומטר לכל הזרקה. קדמי. טען את המחט באמצעות מזרק מיקרו מבוקר גז וכיול את גודל הטיפה באמצעות מיקרומטר לאחר כיול טען קדמי את ה-RNA שיוזרק למחט. לאחר מכן מניחים את הביציות הממוינות על צלחת הזרקה במאגר MBSH, המנה מכילה שכבה של גומי קצף שחור.
הצייט הלבן בולט היטב על רקע שחור. לאחר מכן יש להזריק בזהירות לכל ביצית שני ליטרים של RNA בטמפרטורה של 50 ננו-מולר. הקפידו להזריק כל ביצית פעם אחת בלבד ובדקו את המחט באופן קבוע לאיתור סתימה בסיום ההזרקה.
הוציאו את ה-RNA שנותר, שטפו את המחט במי desy וטענו את ה-RNA הבא להזרקה. לאחר ההזרקה מעבירים את הציטים המוזרקים לבאר של צלחת סטרילית של 24 בארות עד אלף. ניתן לתרבת CYTES לכל באר.
הסר את המאגר והחלף אותו ב-400 מיקרוליטר של מדיום תרבית ציטים לבאר. לאחר מכן הניחו את צלחת התרבות בתוך מיכל פלסטיק עם מגבת נייר רטובה כדי לשמור על סביבה לחה במהלך התרבות, דגרו ביציות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס לנקודות זמן הנעות בין שמונה ל -48 שעות לאחר תקופת הדגירה הרצויה. ניתן להכין את הביציות למיקרוסקופיה לאחר הדגירה של הביציות המוזרקות.
מיין את כל הביציות המתות והניח את הביציות ששרדו בבקבוקוני זכוכית. הישרדות של יותר מ-90% מהביציות נצפית באופן שגרתי. החלף את המאגר בקיבוע M-E-M-F-A ונדנד את הצייטים למשך 20 דקות.
הגן על הביציות מפני אור השמש במהלך הקיבוע לאחר סיום תקופת הקיבוע. שטפו את הביציות על ידי הסרת הקיבוע והחלפתו בנפח שווה של מאגר MBSH. חזור על שטיפה זו פעם נוספת בסך הכל שתי כביסות.
לאחר מכן, שטפו את הביציות למתנול נטול מים. ראשית, הסר מחצית מהנפח והחלף במתנול. חזור על זה עוד פעמיים.
לאחר שטיפות אלה, הסר את כל התמיסה והחלף במתנול. חזור על שטיפת המתנול הזו פעם נוספת. ניתן לאחסן את הביציות הקבועות והמיובשות במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לצילום.
לפני ההדמיה, הוסף את מדיום הניקוי של מארי לצלחת פלואורו WPI תחתית זכוכית כדי לכסות את משטח ההדמיה. העבירו בזהירות את הביציות ממתנול לצלחת הפלואורו, תוך מזעור נפח המתנול המועבר בתמונה של הביציות במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, גם Zeiss LSM חמש 10 וגם aica TCSs P נותנים תוצאות טובות. כעת נראה כמה תמונות מייצגות של לוקליזציה של RNA תת-תאי מיד לאחר הזרקת מיקרו-הזרקה ניתן לראות RNA פלואורסצנטי בגרעין לאחר שמונה שעות של תרבית של בקרה עם תווית פלואורסצנטית.
ניתן לראות RNA מופץ באופן אחיד בציטופלזמה של הביצית. עם זאת, ניתן לראות RNA מסומן פלואורסצנטי המכיל רצפים המגייסים את מנגנון ההובלה בתהליך הלוקליזציה התת-תאית לקוטב הירקות של הביצית. זה עתה הראינו לכם כיצד להזריק מיקרו רנ"א עם תווית פלואורסצנטית לתוך ציטים של זאפ ולצפות בלוקליזציה של רנ"א על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בתמיסות שטופלו כדי למנוע זיהום RNA לתרבית, הציטים שלך ב-OCM מכילים אנטיביוטיקה, וכדי להגן על הציטים שלך מפני אור השמש במידת האפשר כדי למנוע הלבנת תמונות. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הוויזואליזציה של מעבר RNA in vivo באמצעות טרנסקריפטים של RNA המסומנים פלואורסצנטית שמוזרקים לאוציטים של Xenopus. מיקומו של ה-RNA מנוטר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של RNA
רקע
- הסעה של RNA חיונית לתהליכים תאיים שונים.
- ציטות של Xenopus משמשות כמערכת מודל לחקר דינמיקה של RNA.
- סימון פלואורסצנטי מאפשר ויזואליזציה של RNA בזמן אמת.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מספקת יכולות דימוי ברזולוציה גבוהה.
מטרת המחקר
- להדמיה של הובלת RNA בתוך תאים חיים.
- להבנת המנגנונים של לוקליזציית RNA.
- לשימוש בשיטה מהימנה לחקר דינמיקת RNA בביציות (oocytes).
שיטות ששימשו
- סימון פלואורסצנטי של תמלילי RNA באמצעות נוקלאוטידים.
- מיקרו-הזרקה של RNA לתוך ציטות (oocytes) של Xenopus.
- תרבית של ציטות כדי לאפשר לוקליזציה של ה-RNA.
- דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית למעקב אחר הובלת ה-RNA.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של הובלת RNA באוציטים.
- הדגמה של יעילות הסימון הפלואורסצנטי.
- תובנות לגבי דפוסי הלוקליזציה של RNA.
- תיקוף של מיקרוסקופיה קונפוקלית ככלי למחקרי RNA.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה עוצמתית לחקר הדינמיקה של RNA.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנוני ההובלה של RNA.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי להשיג תובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של לוקליזציית RNA בסיטיוציטים של Xenopus מאפשרת בחינה ישירה של מנגנוני הובלת RNA, ובכך תומכת בגילויים מוקדמים ובתיקוף מטרות בתחומי קוטביות התא והביולוגיה ההתפתחותית. גישה זו, המבוססת על דימוי, מספקת ביטחון חיזוי למחקרים פונקציונליים של אלמנטים הפועלים בשיטת cis ו-trans, ומסייעת בקבלת החלטות מותאמות סיכון בפיתוח מודלים פרה-קליניים. התוצרים הכמותיים והניתנים לשחזור של השיטה מקלים על מיון הפורטפוליו והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור אסטרטגיות טיפוליות המכוונות ל-RNA.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של לוקליזציית RNA להבהרת נתיבי ההובלה והדטרמיננטים המולקולריים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של רצפי אלמנטים וגורמי חלבון המעורבים בתעבורת RNA.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין אירועי לוקליזציה ספציפיים לאלו שאינם ספציפיים.
- מקל על חקירה מבוססת היפותזה של אינטראקציות RNA-חלבון הרלוונטיות לפולריות התא.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס בדיקת דימות מתוקפת לכימות דפוסי לוקליזציה של RNA בתאים חיים.
- תומך בסטנדרטיזציה ובשחזור באמצעות פרוטוקולי מיקרו-הזרקה ודימות מבוקרים.
- מאפשר סקילביליות לסריקת השפעות של מולקולות מועמדות או הפרעות גנטיות על טרנספורט של RNA.
- מספק תוצאות כמותיות המתאימות לניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול של פגמים במיקום ה-RNA המעורבים בהפרעות התפתחותיות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשרות לביצוע מחקרים מכניסטיים במודל של חולייתן.
- תומך בקידום מותאם סיכונים באמצעות קישור בין מנגנונים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות באוציטים.
- מציע ערך ניבוי לזיהוי ביומרקרים טרנסלציונליים המבוססים על דינמיקת מיקום ה-RNA.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכניקת דימוי זו משתלבת ברצף השלב שבין הגילוי למחקר הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות, תיקוף מכניסטי וניתוח כמותי של לוקליזציית RNA במערכת מודל.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה ישירה של מעבר RNA.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקה ושחזור לצורך הערכת ההשפעה של התערבויות מולקולריות על לוקליזציה של RNA.
- אנליטיקה: מספקת פלטי דימות כמותיים להשוואה סטטיסטית חזקה בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תובנות מנגנוניות לפנוטיפים רלוונטיים למחלה בהתפתחות מוקדמת של חולייתנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר למחקר אירועי לוקליזציה מגוונים של RNA וגורמים רגולטוריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי לוקליזציה של RNA.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות מבוססות דימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת תוצאות תפקודיות חסונות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של תוכניות המכוונות ל-RNA בהסתמך על נתונים מכניסטיים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית (microinjection), בדימות קונפוקאלי וטיפול ב-RNA.
- דורש גישה לריאגנטים לסימון פלואורסצנטי ותשתית למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההזרקה והדימות בין צוותים שונים לצורך שחזוריות.
- עשוי לדרוש התאמה עבור סוגי RNA שונים או מערכות מודל בהתאם לרצף ולמנגנוני ההובלה.
- מגבלות מעשיות כוללות את יציבות ה-RNA, הבהייה פוטוכימית (photo-bleaching) ומגבלות תפוקה הגלומות להזרקה מיקרוסקופית ידנית.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
