Name: Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-20T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: למדו שימוש במודל מיקרו-נוזלי לתרבות משותפת של תאים אפיתליים וחיידקים לחקירת אינטראקציות פתוגן-מארח. השיטה מאפשרת הדמיה של התיישבות חיידקים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0846453) לבין המכון הלאומי לבריאות (1R01GM089999).

1. המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8 1 (לא רואים בסרט הזה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקן SU-8 שיטות photolithography ליצור SU-8 "אדונים" (SU-8 2050, MicroChem, ניוטון, MA) בודה המרכיבים השונים (ממברנות PDMS של עובי שונות, שיתוף תרבות קאמרית) ב cleanroom. תבניות הורים כאלה יכולים להיות מפוברק בכל מתקן microfabrication (למשל, סטנפורד מיקרופלואידיקה יציקה; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שכפול PDMS, לחשוף את SU-8 אדונים לאדים fluorosilane בתוך תא ייבוש המחובר למקור ואקום כדי להקל על שחרור קל של PDMS מן האדון. הוסף ירידה של fluorosilane על מגבת נייר וליישם ואקום דקות אחד. הסר את האבק ולאפשר 30 דקות עבור בתצהיר של fluorosilane. שמור את המאסטר SU-8 בכלי סגור לשימוש עתידי. </li></ol> 2. Replica דפוס של PDMS מ SU-8 מאסטר 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השכבה fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS ממורה SU-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ב wt 10:01. יחס דגה בתוך תא ייבוש עבור 1hour (או עד בועות אוויר יוסרו מן התערובת PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המאסטר SU-8 בצלחת פטרי ובזהירות לשפוך את התערובת PDMS על גבי יחידת SU-8. דגה PDMS שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין את התבנית על 1200 סל"ד במשך דקה אחת כדי לקבל עובי אחיד PDMS של כ 100μm על התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את צלחת פטרי שמכילה את PDMS ואת SU-8 עובש אמן 80 ° C למשך שעה אחת כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נרפא PDMS מכוסה SU-8 המאסטר של הכיריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל עובש PDMS ממורה SU-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחה ארבעה חורים עובש PDMS באמצעות 20 הבוטה סוף מחט מד לשני פתחי הכניסה חיידקים, אחד לשקע אחד יציאת פנאומטי. </li></ol> 3. Bonding של Multilayer PDMS מכשירים: מכשיר זה מורכב עם שלוש שכבות, השכבה העליונה אשר מכיל את הערוץ העיקרי, שכבה פנאומטי הביניים, שכבת חיידקים התחתונה המכילה את הערוצים עבור חיידקים. שלוש שכבות מורכבים כמתואר להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את ממברנות PDMS עם מתנול בזהירות לקלף אותם SU 8-עובש שלהם לשלוט באמצעות מלקחיים נקיות. המקום קרום על גיליון טפלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום פנאומטי ואת השכבה fluidic על תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה במשך 40 שניות (לחץ חמצן 10 SCCM, RF כוח 100W). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החשיפה פלזמה, ליישר (תוך 10 דקות) הממברנה על התחתונה PDMS הערוץ באמצעות מלקחיים. הוספת מתנול על הממברנה ואת שכבות PDMS עוזר תנועה חופשית של השכבות, ואינה יישור קל. במקרה זה, המכשיר ממוקם על פיסת גזה כדי לאפשר לאדים מתנול לברוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure PDMS שכבות מיושר על פלטה חמה על 80 מעלות צלזיוס למשך 8 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מליטה את הממברנה פנאומטי על השכבה התחתונה, חזור על שלבים 3.2-3.4 לקשר את הערוץ על גבי המכשיר התאספו PDMS מרוכבים. </li></ol> 4. הרכבת המכשיר PDMS 3,4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים הנמלים מפרצון ו לשקע המשמש זריעת התאים האיקריוטים וחיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינורות Tygon (0.01 אינץ' OD) ליציאות ולהפעיל את השכבה פנאומטי ידי משיכת עם מזרק 20mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מודל PDMS ו שקופיות הזכוכית טרום ניקה לתוך תא פלזמה חמצן. הפעל פלזמה עבור מבלי להחיל את הוואקום 20 שניות (לחץ חמצן 20 SCCM, RF כוח 300W). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למנוע מגע בין הקיר מליטה (PDMS) באי לשקופית זכוכית, מיד לחבר מזרק למכשיר וליישם ואקום ידי משיכת מזרק מחזיק אותו במקומו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ בעדינות את המודל PDMS על גבי הזכוכית (תוך 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את המכשיר PDMS ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol> 5. טיפול משטח זכוכית עם פיברונקטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר המכשיר תחת UV למשך 15 דקות לאחר חיבור צינור ליציאת כל Tygon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי זרימת PBS מעוקרים לתוך התעלה כדי להסיר כל פסולת בערוץ. החל לזרום במשך 10 דקות כדי להסיר בועות אוויר. בועות האוויר יכול בקלות לחמוק PDMS בגלל חדירות הגז שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מלא צבע צבע לתוך התעלה פנאומטי כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על זריעת תאים אוקריוטים על הזכוכית, להכניס 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון של פיברונקטין לתוך המכשיר דגירה של 40 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את פיברונקטין עודף עם 1 מ"ל של התקשורת הצמיחה. </li></ol> 6. גיבוש ומדידה של commensal E. coli biofilm בהאיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את החיידקים commensal (למשל, החיידק BW25113/pCM18) בכלי התקשורת M9 מינימלית OD 600 ~ 1 לגיבוש biofilm commensal בתאי / איים סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את חומת האי על ידי יישום חיובי נוזל בלחץ. ממיר ביתי האוויר אל נוזל בלחץ משמש כדי למנוע היווצרות בועת אוויר בערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את ה commensal coli אל האיים עם שסתום סגור, מאפשרים לחיידקים לצרף במשך שעה 1 ב 32 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החיידקים פנויות ו perfuse השעיה חיידקי לדלל (OD 600 ~ 0.05) בשעה 0.25mL/hr למשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את biofilm עם טרי התקשורת DMEM צמיחה להסיר חיידקים רופף המצורפת ולהתכונן מצורף תא האיקריוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה biofilm באמצעות TCS Leica SP5 Confocal מיקרוסקופ לייזר סורק (Bannockburn, אילינוי), ולדמיין את הארכיטקטורה biofilm באמצעות תוכנת IMARIS 5. </li></ol> 7. מתזמן התאים האיקריוטים סביב האיים חיידקי 6-8 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים הלה מן הבקבוק רקמה תרבות resuspend ב DMEM מדיה צפיפות זריעה של 5 x 10 5 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את התאים הלה לתוך המכשיר בקצב הזרימה של 2 מ"ל / דקה באמצעות משאבת מזרק Picoplus (הרווארד Apparattus, MA). ודא קיר האי הוא הוריד כך biofilm חיידקי נפרד מאזור תא הלה. צעד זה צריך להתבצע על הבמה של מיקרוסקופ אור כך אחידות זריעת ניתן לקבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד ששקע התא כדי לצמצם את תנועת ההשעיה תא הערוץ דגירה של 6 שעות ב 37 מעלות של 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse את המכשיר עם מדיום גידול של 0.5 מ"ל / שעה כדי להסיר תאים פנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רענן התקשורת DMEM עבור הלה commensal E. coli כל 6 שעות. </li></ol> 8. מבוא של חיידקים פתוגניים לתוך האי וחשיפה התאים האיקריוטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן E. coli O157: H7 (EHEC) להדביק תאים הלה על ריבוי של זיהום (moi) של 100:1 200:1 (מספר EHEC לכל תא הלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לשטוף את החיידקים commensal רופף המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו את ההשעיה EHEC לדלל (OD 600 ~ 0.1) לתוך האיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המכשיר 37 מעלות של 5% CO 2 באינקובטור במשך 6 שעות ללא זרימה לאפשר EHEC להיחשף אותות נוכח biofilm commensal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הקיר PDMS לחשוף EHEC באיים commensal לתאי הלה במשך 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הערוץ עם PBS ואת כתם על תאים חיים ומתים באמצעות ערכת Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקומות מרובים על תמונה מיקרוסקופ פלואורסצנטי Axiovert 200 מיליון Zeiss ולהעריך את מספר התאים מת לחיות. </li></ol> 9. נציג תוצאות 9 רצף של אירועים זיהומים בדרכי העיכול היה חיקה ידי פיתוח monolayer של תאים הלה ו E. commensal coli biofilm וחשיפת EHEC כדי biofilm commensal לפני ההדבקה של תאים הלה. הצעדים מעורב בזיוף של מודל שיתוף תרבות microfluidic מוצגים באיור 1. 2A איור מראה טיוח 3 מימדי של המכשיר שיתוף התרבות. שני אזורים במכשיר שיתוף התרבות הקאמרית תרבית תאים אוקריוטים והאי חיידקי מוצגים 2B איור עם צבעים צבע שונה (סגול האזורים אוקריוטים וירוק עבור האי חיידקי). היתכנות של לבודד את האזורים התרבות חיידקים מאזור אוקריוטים שמסביב מוצג באיור 2C באמצעות צבעים צבע. איור 3 מציג תוצאות נציג מן התרבות המשותפת של תאים וחיידקים אפיתל. 3A איור מראה קולוניזציה של biofilm commensal (ירוק) על ידי אי EHEC (אדום). איור 3 ב מציג את הסמיכות של תאים אפיתל commensal E. coli עם EHEC באי חיידקי. RFP להביע EHEC וחיידקים GFP commensal להביע מרוכזים באי כאשר קיר PDMS מונמך, הממחישות את הכדאיות של בידוד חיידקי אי מתאי אפיתל. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: זריעת Cell תכנית במודל שיתוף התרבות. (1) הקיר PDMS הוא הוריד כדי ליצור אי, חיידקים commensal מוכנסים האי, פיברונקטין הוא זורם ברחבי האי. (2) תאים הלה הם זורעים באזורים המקיפים את האי. (3) אחרי תאים הלה להגיע למפגש ואת biofilm commensal פיתחה, EHEC מוחדר האי. (4) הקיר PDMS היא הרימהעד לחשיפת תאים הלה סביב האי EHEC. הבלעה מראה פרטי פעולת השסתום. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2a.jpg" alt="איור 2א" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2a"> <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig2bc.jpg" alt="איור 2bc" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2bc"> איור 2: מודל Microfluidic לתרבות משותפת של תאים וחיידקים אפיתל. (א) תלת ממדי הביצוע של המכשיר שיתוף התרבות מראה פניאומטית, ומונעת אזורים השמנה לגיבוש בין האיים חיידקי לתאי האפיתל. כל האי חיידקי (1200 בקוטר מיקרומטר ו 1000 מיקרומטר בנפרד) יש שקע כניסת נפרדת למתן התקשורת צמיחה הסרת פסולת מן האי. (ב) מיקרוסקופ של המכשיר שיתוף התרבות עם צבעים צבע מראה את האזורים השונים (אזור תא אפיתל, איים חיידקי). (ג) אמינות של מערכת השמנה פנאומטי מוצג על ידי הורדת קיר PDMS (פאנל משמאל) באמצעות ערוץ פניאומטית המופעל (כחול), מציגה צבע סגול לתוך האיים האי סגור, וזורם צבען צהוב סביב זה 48 ח כאשר קיר PDMS עולה (פאנל מימין), באזור האי חשוף צבען הצהוב שמסביב. בר סולם מייצג 500 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1749/1749fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3: עמית התרבות של תאים הלה וחיידקים. (א) תמונה פלואורסצנטי של RFP-לבטא EHEC ו-GFP להביע E. coli BW25113 באי. (ב) כיסוי של המועבר, ירוק, אדום ותמונות הקרינה במכשיר. בר סולם מייצג 200 מיקרומטר.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+integrated+passive+valves+and+pumps+for+flexible+polymer+3-dimensional+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems.</a> Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).</li>
<li>Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatically+controllable+flexible+and+polymeric+microfluidic+valve+fabricated+via+in+situ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromech+Microeng%22%5BJournal%5D)">A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development.</a> J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).</li>
<li>Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+multiplexed+control+of+latching+pneumatic+valves+using+microfluidic+logical+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures.</a> Lab Chip. 6, 623-631 (2006).</li>
<li>Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+is+an+inter-species+biofilm+signal+mediated+by+SdiA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA.</a> BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).</li>
<li>Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+with+tunable+topographies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices with tunable topographies.</a> Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).</li>
<li>Hui, E. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5722-5726 (2007).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+sensing+hydrogel+microstructures+into+micropatterned+hepatocellular+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures.</a> Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).</li>
<li>Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+epithelial+cells+and+bacteria+for+investigating+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab-on-Chip%22%5BJournal%5D)">Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions.</a> Lab-on-Chip. , (2009).</li>
</ol>

מבחני קונבנציונלי עבור התקשרות קולוניזציה הפתוגן ולנצל monolayer של התאים האיקריוטים בצלחות בתרבית רקמה שאליו מתווספים פתוגנים. מודלים אלה אינם רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הם לא לשלב biofilm חיידקי commensal שפותחה על התאים האיקריוטים. בנוסף פשוטים של תרבות טרום גדל חיידקים התאים האיקריוטים סביר להוביל קונפורמציה זו biofilms מאורגנים מאוד מבנים לפתח לאורך זמן, קשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, אל התאים האיקריוטים תרבות בנוכחות חיידקים במשך פרקי זמן ארוכים ללא אובדן משמעותי הכדאיות. מאז ...

<table><tbody><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסכת פוטוליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה (16,256 dpi)</td><td>Fineline-Imaging Inc, CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריכלורו(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-טרידקהפלואורואוקטיל)סילאן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77279</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30002.02</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סיבוב לציפוי (spin coater) ניתנת לתכנות</td><td>Laurell Tech Corp</td><td>WS0650S</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ליישור מסכות (Mask aligner)</td><td>Neurotronix</td><td>Q4000</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר צריבה בפלזמת חמצן</td><td>March Plasma System, CA</td><td>CS-1701</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכה לבדיקת חיוניות/ציטוטוקסיות Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L-3224</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

האדם במערכת העיכול (GI) בדרכי היא סביבה ייחודית שבה תאים אפיתל מעיים פתוגניים שאינם (commensal) החיידקים להתקיים. הוצע כי microenvironment כי הפתוגן נתקל בשכבה commensal חשוב בקביעת מידת קולוניזציה. שיטות התרבות נוכחי לחקירת קולוניזציה הפתוגן לא מתאימים היטב לחקירת השערה זו כאשר הם אינם מאפשרים שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אפיתל באופן המחקה את microenvironment מערכת העיכול. כאן אנו מתארים את מודל שיתוף microfluidic תרבות שמאפשרת תרבות עצמאית של תאים וחיידקים אוקריוטים, ובדיקת ההשפעה של microenvironment commensal על קולוניזציה הפתוגן. מודל שיתוף התרבות באה לידי ביטוי בפיתוח commensal<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Biofilm בין תאים הלה, ואחריו הכנסת enterohemorrhagic<em&gt; א coli</em&gt; (EHEC) לתוך האי commensal, ברצף המחקה את רצף האירועים על דלקת בדרכי העיכול.

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

מערכת העיכול (GI) האנושית היא סביבה ייחודית שבה תאי אפיתל של המעי וחיידקים שאינם פתוגניים (קומונסאלים) חיים זה לצד זה. יש לה...

פרוטוקול זה מציג את השימוש במודל חדשני של תרבית משותפת (co-culture) במיקרופלואידיקה, המאפשר גידול עצמאי של תאים אוקריוטיים לצד חיידקים כדי לבחון את השפעת הסביבה המיקרובית הקומונסלית על התנחלות של פתוגנים. מודל התרבית המשותפת מודגם באמצעות פיתוח ביופילם של e coli קומונסלי בקרב תאי hela, ולאחריו הכנסה של entero hemorrhagic e coli או EHEC אל תוך האי הקומונסלי. רצף זה מחקה את רצף האירועים בזיהום של מערכת העיכול.את מידת הקולוניזציה של תאי אפיתל על ידי EHEC מדמינים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, אני מהמעבדה לביוטכנולוגיה של מערכות מולקולריות במחלקה להנדסה כימית באוניברסיטת Texas A&M. היום נדגים לכם פרוטוקול לגידול משותף של חיידקים ותאי eCard בתוך התקן מיקרופלואידי באופן המדמה את הארגון במערכת העיכול האנושית.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד קולוניזציה של חיידקים פתוגניים בתאי אפיתל מושפעת מאותות שהם נתקלים בהם בדרכי העיכול לפני הקולוניזציה. אז בואו נתחיל. לפני התחילת הניסוי, הכינו תבנית מאסטר מסיליקון שתוכננה ויוצרה בהתאם לשימוש הניסויי המתוכנן.לדוגמה, ה-Stanford Microfluidics Foundry ייצר תבניות מאסטר (masters) מתוכננות, מהן ניתן יהיה להכין תבניות רפליקה ניסיוניות בהמשך. עבור ההתקן בעל שלוש השכבות המתואר בפרוטוקול זה, נדרשות תבניות עבור שתי ממברנות עבור שכבת תרבית התאים האיקריוטים והשכבה הפנאומטית, ותבנית אחת עבור תעלת חיידקים; גבהי התעלות עבור שכבות החיידקים, השכבה הפנאומטית ושכבת תרבית התאים האיקריוטים הם 5, 200 ו-100 מיקרומטרים, בהתאמה. לפני הכנת תבנית רפליקה, חשוף את מאסטר ה-SU eight לאדי פלואורוסיליאן (fluorocycline) בתוך כלי ייבוש (desiccator) המחובר למקור ואקום. כדי להקל על שחרור תבנית ה-PDMS מהמאסטר, הוסף טיפה של פלואורולאן (fluorolane) לנייר סופג בתא הוואקום והפעל ואקום למשך דקה אחת.שחררו את הוואקום והמתינו 30 דקות להשקעת הפלואור. שמרו את תבנית המאסטר של ה-SU eight בצלחת פטרי לשימוש עתידי ליצירת תבניות שכפול. הכינו פולימר מקשר (pre polymer) וסוכן הצלבה של PDMS ביחס משקלי של 10 ל-1 וערבבו היטב; בצעו ניתון גזים (degas) לתערובת בתא ואקום למשך שעה אחת.כדי להסיר בועות אוויר, הניחו את ה-SU eight master בצלחת פטרי ושפכו בזהירות PDMS על ה-master, תוך שימוש ב-5 g של PDMS עבור ה- ו-30 g של PDMS עבור השכבה הבקטריאלית. בצעו Degas ל-PDMS שוב למשך 10 דקות כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, סובבו את התבנית במשך דקה אחת כדי לפרוס את ה-PDMS לממברנה אחידה.בפרוטוקול זה, ממברנת תרבית התאים האוקריוטית מסובבת במהירות של 1200 RPM לעובי של 150 מיקרומטר, והממברנה הפנאומטית מסובבת במהירות של 800 RPM לעובי של 250 מיקרומטר. לאחר הסיבוב, יש להמתין 15 דקות בטמפרטורת החדר עם פטריית המשתיל המכילה את ה-PDMS המסובב ואת תבנית ה-SU eight המאסטר, לפני החממה על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת. כדי להשלים את תהליך הריפוי של ה-PDMS, הרטב את ה-PDMS במתנול וקלף אותו בזהירות מתבניות ה-SU eight המאסטר באמצעות פינצטה נקייה.הניחו את שכבת החיידקים תחת סטראאוסקופ ובאמצעות מחט בעלת קצה קהה במידה 20 gauge, קדחו שלושה חורים: שני פתחי כניסה לחיידקים ופתח יציאה אחד. התקן בעל השכבות השלוש מורכב בסדר הבא: הידבקות של השכבה הפנאומטית לשכבת החיידקים, ולאחר מכן הידבקות של שכבת תרבית התאים האיקריוטים לשכבה המשולבת של החיידקים והשכבה הפנאומטית.הניחו את הממברנה הפנאומטית ואת שכבת החיידקים על תגלית זכוכית וחשפו אותם לפלזמה בתא פלזמה של חמצן למשך 40 שניות, בלחץ חמצן של 10 standard cubic centimeters per minute, או SCCM ובהספק RF (תדר רדיו) של 100 watts. הוספת מתנול לממברנות מקלה על התנועה החופשית של השכבות ומפשטת את היישור. בתוך 10 דקות מחשיפת הפלזמה של החמצן, העבירו את שכבת החיידקים לצחנת פטרי באמצעות פינצטה וסטראאוסקופ.יישרו את ממברנת הפנאומטיקה המרכזית לשכבת החיידקים בהתבסס על חורי הכניסה והיציאה של החיידקים. לאחר היישור, הניחו את צלחת הפטרי עם מבנה ה-PDMS המיושר על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך שמונה שעות לצורך הדבקה. עם סיום התהליך, קדחו חור בשכבה הפנאומטית לשליטה בתעלה הפנאומטית.בשלב הבא, חזור על השלבים מההרכבה ועד ליישור כדי להדביק את תעלת תרבית התאים העקריוטיים להתקן ה-PDMS המורכב שהורכב. קדח חורים בפתחי הכניסה והיציאה המשמשים לזריעת תאים עקריוטיים. חבר צינורות Tigon לפתחים והפעל את השכבה הפניאומטית על ידי משיכה באמצעות מזרק של 20 milliliter.הניחו את מבנה ה-PDMS המרוכב ואת שקופית זכוכית שנוקתה מראש בתוך תא פלזמה של חמצן. הפעילו את הפלזמה למשך 20 שניות ללא החלת ואקום. הוציאו את מבנה ה-PDMS המרוכב מתא פלזמת החמצן וחברו אליו מזרק של 20 milliliter.משוך מיד כדי ליצור ואקום שימנע מגע בין השסתומים לזכוכית. החלק בתוך דקה אחת. לאחר החשיפה לפלזמה, לחץ בעדינות את מבנה ה-PDMS המרוכב על הזכוכית.בצעו פולימריזציה (Cure) למכשיר ה-PDMS על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, חברו צינורות Tigon לכל פתח ועקרו את המכשיר תחת קרינת UV למשך 15 דקות. לאחר מכן, מלאו 500 µL של PBS סטרילי במזרק של 1 mL והחדירו לערוץ כדי להסיר שאריות של פסולת.במידה ונצפית בועת אוויר, יש לסגור את צינור היציאה באמצעות מבחנת מיקרו-צנטריפוגה של einor ולהפעיל לחץ קל כדי לדחוף את הבועה החוצה דרך שכבות ה-PDMS חדירות הגז. יש למלא מים סטריליים בערוץ הפנאומטי כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בערוץ.מתמר לחץ אוויר-נוזל ביתי משמש למניעת היווצרות בועות אוויר בערוץ הפניאומטי. כדי להכין את הזכוכית לזריעת תאים איקריוטיים, הכניסו 500 µL של פיברונקטין לאזור תרבית התאים, דרך פתח הכניסה לתרבית התאים האיקריוטיים. בעזרת מזרק, השאירו את השסתום סגור והדגרירו למשך 40 דקות ב-37 °C.לבסוף, שטפו את עודפי הפיברונקטין באמצעות מיליליטר אחד של מצע גידול בעזרת משאבת המזרק. המכשיר מוכן כעת לשימוש בניסוי ליצירת ביופילם קומנסאלי; דללו בקטריות במצע מינימלי M9 עד ל-OD 600 של כ-1. בדוגמה זו, השתמשנו בזן מעבדה של e coli, אך ניתן להשתמש בכל זן בקטריאלי שאינו פתוגני.סגור את השסתום המפריד בין אזורי תרבית התאים הבקטריאליים והאיקריוטיים על ידי הפעלת לחץ נוזלים חיובי. הזרק 0.2 milliliters של e coli ב-OD 600 של כ-1.0 אל תוך האיים באמצעות משאבת מזרק, ואפשר לבקטריות להיצמד למשך שעה אחת ב-32 degrees Celsius. לאחר האינקובציה.בצעו פרפוזיה של תרחיף חיידקים מדולל בעל OD 600 של כ-0.05 ומצע גידול מינימלי M9 טרי בקצב של 0.25 milliliters לשעה למשך 12 שעות. בעזרת משאבת מזרקים, שטפו את הביופילם עם 0.5 milliliters של מצע DMEM טרי, נטול סרום ואנטיביוטיקה, בקצב של 0.5 milliliters לשעה כדי להסיר חיידקים שאינם קשורים היטב ולהכין את המערכת להיצמדות של תאי אוקריוטים. דמיינו את הביופילם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקה בלייזר Leica TCS SP5 והדמינו את ארכיטקטורת הביופילם באמצעות תוכנת ה-MS.בצעו טריפסינזציה של תאי HeLa מבקבוק תרבית רקמה וסספנדו אותם. השהו אותם במצע DMEM לנפח כולל של 0.1 milliliters בצפיפות תאים של 5×10⁵ תאים למילליליטר. הכניסו את תאי ה-HeLa לאזור האוקריוטי של המכשיר בקצב זרימה של 2 milliliters לדקה באמצעות משאבת מזריקה מסוג Pico Plus.בשלב הבא, בעזרת מיקרוסקופ אור, ודאו שהשסתום המפריד בין האזור הבקטריאלי הקומנסלי לאזור התא העקריוטי סגור לחלוטין, כך שביופילם הבקטריאלי מופרד מאזור תאי ה-helo. בעזרת מבחנת מיקרו-צנטריפוגה מסוג einor, סגרו את מוצא התאים כדי להפחית את תנועת ת сусפנזיית התאים בתעלה, והדגירו למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide.כדי להסיר תאים שאינם צמודים, רעננו את מצע ה-DMEM עבור אזורי ה-hela וה-e coli הקומנסליים כל שש שעות. הכינו e coli oh 1 5 7 H שבע, או EHEC, במצע M nine כדי להדביק תאי hela בריבוי הדבקה או MOI של 100 עד 200 תאי EHEC לתא helo אחד; שטפו החוצה חיידקים קומנסליים שאינם צמודים היטב כפי שמתואר בסעיף הקודם. הכניסו 100 µL של תרחיף EHEC מדולל עם OD 600 של כ-0.1 אל תוך האיים באמצעות משאבת מזרק בקצב זרימה של 0.25 mL לשעה.לאחר מכן, הדגרי את המכשיר בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide למשך שש שעות ללא זרימה, כדי לאפשר לחיידקי EHEC להיחשף לאותות הנמצאים בביופילם הקומנסלי. לאחר ההדגרה, פתחי את השסתום המפריד בין אזורי החיידקים הקומנסלים לתאי האוקריוטים באמצעות משאבת ואקום ליצירת ואקום, והשאירי את השסתום פתוח למשך שש שעות. פעולה זו תחשוף את תאי ה-HEC בביופילם החיידקי הקומנסלי לתאי heela; לאחר מכן, הדגרי שוב למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide.החדירו צבע live dead למכשיר שהוכן לפי הוראות היצרן. כדי לצבוע לבדיקת חיות תאי helo, מזריקים 0.1 milliliters של תמיסת עמידה לאזור האוקריוטי של המכשיר באמצעות מזרק של one milliliter, כביקורת להערכת מוות של תאי helo. בהיעדר EHEC, חזרו על שלושת השלבים הקודמים והחדירו למכשיר מצע DMEM סטרילי, נטול סרום ונטול אנטיביוטיקה.במקום EHEC, דגמו מספר מיקומים במיקרוסקופ פלואורסצנציה Zeiss AIOt 200 M, והעריכו את מספר התאים האפיתליאליים החיים בירוק בקרב התאים האפיתליאליים המתים באדום, על ידי ספירת מספר התאים הירוקים מתמונות שהושגו לפחות משבעה מיקומים. כעת נציג מספר תמונות מייצגות של התקן המיקרופלואידי של שכבת הניסוי. בתמונה זו, אנו משתמשים בצבע מאכל אינרטי כדי לייצג את אזורי התרבית השונים.הצבע הסגול מייצג את אזור תרבית התאים האוקריוטיים, בעוד שהצבע הירוק מייצג את הביופילם של החיידקים הקומנסליים. בתמונה זו אנו מדגימים את ההיתכנות של שמירה על הפרדה בין האזור האוקריוטי לאזור החיידקי, שכן הצבע הסגול באזור החיידקי נבדל מהצבע הצהוב שמסביבו. כאן מוצגת קולוניזציה של ביופילם חיידקים קומנסליים המבטאים חלבון ירוק על ידי חיידקים פתוגניים המבטאים חלבון אדום.כפי שמוצג בתמונה זו, חיידקי ה-EHEC והחיידקים הקומנסליים נבדלים מתאי ה-hela המקיפים את הביופילם החיידקי. כעת הצגנו כיצד להרכיב מכשיר מיקרו בעל שכבה יבשה לתרבית משותפת של חיידקים ותאי אפיתל, המשמש בדרך כלל לבחינת השפעת אותות שונים על קולוניזציה של פתוגנים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להסיר בועות אוויר מהמכשיר ולהשתמש בפתוגן זה בריבוי תאים מתאים להדבקה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.

microfluidic-co-culture-epithelial-cells-bacteria-for-investigating

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

אנו מציגים פרוטוקול לחקור crosstalk בין X-ray-מוקרן קאקו-2 תאי תאי דם היקפיים (PBMC). הפרוטוקול מתחיל עם קאקו-2 הקרנה ולהגדרה של תרבות משותפת עם PBMC; לאחר מכן, ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל נמדד באופן קבוע מעל 48 חשופה h ומערביות הופיעה קאקו-2 ו- PBMC.

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

דוח זה מתאר שיטה מבוססת שבב מיקרופלואידיג כדי להגדיר ניסוי של תרבות תא בודדת שבה ניתן להשיג שיוך ביעילות גבוהה וניתוח מיקרוסקופי של תאים בודדים מרובים.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

מחקר זה מתאר את הניטור המיקרוסקופית של הדבקות הפנקוקוס על מחרוזות וויללרנד של פון וילבלאנד המיוצר על פני השטח של תאים אנושיים מובחנים ראשוניים תחת לחץ הטיה בתנאי זרימה מוגדרים. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב להדמיה מפורטת של מבני תאים ספציפיים וכימות חיידקים על ידי החלת הליכי חיסוני דיפרנציאלי.

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

הפרוטוקול המוצג מתאר את הפיתוח והשימוש בטכניקת צביעת אקטין נימה מבוססת פלואידין עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) כדי להמחיש את מבנה שכבת התא הדבק בתעלות תרבית דינמיות מיקרופלואידיות ובתאי תרבית סטטיים קבועים מסורתיים. גישה זו מסייעת בהערכת מפגש שכבות התא, היווצרות חד-שכבתית ואחידות בעובי השכבה.

הכנה והערכה מבנית של חד-שכבות תאי אפיתל במכשיר תרבית מיקרופלואידית בגודל פיזיולוגי

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עם שלבי מפתח להנחיית ההנדסה והניצול של 3D Flipwell. אנו מתארים ומראים כיצד להרכיב את ערימות התוספות של תרבית משותפת ולהשתמש בהן לתרבית משותפת של שכבות מרובדות של חיידקי מעיים, אפיתל מעיים ומקרופאגים כדי לדגמן את סביבת רירית המעי.

הנדסת 3D Flipwell לפיתוח מערכות אסינכרוניות לטיפולים טוקסיקולוגיים ואימונומודולטוריים בתאי חיידקים, מעיים ומערכת החיסון

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

למדו שימוש במודל מיקרו-נוזלי לתרבות משותפת של תאים אפיתליים וחיידקים לחקירת אינטראקציות פתוגן-מארח. השיטה מאפשרת הדמיה של התיישבות חיידקים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

גלה סרטונים נוספים