Name: דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: למדו כיצד להפעיל ולהרחיב תאי B ממושבות טחול של עכברים C57BL/6 באמצעות אותות CD40 ו-IL-4. שיטה זו מאפשרת יצירת תאים מציגי אנטיגן לחקר תגובות חיסוניות ויישומים אימונותרפיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מבקשים להודות לד&quot;ר קלמנס Wendtner למתן tmuCD40-ליגנד, הלה קו התא.

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B (mCD40B) מ splenocytes מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד Murine (CD40L) להביע תאים הלה (tmuCD40L הלה), אשר ישמש צלחת מחויב תאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל Murine CD40-B. א הכנת תאים מזין (tmuCD40L הלה) הלה tmuCD40L הוא קו חסיד האנושי תא אפיתל, אשר מעולם לא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ"ל של 1x טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס"מ 2 במשך 10-15 דקות על 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ"ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות להפסיק עיכול עם טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ"ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ"ל עם מספר מתאים של תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 x 10 6 תאים תת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.4 x 10 6 תאים / היטב הקרנה המשמש בתרבות CD40-B Murine תא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר להקפיא (במידת הצורך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור subculturing: resuspend 2.5 x 10 6 תאים בינוניים 10 מ"ל הבחירה 75 ס"מ 2 בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 2.5 x 10 5 תאים / מ"ל) ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO 2. פיצול התאים פעמיים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור התרבות CD40-B Murine התא: אתה צריך 2.4 x 10 6 תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים tmuCD40L הלה בינוני סוג בר בצפיפות של 0.2 x 10 6 תאים / מ"ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ"ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tmuCD40L תאים הלה הם חסיד (לפחות 4 שעות: לבדוק הדבקות באמצעות מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב) </li></ol></li></ol> ב Murine CD40-B תרבית תאים I. הכנת splenocytes לגירוי-CD40 (יום 0): שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טרי מיד interleukin-4, ו - β-Mercaptoethanol ציקלוספורין למדיום הגידול Murine לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח טחול של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) ולשטוף אותו פעמיים 10-20 מ"ל DMEM בתוספת Gentamycin [15μg/mL] על ידי העברת אותה עם טיפ 10 מ"ל פיפטה משפופרת אחת לאחרת. הימנע העברת מזהמים (למשל שיער) של העכבר. בשר טחון הטחול על ידי העברת אותו דרך מסננת תא (100μm) ולשטוף מסננת עם עוד 10 מ"ל של מדיום. ספין למטה splenocytes ב XG 265 7 דקות בטמפרטורת החדר, resuspend אותם 7ml muCD40-B בינוני התא לימפוציטים נפרד על ידי צנטריפוגה צפיפות Ficoll. לשם כך התאים בשכבה על 5 מ"ל עכבר Pancoll (שחומם מראש בטמפרטורת החדר) בתוך שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 450 למשך 30 דקות ללא הבלם בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את רוב השכבה העליונה, ומשאיר את השכבה הלימפוציטים באין מפריע על הממשק. העברת שכבת הלימפוציטים לצינור 50 מ"ל טרי, לשטוף פעם עם DMEM 30 מ"ל עם Gentamycin [15μg/mL] על ידי ספינינג למטה XG 265 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 10 מ"ל של מדיום mCD40 B-הכביסה. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא. קביעת מספר תאים על ידי ספירת aliquot ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה את הכמות הנדרשת של התאים ב XG 265 במשך 7 דקות. עבור צלחת 6-באר 5 x 10 6 תאים / גם יש צורך, ובכך 30 x 10 6 תאים לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend לימפוציטים ב 1.25 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום mCD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 1 U / mL של interleukin-4 כגורם גדילה, 100 מיקרומטר β-Mercaptoethanol ו 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין כדי למנוע תולדה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ"ל!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L הלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 4 מ"ל של ההשעיה הלימפוציטים (1.25 x 10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li> ביום 3 reculture התאים (המשך II.1.). </ol> השנייה. תת של תאים mCD40B (יום 3 ולאחר מכן פעמיים בשבוע): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר mCD40B תא מצרר על ידי pipetting במרץ מעלה ומטה עם פיפטה 10 מ"ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG 265 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום mCD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 265 במשך 7 דקות. Resuspend mCD40B תאים בינוניים mCD40 B-תרבות בריכוז של 0.75 x 10 6 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרונות טרי Murine interleukin-4 בריכוז של 1 U / mL, 100 Mercaptoethanol-β מיקרומטר ו 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ​​ציקלוספורין למדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם תאים tmuCD40L מוקרן הלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 4 מ"ל של ההשעיה תא mCD40B (0.75 x 10 6 תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב תת התאים כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים Murine B לאחר סך של 14 ימים. </li></ol> ג בעיות הירי: מה אם CD40-B תאים לא גדלים? <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הצלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי מבוגר 24 שעות? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם יש זיהום עם mycoplasma? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי עשה את זה יש את הפעילות הביולוגית המתאים? </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם β-Mercaptoethanol ו ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="איור 1 א" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="איור 1 ב" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1 ב"> איור 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="איור 1 ד" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1 ד"> איור 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הלאומית האירופי לשמירה על חיות מעבדה. בהתייחסו לחוק הגרמני רווחת בעלי החיים החיות נשלטו באופן סדיר על ידי הרשויות המתאימות.

שינויים של פרוטוקול זה אפשרי, במיוחד לגבי מקורו של הגירוי-CD40 ואת סוג של זן העכבר משמש, גם מניב בדור יעילה של תאים Murine CD40-B מופעל. אחמדי et al. הראו תוצאות דומות עבור fibroblasts העכבר transfected עם Murine-CD40 ליגנד. במצגת זו בהקשר של אנטיגן קסנו ניתן לשלול בוודאות, אך מחקרים אינטנסיביים לגבי אבטחה רעילות in vivo לא נתן סימנים לדלקת או לתגובה אוטומטית חסינות הגדרה זו באמצעות האדם תאים transfected הלה. עם זאת, החלופה הטובה ביותר מייצג Murine מסיסים-CD40 ליגנד עם הפ...

א הכנת מדיה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תא מזין בינוני סוג בר </td><td> תא מזין מבחר בינוני </td><td></td></tr><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 300 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> L-גלוטמין </td><td> 300 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> mCD40-B בינוני כביסה </td><td> mCD40-B בינוני תרבות </td></tr><tr><td> מגיב </td><td> ריכוז </td><td> מגיב </td><td> ריכוז </td></tr><tr></tr><tr><td> D-ממ </td><td> </td><td> D-ממ </td><td> </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 580 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> L-גלוטמין </td><td> 580 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 4.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> גלוקוז </td><td> 4.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td><td> Gentamycin </td><td> 15 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> מ </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> ב שונות ריאגנטים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> אין סדר </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-ממ </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> חתול לא H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> דלתא בחר </td><td> לאמנות אין 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> חתול לא DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES הצפת </td><td> PAA </td><td> חתול לא S11-001 </td></tr><tr><td> ממ NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> חתול לא P02-015 </td></tr><tr><td> רקומביננטי Murine אינטרלויקין 4 </td><td> Immunotools </td><td> חתול לא 12340045 </td></tr><tr><td> ציקלוספורין </td><td> נוברטיס </td><td> חתול לא 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> טריפסין / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> ג שונות וחומרים: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> אין סדר </td></tr><tr><td> סטרילי פיפטה טיפים </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 גם צלחת </td><td> NUNC </td><td> חתול לא 140675 </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינור חרוטי </td><td> BD פלקון ™ </td><td> חתול לא 352070 </td></tr><tr><td> תרבות רקמות צפחת </td><td> Sarstedt </td><td> חתול לא 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

דגם murine של הפעלת-cd40 בתאי b

Murine Model of CD40-activation of B cells

המחקר על תאים B הוכיחו כי CD40 ההפעלה משפר את יכולת הצגת האנטיגן שלהן. כאשר מגורה עם interleukin-4 ו CD40 ליגנד (CD40L), תאים B האדם ניתן להרחיב ללא קשיים של כמויות קטנות של דם היקפיים בתוך 14 ימים על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; התאים לחולה) מתורמים בריאים, כמו גם חולי סרטן<sup&gt; 1-4</sup&gt;. תאים CD40-B להביע חשוב הלימפה מולקולות ביות והוא יכול למשוך ותאי T<em&gt; במבחנה</em<sup&gt; 5</sup&gt;. יתר על כן הם תופסים ביעילות, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T<sup&gt; 6,7</sup&gt;. תאים CD40-B הוצגו נאיבי לא רק הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון T לתאים<sup&gt; 8,9</sup&gt;. לכן CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) נחקרו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור מבוססי תאים immunotherapy1, 5,10. כדי ללמוד עוד אם התאים CD40-B לגרום האפקטיבית התגובות תא T in vivo ו ללמוד את המנגנון הבסיסי הקמנו מערכת תרבית תאים עבור הדור של CD40 המופעל בתאים Murine B. שימוש splenocytes או מטוהרים תאים B מעכברים C57BL / 6 להפעלה CD40, תנאים אופטימליים זוהו כדלקמן: החל מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים (haplotype H-2B) לימפוציטים הם מטוהרים על ידי צנטריפוגה צפיפות שיפוע ושיתוף תרבותי עם הלה תאים להביע רקומביננטי Murine CD40 ליגנד (tmuCD40L הלה)<sup&gt; 11</sup&gt;. תאים הם recultured כל 3-4 ימים רכיבי מפתח כגון CD40L, interleukin-4, ו-Mercaptoethanol ציקלוספורין הם מתחדש. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו Murine CD40-B תאים (mCD40B) עם פנוטיפ דומה APC-CD40 ל-B תאים אנושיים (איור 1 א, ב). CD40-גירוי מוביל תולדה מהיר והרחבת טהורים ביותר (&gt; 90%) CD19 + B תאים בתוך 14 ימים של תרבית תאים (איור 1 ג, ד). כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 Murine על transfectants חייב להיות מבוקר באופן קבוע (איור 2). Murine CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell הפעלה התמיינות, וכן לחקור את הפוטנציאל שלהם לתפקד APC במבחנה in vivo. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור יצירת חיסון או טיפול מונע נגד גידולים יסייע לענות על שאלות לגבי בטיחות immunogenicity של גישה זו<sup&gt; 12</sup&gt;.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את התהליך של הפעלת-CD40 והרחבה של תאים B Murine מ splenocytes של C57BL / 6 עכברים, אשר יכול לשמש תא מודל אנטיגן מציג (APC) ללמוד אינדוקציה של חסינות.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

מחקרים על תאי B הראו כי הפעלת CD40 משפרת את יכולתם להצגת אנטיגן. כאשר הם מעוררים באמצעות אינטרלוקין-4 וליגנד של CD40...

שלום, שמי טניה ויג (Tanya Wig), אני דוקטורנטית ועובדת במעבדה לאימונולוגיה של גידולים ואימונולוגיה של השתלות בבית החולים האוניברסיטאי של קלון. מחקרי מתמקדים בעיקר בתאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40 וביכולתם להשפיע על תגובות חיסוניות in vivo. במקור, תאי B אנושיים המופעלים על ידי CD 40 יוצרו כתאים מגיבים לאנטיגן חלופיים לתאים דנדריטיים.תאים אלה מיועדים לשימוש למטרות אימונותרפיה. במסגרות קליניות, תאי CD 40 B מיוצרים תחת איתות של CD 40 וסטימולציה באמצעות IL 4. בהתאם למערכת זו, ניתן להרחיב אותם לאורך מספר שבועות. לאחר אופטימיזציה של ייצור תאי CD 40 B אנושיים מ-PBMC במעבדה שלנו, העברנו עיקרון זה בהצלחה לעכברים, וזה מה שאני רוצה להראות לכם היום.החל מהטחול, אנו מייצרים תאי B של עכברים המופעלים על ידי CD 40 בתוך 14 ימים של תרבית תאים. השלבים העיקריים הם הכנת תאי מאכיל (feeder cells); לשם כך אנו משתמשים בשורת תאי מאכיל שעברו טרנספקציה של ליגנד CD 40 של עכברים, שהם תאים דבקים המוקרנים ב-78 gray ומונחים בלוחות שש-בארים. שנית, אנו מתחילים תרבית של תאי B של עכברים המופעלים על ידי CD 40 באמצעות ספלינוציטים (splenocytes) שפו purified טריים מעכברי C57BL/6, אשר מטופלים ב-interleukin 4 beta mAb של עכברים, ב-ethanol וב-cyclosporine A. תאים אלו מועברים לאחר מכן על תאי מאכיל מקורנים בלוחות שש-בארים.תהל

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

בסרטון זה אנו מדגימים את ההפעלה של מקרופאגים שמקורם במח עצם בתגובה לליפופוליסכריד חיידקי ואימונוגלובולין תוך ורידי.

הפעלת מקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר בתגובה לנוגדנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשראת דלקת במעי הגס בעכברים על ידי העברה מאמצת של תאי Tגבוהים CD4+CD45RB סינגניים לנמענים חסרי תאי T ו-B. מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים מחקים מחלות מעי דלקתיות אנושיות. שיטה זו מאפשרת לחקור את התחלת דלקת המעי הגס והתקדמות המחלה.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

העברת לימפוציטים bm12 למושתל C57BL/6 היא מודל מבוסס של זאבת אדמנתית מערכתית. כאן אנו מתארים כיצד ליזום מחלה באמצעות מודל זה וכיצד לאפיין תאי עזר זקיקי T, תאי B במרכז הנבט ותאי פלזמה על ידי ציטומטריית זרימה.

דגם bm12 העין מתנהל של זאבת אדמנתית המערכתית (לופוס) בC57BL עכברים / 6

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

נגזר מונוציט DC (MoDC) יכול לחוש כמויות זעירות של מולקולות הקשורות סכנה, ולכן טענתי בקלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של MoDC של דם וגידולים שלהם הפעלה עם מכלולים חיסוניים תוך הדגשת מפתח הזהירות הנחשבות על-מנת למנוע הפעלה מוקדמת שלהם.

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

הפרוטוקול מפרט קרצינומה מורמתי מחוץ לתמונה של שעתוק לא גנטי פגום. כאן, עיכוב כרוני של CDK9 משמש כדי לדכא התארכות פרודוקטיבי של RNA פול II לאורך גנים התגובה הפרו-דלקתיות לחקות ולחקור את התופעה הקלינית הרפואית TEבהחלט , נוכח כ 20% מסוגי הסרטן.

קו תא מורנין מבוסס מודל של עיכוב כרונית CDK9 למחקר נרחב שאינם גנטיים התארכות מומים ליקויים (TEבהחלט) סרטן

כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

למדו כיצד להפעיל ולהרחיב תאי B ממושבות טחול של עכברים C57BL/6 באמצעות אותות CD40 ו-IL-4. שיטה זו מאפשרת יצירת תאים מציגי אנטיגן לחקר תגובות חיסוניות ויישומים אימונותרפיים.

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

גלה סרטונים נוספים