חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

המטרה הכוללת של מאמר וידאו זה היא לספק תשובות לשתי השאלות הבאות. האחת, האם ניתן לבצע מחקרים על אינטראקציות חלבונים בצורה מהימנה יותר על ידי מדידת החלק של דגימת חלבון שלמעשה מסוגלת להיקשר לחלבון אחר? שנית, כיצד ניתוח קינטי יכול לתת לנו הבנה טובה יותר של יחסי מבנה, פונקציה?

שתי השאלות הללו יטופלו בניסוי שיכלול את Corp X 100, מכשיר שמזהה אינטראקציות חלבונים בזמן אמת ללא שימוש בתוויות. ניסוי זה יבחן את האינטראקציה של ציסטטין B בקר עם פפאין פרוטאז ציסטין, המבנה הגבישי של שני החלבונים בקומפלקס מצביע על מספר שאריות המעורבות בקישור לפרוטאז כדי לקבוע כיצד כל אחת משאריות האינטראקציה משפיעה על אינטראקציית הפאפין של ציסטטין B. מספר וריאנטים של ציסטטין B מיוצרים באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר.

בניסויים כאלה, תמיד קיימת האפשרות שחלבונים רקומביננטיים לא יתקפלו כהלכה, יצטברו או יתקלקלו מה שיוביל לתוצאות שגויות ובלתי ניתנות לשחזור. ל-VIACORE X 100 יש את היכולת לקבוע את חלק החלבון הזמין לקשירה על ידי ניתוח ריכוז חופשי של כיול בקיצור CFCA. גישה זו מאפשרת לקבוע את ריכוז החלבון עם פעילות קשירה נשמרת גם כאשר תקני כיול אינם זמינים.

CFCA ישמש כאן כדי לקבוע את הריכוז של וריאנטים של ציסטטין B. נתונים אלה ישמשו לאחר מכן כקלט בקביעת קינטיקה הקישור של גרסאות הציסטטין B לפפין, המוערכת גם באמצעות BOR X 100. היי, אני CLA gram מ-GE Healthcare בשוודיה.

היום עמיתתי אווה פול תראה לכם כיצד לבצע ניתוח קשרי פונקציות מבנה באמצעות BOR X 100 חלבונים רקומביננטיים עשויים להפגין קיפול לא תקין או פעילות פח רופף לאורך זמן, ולא ניתן לזהות התנהגות זו בשיטות המסתמכות על מדידת הריכוז הכולל. זה עלול למעשה להוביל לנתונים קינטיים שגויים לאחר מדידות הריכוז על ידי ניתוח ריכוז חופשי של כיול. B.A core X 100 משמש לניתוח הקינטיקה והזיקה של האינטראקציה של גרסאות ציסטטין B עם פפאן.

פרמטרים אלה יתנו תובנה לגבי מנגנון הכריכה. נתחיל בהסבר קצר על תכנון הניסוי, אז בואו נתחיל. האינטראקציה בין הציסטין, הפרוטאז, הפפין והמעכב ציסטטין B נשלטת על ידי מגעים הידרופוביים כפי שמתגלה על ידי המבנה הגבישי של שני החלבונים בקומפלקס.

מהצד המעכב, אזורי המגע הם N ו- C terminal Ns ושתי לולאות סיכת ראש. במחקר זה נבדקו ארבע מוטציות, שכל אחת מהן מכילה ציסטאין שלוש למוטציה סורית שהוחדרה על מנת למנוע דימריזציה ציסטטין B.בהתבסס על ההקשר שהתגלה במבנה הגביש, לאוצין 73 עבר מוטציה לגליצין היסטמין 75 לגליצין וטירוזין 97 שונה לאלנין. שתי מוטציות הגליצין הוצגו כדי לבחון את החשיבות של שרשראות הצד היסטידין 75 ולאוצין 73 לקשירה לפפין, שאריות הטירוזין עברו מוטציה לאלנין כדי לחקור את האינטראקציה בין מסוף C של ציסטטין B ופפין.

שלושת המוטאנטים הכפולים כמו גם INE 3 למוטציה הבודדת הסורית נבדקים לאינטראקציה שלהם עם גרסה לא פעילה של Papain S methyl popin. לצורה הלא פעילה הזו של הפרוטאוס יש קבוצת מתיל המחוברת ל-CYS 25 בשסע הפעיל. לשם הפשטות, נקרא לגרסה הזו propan לאורך כל הפרוטוקול.

CFCA מסתמך על מדידת קצב הקישור בתנאים שבהם הקצב מוגבל על ידי דיפוזיה של מולקולות אנליט אל פני השטח. זה מועדף על ידי רמות קיבוע גבוהות של הליגנד. לפני תחילת הליך הקיבוע, הנח את מאגר ה-HEPs ששימש בניסויים על המגש השמאלי והכנס את שני הצינורות.

הנח גם בקבוק פסולת ריק על המגש הימני. לאחר מכן הכנס חיישן גבס חדש חמש לתוך אתחול המכשיר באמצעות תוכנת Core X 100, ובמסך ההתחלה, לחץ על פריט כלי שבב העגינה. לחץ על התחל מסמך בתוכנה.

לאחר מכן, השתמש באשף הקיבוע כדי להגדיר את הקיבוע והקיבוע על ידי כיוון צימוד לצנזורה CM 5 ממסך ההתחלה, לחץ על כפתור האפשרויות האחרות ולאחר מכן בחר אשפים. פעולה זו מציגה חלון עם האשפים הזמינים. בחר אימוביליזציה ואז לחץ על הכפתור החדש בפינה השמאלית התחתונה, מופיע המסך הראשון של אשף הקיבוע המכוון צימוד לחיישן גבס חמש הוא ברירת המחדל.

סמן את התיבה תחת תא זרימה שני כדי לשתק בתא זרימה שני. תא זרימה אחד נותר ללא שינוי על מנת להשתמש בו כמשטח ייחוס משלוש האפשרויות הזמינות להלן. סמן את התיבה ציין זמן מגע ברמת היעד הימנית משתנה לזמן מגע, ציין זמן מגע של 900 שניות.

לאחר מכן, הזן את פרמטרי הקיבוע תחת תמיסת ליגנד חתך מולקולה. היכנסו לפפאין. לאחר מכן לחץ על הבא.

המסך הבא מציג את הפריסה של מתלה הדוגמה. עמדה אחת תחזיק et אתנולמין המשמש להשבתת הפעיל שנותר לאחר צימוד הכיוון של פפאין הליגנד למשטח השבב. הכנס את תמיסת האתנולאמין במצב אחד במצב שתיים.

הנח את הליגנד פפאין פפאין מאוחסן בעודף של מתיל סולפט ונרמז ל-50 מיקרוגרם למיליליטר במאגר נתרן אצטט של 10 מילי-מולרי. pH 4.5 מרכיב מחדש את ריאגנטים הצימוד של EDC ו-NHS מערכת צימוד האמין עם פיפטת מים מזוקקת כפולה 85 מיקרוליטר של EDC לתוך בקבוקון. כסו אותו והניחו אותו במצב שלוש.

השתמש באותו נפח עבור NHS בעמדה 4. שים לב שהקובץ החמישי צריך להיות סגור וריק על מנת שהמכשיר יערבב ED, C ו-NHS בקובץ זה. זכור גם למלא את קובץ הכביסה במצב H2O במים טריים נטולי יונים.

כאשר המתלה מתמלא בהתאם למתאר שעל המסך, לחץ על טען דוגמאות וטען את המתלה לתוך המכשיר. כאשר המתלה נטען, לחץ על הבא. לפני תחילת הריצה, מוצגת רשימת פעולות לביצוע.

ודא שכל נקודות התבליט מתקיימות כאשר הן מתמלאות. הריצה מתחילה בלחיצה על כפתור ההתחלה. הריצה מתחילה במהלך הליך הקיבוע.

הנתונים נאספים בזמן אמת. ראשית, מוזרקים ריאגנטים לצימוד. הפאפה הבאה מחוברת למשטח השבב וההליך מסתיים בהשבתה של האסטרים הפעילים הנותרים.

לאחר הריצה, חלון דו-שיח מסכם את תוצאת הריצה. בחלון זה מוצגת רמת הקיבוע. כל הליך הצימוד אמור לגרום לכ-3000 פפאין משותק RU.

לאחר שהפפאין משותק לשבב החיישן, התחל בניתוח CFCA על ידי דילול הדגימות המוטנטיות של ציסטטין B לריכוז כולל של כ-10 ננו-מולרי ב-300 מיקרוליטר לפחות. רשום את גורם הדילול כפי שנשתמש בו בהמשך הגדרת הבדיקה. התחל בהעלאת תיבת הדו-שיח של האשף כמתואר בסעיף הקודם בסעיף הריכוז של תיקיית הבדיקה.

בחר/י ״כיול חופשי״ ולאחר מכן בחר/י ״חדש״. המסך הראשון של האשף מציג את רצף ההזרקה. ההגדרות יכולות להישאר ללא שינוי מכיוון שמשתמשים כאן בשבב חיישן CM 5 ובגישת בדיקת אימוביליזציה ישירה.

לחץ על הבא במסך הבא. השאר את תיבות הסימון ראשיות לפני הפעלה והפעלה של מחזורי אתחול מסומנים. כמו כן, השאר את מספר ברירת המחדל של מחזורי האתחול ללא שינוי על שלושה.

הזן מאגר ערימות בשם שדה הפתרון. לאחר מכן לחץ על הבא. במסך הבא הזן את שם תמיסת ההתחדשות, שהיא 20 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד.

השאר את הפרמטרים האחרים ללא שינוי. לחץ על הבא כדי להציג את הטבלה לדוגמה. הגדר את הדוגמאות בהתאם לטבלת הדוגמה.

כל שורה בטבלת המדגם מביאה לשני מחזורים. אחד עם קצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה ואחד עם 100 מיקרוליטר לדקה. התחל את הריצה עם ריק.

לאחר מכן הזן את השם מקדם דיפוזיה של גורם דילול ב-20 מעלות צלזיוס ומשקל מולקולרי. עבור כל מוטציה ניתן לחשב את מקדם הדיפוזיה באמצעות כלי האינטרנט באתר המוצר. קישור לכלי זה מסופק בנווט התמיכה של התוכנה.

מכיוון שמומלץ להריץ כל דוגמה ולשכפל, העתק את הטבלה כולה מהשורה הריקה לדגימה האחרונה והדבק אותה בתחתית הטבלה. לחץ על הבא כדי להמשיך. המסך הבא מציג את מתלה הדוגמה.

הנח את הדגימות והריאגנטים במדף בהתאם לפריסה המתוארת על ידי התוכנה. טען את המתלה לתוך המכשיר על ידי לחיצה על כפתור טעינת הדגימות לאחר מכן לחץ על הבא.

לאחר טעינת הדגימות, מוצג מסך תזכורת עם רשימת בדיקה. הקפד לבדוק הכל ולאחר מכן לחץ על התחל. הנתונים נאספים בזמן אמת במהלך הריצה.

לאחר השלמת ההפעלה, סגור את החלון המציג את הנתונים שנאספו. שים לב שפריט תוצאה חדש הופיע בחלון הראשי. על מנת לחשב את הריכוזים מהנתונים, יש לבחור את פריט התוצאה החדש וללחוץ על הכפתור.

הערך באמצעות ליבה X 100. תוכנת הערכה מתחילה להציג את כל הנתונים שנאספו מסרגל הכלים, בחר ניתוח ריכוז ולאחר מכן כיול חופשי מהתפריט. בחלון הראשון, בחר את הנתונים שייכללו בניתוח.

גלול ברשימה ועבור ברשימת התצוגות כדי להציג נתונים עבור כל הדוגמאות. אם ברצונך לא לכלול נתונים, הסר את סימן הביקורת מהרשימה. לחץ על הבא כדי להתחיל בחישוב.

מודל האינטראקציה של CFCA מותאם אוטומטית לנתוני הניסוי לאחר השלמת ההתאמה, התוצאות מדווחות עבור כל דגימה בחלון התוצאה. עברו על האבזור לכל מדגם על ידי בחירת השורה המתאימה בטבלה. העמודה שנקראת ריכוז נמדד מציגה את הריכוז בדגימה שנותחה.

הריכוז בדגימה המקורית מחושב באמצעות גורם הדילול שהוזן קודם לכן ומוצג בעמודה ריכוז מחושב בסיום, לחץ על סיום כדי לשמור את התוצאה. כעת, כשאנחנו יודעים את ריכוזי החלבונים מניתוח CFCA, יש לנו בסיס מצוין למדידות הקינטיות הבאות שלנו. ניתוח קינטי יעזור לנו כעת להבין את החשיבות של שאריות חומצות אמינו מרכזיות למנגנון הקשירה.

בואו נתחיל עם הגדרה של הניתוח הקינטי. ניתוח קינטי מתחיל בעגינה של שבב חיישן חדש CM חמש לתוך המכשיר במסך ההתחלה. בחר ליצור זרימת עבודה של בדיקה עבור הזיקה של קינטיק.

בפינה השמאלית העליונה מופיע חלון דו-שיח בו מוזן מידע על הליגנד. הזן את השם פפאין בתיבת שם הליגנד ובחר חלבון אחר מרשימת סוגי המינים. לאחר מכן בחר לשתק ליגנד באופן קוולנטי באמצעות שבב חיישן CM חמש משתי הגישות האלטרנטיביות לחיבור ליגנד שהוצגו, זרימת העבודה המומלצת של הבדיקה מתוארת כעת בצד ימין של החלון.

זה מתחיל בצעד קיבוע ואחריו שלב בדיקה. לחץ על המשך כדי להמשיך. שמור את זרימת העבודה של הבדיקה כמתבקש על-ידי הזנת שם ולחיצה על שמור.

התוכנה מתארת כעת את זרימת העבודה של הבדיקה עם כפתורים הקשורים לכל שלב. השלב הראשון תחת הכנת משטח החיישן הוא למצוא pH גיוס. מכיוון ש-pH זה ידוע, לחץ על הזן ערך ידוע בתיבת הדו-שיח שמופיעה.

הזן את שם המאגר אצטט ו-pH 4.5 ובחר שמור. זרימת העבודה של הבדיקה מתעדכנת כעת בסימן ביקורת ירוק כדי לציין ששלב זה הושלם. עכשיו הגיע הזמן לשתק לחץ על כפתור ההפעלה בשלב המשותק.

זה מעלה את אותו אשף ששימש לפרופאן ואימוביליזציה לניתוח CFCA אימוביליזציה של פפין לניתוח קינטי מוגדרת באותו אופן כאן, אלא שתמיסה מדוללת יותר מוזרקת למשך פחות זמן. זאת על מנת לשתק פחות פפין כדי להימנע ממצבים שבהם שיעורי הקישור של ציסטטין להיות מוטנטים מוגבלים על ידי דיפוזיה כך שניתן למדוד נתונים קינטיים בבידוד. מכיוון ששם הליגנד ו-pH האימוביליזציה הוזנו בשלבים הקודמים בזרימת העבודה של הבדיקה, שניהם מוגדרים מראש כאן.

העדכון הנדרש היחיד הוא 50 שניות עבור זמן יצירת הקשר. לאחר מכן הקיבוע ממשיך כפי שהוצג קודם לכן. רמת הקישור הצפויה לאחר אימוביליזציה היא 50 R ru.

סימן ביקורת ירוק ליד כפתור ההפעלה מציין שהקיבוע הושלם. לאחר מכן, הזן את פתרון היצירה בזרימת העבודה בשלב. מצא תנאי יצירה מחדש על-ידי לחיצה על הזן ערכים ידועים בתיבת הדו-שיח שמופיעה.

הזן את פתרון ההתחדשות ואת זמן יצירת הקשר. לאחר מכן לחץ על שמור. כעת, לאחר שהליגנד משותק ותנאי ההתחדשות נכנסו, הכל מוגדר ליצירת נתוני קינטיקה בתיבת הבדיקה של קינטיקה ריצה, לחץ על כפתור ההפעלה בשלב הראשון בקינטיקה.

אשף הזיקה מתאר את רצף ההזרקה של כל מחזור עבור קינטיקה של מחזור בודד, המשמש כאן, אין צורך לשנות דבר. לחץ על הבא כדי להמשיך. בשלב הבא, שמור את הגדרות ברירת המחדל המציינות את ההתחלה של המערכת לפני ההפעלה.

בחר להפעיל מחזור הפעלה אחד על מנת לאזן את משטח השבב. לאחר מכן, הגדר את פרמטרי ההזרקה עבור המדגם. מכיוון שפתרון ההתחדשות צוין קודם לכן וההגדרה מוגדרת מראש, אין צורך לשנות אף אחד מהפרמטרים במסך.

לחץ על הבא. לבסוף, ציין את הדגימות. הזן שתי שורות עבור כל וריאנט מוטנטי, אחת ריקה והשנייה עם דגימה.

מחזור ריק מסומן על ידי הגדרת פרמטר הריכוז הגבוה ביותר לאפס. שניים. גרסאות ציסטטין B יכולות להתאים בכל ריצה. עבור כל מוטנט הזן משקל מולקולרי, הריכוז הגבוה ביותר ומקדם הדילול, לחץ על הבא.

במסך הבא, מתלה הדוגמה מתואר. הכן סדרת דילול של דגימות החלבון והנח את הבקבוקונים עם המכסים לתוך המתלה כפי שמתואר על המסך, בקבוקון עם חיץ ממוקם במצב 13 ובקבוקון עם תמיסת ההתחדשות ממוקם במצב 14. הקפד למלא את מצב המים במים מתוקים.

הנח את המתלה במכונה וטען את הדגימות על ידי לחיצה על כפתור טעינת הדגימות ולחץ על הבא. כמו קודם, בצע בדיקה אחרונה לפני שתמשיך בהפעלת הניסוי על ידי לחיצה על התחל נתוני אינטראקציה מופיעים בזמן אמת. בסיום הריצה, המשך מיד בהפעלת גרסאות הציסטטין B הנותרות בהתאם למה שהודגם זה עתה.

אם גרסאות הציסטטין B הנותרות מופעלות ברצף, השמט את השלב הראשי ואת מחזור האתחול על-ידי ביטול הסימון בתיבות הסימון המתאימות בשלב. בסיום כל ריצה, ניתן לגשת לנתונים מהקישור. כל התוצאות בזרימת העבודה של הבדיקה.

יופיע חלון דו-שיח עם כל התוצאות שנוצרו בתהליך עבודה זה. על מנת לחשב את קבועי הקצב הקינטי, בחר את התוצאה להערכה ולחץ על הערכה כדי שתוכנת הערכה ליבה X 100 תופעל שוב המציגה את כל הנתונים הקולקטיביים. בחר זיקה קינטית מתפריט סרגל הכלים.

במסך הראשון, ציסטאין שלוש למוטציה סורית נבחרת להערכה. הנתונים ממוטאנט זה מוצגים יחד עם הריצה הריקה שבוצעה עבור מוטציה זו להמשיך על ידי לחיצה. הבא. המסך הבא מציג את הנתונים עם הריצה הריקה מופחתת מהריצה עם הדגימה.

בחר להעריך קינטיקה על ידי לחיצה על כפתור הקינטיקה. כעת בחר להתאים את הנתונים למודל אינטראקציה של אחד לאחד. על ידי לחיצה על התאמת הכפתור, ההתאמה מוצגת על המסך כפי שהיא מחושבת.

ברגע שהוא מוכן, בקרות האיכות מוחלות ומודגשות באופן אוטומטי בתחתית. עיין בפריטי בקרת האיכות ולאחר מכן הסתכל על נתוני גרם החיישן כדי לוודא שגרמי החיישן מראים עקמומיות מספקת. כמו כן, התבונן בתרשים השיורי המציג את ההבדלים בין הנתונים שנאספו לבין המודל המותאם.

שימו לב לסטיות שיטתיות ולא אקראיות. התאמה זו מקובלת. כעת תסתכל על הנתונים הקינטיים בלשונית הדוח.

קבוע קצב האסוציאציה, קבוע קצב הדיסוציאציה וקבוע דיסוציאציה של שיווי משקל. בסיום, לחץ על סיום חזור על אותו הליך עבור כל המוטאנטים האחרים. להלן תוצאות מייצגות של ניתוח CFCA עבור גרסאות ציסטטין B השונות שנבדקו.

נתוני ריכוז הקישור הספציפיים מופקים מגרמי החיישן המתקבלים בקצבי זרימה של 10 ו-100 מיקרוליטר לדקה. כאשר משווים את הריכוז שנקבע על ידי מדידת 2 80 לזה שנקבע על ידי CFCA, ברור שבעוד שברוב המקרים החלבון פעיל לחלוטין עבור וריאנט לאוצין 73 גליצין, חלק החלבון הפעיל נמוך מאוד. הקינטיקה של גרסאות ציסטטין B הנקשרות לפפין נקבעת באמצעות קינטיקה של מחזור יחיד.

גרמי החיישן מציגים נתונים ריקים והפניות לנתונים מופחתים עם קינטי עבור מודל אינטראקציה אחד לאחד המונח בשחור. ריכוז הקישור הספציפי שנמדד על ידי CFCA עבור וריאנט לאוצין 73 הוא רק כ-10% מריכוז החלבון הכולל כפי שנקבע על ידי מדידה של 2 80. כאשר משתמשים בריכוז הנכון בחישוב הפרמטרים הקינטיים, מתברר ששיעור האסוציאציה של לוסיין 73 דומה לזה של הגרסאות האחרות.

בעוד ששיעורי האסוציאציה של המוטאנטים דומים לזה של חלבון מסוג בר, קבוע קצב הדיסוציאציה של המוטאנטים יכול להיות גבוה יותר בקרוב לשני סדרי גודל עם עלייה מקבילה בקבוע הדיסוציאציה של שיווי המשקל. הזיקה המופחתת תלויה בעיקר בשיעורי דיסוציאציה מוגברים, מה שמצביע על כך שגם לולאת הקישור השנייה וגם הקצה הסופי C של ציסטטין B תורמים לזיקה המחייבת על ידי שמירה על המעכב מחובר לאנזים לאחר היווצרות הקומפלקס, השימוש בניתוח ריכוז חופשי של כיול היה חיוני למסקנה זו מכיוון שאחד המוטאנטים התברר כבעל פעילות קשירה נמוכה מאוד, עמיתי פול הראה לכם כעת כיצד להשתמש ב-bi core X 100 במחקר פונקציות מובנה. בעת ביצוע ניסויים אלה, חשוב לזכור שלמרות שגם הריכוז וגם הניתוח הקינטי מבוססים על אותו הליך קשירה, תנאי הניסוי שונים למדי.