Name: קביעת ריאקטיביות Titre של סרום באמצעות Assay Haemagglutination (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: למדו לבצע מבחן הצמדת תאי דם אדומים לזיהוי וכימות נוגדנים בסרום. השיטה כוללת דילול טורי של דגימות סרום בתצלובת U-bottom וניקוד חזותי של תבניות ההצמדה לקביעת רמת הריאקטיביות והטיטר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מבקש להודות מיס לורה מתיוס לביצוע הטכניקה ומר פול שפרד עבור הצילום. פרויקט זה מומן על ידי אוניברסיטת דרום אוסטרליה, תוכנית המעבדה לרפואה.

הכנת תמיסת מלח 5x שנאגרו ורונל (VBS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את תמיסת מלח שנאגרו ורונל (VBS), שלושה פתרונות שונים צריכים להיות מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 על ידי המסת 21.25gm של NaCl ו 0.94gm של Barbitone נתרן 350ml של מים מזוקקים. הריכוזים הסופי של Barbitone NaCl נתרן הם 1.02M ו 13 מ"מ בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2 על ידי המסת 1.44gm של Barbitone ב 125ml של מים מזוקקים חמים. הריכוז הסופי של Barbitone הוא 62.5mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 3 על ידי המסת 20.33gm של MgCl 2 ו 4.41gm של CaCl 2 ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. הריכוז הסופי של MgCl 2 ו CaCl 2 הוא 2.18M ו 440mM בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקס פתרונות 1 ו 2 ו להתקרר לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון משולב מתקרר, להוסיף 1.25 מ"ל של תמיסת 3 ולהתאים את ה-pH על 7.3-7.5 באמצעות 1M HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאמת עוצמת השמע הסופי 500ml עם מים מזוקקים להכין פתרון מניות 5x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון עובד 1x, לדלל את המניות 1:05 עם מים מזוקקים. </li></ol> דילול של Revercells <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend הפתרון המניות של Revercells על ידי היפוך ולאחר מכן להסיר 1ml של תאים בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 600g ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend התאים 3ml של 1x ורונל שנאגרו מלוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים כעת ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol> נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה של 50 מ"ל 1x VBS לשורות A1-A12 של צלחת 96 U היטב לתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי A1 ובכן, להוסיף 50μl של אנטי סרום ומערבבים היטב בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה קצה טריים, להסיר 50μl של נוזל מתוך A1 היטב ולהעביר אותו A2 היטב. מערבבים היטב לחזור על תהליך זה עד שתגיע גם A11 ואז להשליך את 50μl האחרון מהבאר הזאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם סרום עתה בדילול סדרתי פי 2 מ - 01:02 עד 1:2048. סרום לא מתווסף ובכן A12 כמו זו הוא שליטה VBS שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש יותר מדגם אחד בסרום תוערך, חזור על שלבים 4.1-4.4 עבור שורה ב 'וכו' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל דילולים נעשו, להוסיף 50μl Revercells של 1% על כל בארות. הערה: Revercells יתייצב לאורך זמן צריך להיות מושעה בעדינות לפני שהוא חילק לתוך בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את הדגימות על ידי הקשה על הצד של המגש microtitre, מכסים ומניחים את התגובה haemagglutination להמשיך עבור 1h על 37 ° C. חדר באינקובטור מחומם כראוי או יכול לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להסיר בזהירות את המגש מן החממה ולבחון את צלחת haemagglutination. השליטה VBS גם צריכים להיות הראשונים שנבדקו היטב. אם התגובה היא שלילית, אז התוצאות אינן תקפות. אם המדגם VBS מציג תוצאה haemagglutination חיובי, אז התוצאות לא ניתן להשתמש ותהליך יש לחזור. תגובה חיובית haemagglutination יופיע כגיליון רחבה על בסיס של הבאר, זמן תגובה שלילית תופיע בתור גלולה מרוכזת קטן של תאים במרכז הבאר. התוצאה ביניים תהיה הילה של תאים חיובי עם גרעין מרכזי של תאים pelleted. תוצאה זו מתרחשת כאשר בסרום יש כמה Ab שיכול להגיב, אבל כמויות מספיקות של Ab לגרום תגובת מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלק תוצאות נציג יש שני ייצוגים שבתרשים של התוצאות הצפויות. דוגמה של קבוצה לא חוקית ותקפה תוצאות מסופק. Titre עבור אנטי סרום יהיה גם נקבע. </li></ol> נציג תוצאות: וידאו כולל דוגמה תוצאות נציג. להלן (Fig1 ו איור 2) הן שתי דוגמאות הראו באופן שבתרשים. הדוגמה הראשונה היא של תגובה, כי לא ניתן לפרש את השליטה VBS היא חיובית, ואילו השנייה היא assay תקף המאפשר titre שייקבע. <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. דוגמה haemagglutination שבו תוצאה חיובית נכשלה. בייצוג שבתרשים לעיל, התגובה heamagglutination אינו יכול להתקבל. השליטה בסרום VBS שלילי מציג התגובה haemagglutination חיובי כפי שמעידים היווצרות גיליון בבסיס הבאר. זה מצביע על כך אירעה שגיאה והתוצאות לא יכול להתקבל. במקרה זה, התהליך צריך להיות חוזרות ונשנות. <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמה haemagglutination שבו תוצאה חיובית עבד כראוי. בייצוג שבתרשים, התגובה heamagglutination תקף. השליטה VBS שלילי מציגה תגובה שלילית haemagglutinationזה לידי ביטוי על ידי גלולה שנוצרה בבסיס הבאר. גם חיובי האחרון בשורה 7, אשר מצביע על כך titre למדגם הזה בסרום היא 128 (כלומר הגומלין של 1 / 128). זו תהיה דוגמה של נוגדן כי נוכח כמויות מתונות בנסיוב.

Assay haemagglutination היא טכניקה פשוטה המאפשרת למספר רב של דגימות נסיוב להיות מוערך בתוך פרק זמן קצר. כמו כן, יש את היתרון של להיות לקרוא ללא צורך בציוד מיוחד, עם העין להיות מתאים. טכניקה זו יכולה גם להיות שונה לצורך זיהוי של ההורמון האנושי gonadotrophin כוריוני בשתן, כחלק מבחן haemagglutination-עיכוב. ביחס למבחן haemagglutination תקן, ישנם אזורים מעטים שבהם טיפול צריך לקחת על מנת assay להתבצע כראוי. ראשית, טכניקה זו מתבססת על יישוב של תאים על משטח קעור. ככזה, הוא חיוני צלחת U-א...

<table><tbody><tr><td>Revercells</td><td>CSL</td><td>02490201</td><td>שימוש בריכוז סופי של 1%</td></tr><tr><td>Anti-A serum</td><td>CSL</td><td>02611305</td><td></td></tr><tr><td>פלטת 96 בארות עם תחתית בצורת U</td><td>TRP</td><td>92097</td><td>חייבת להיות עם תחתית בצורת U</td></tr><tr><td>תמיסת סלין מחוצנת עם Veronal</td><td></td><td></td><td>שימוש בריכוז סופי של 1x</td></tr><tr><td>חדר/אינקובטור בטמפרטורה של 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></tr><tr><td>כפפות חד-פעמיות</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת ריאקטיביות titre של סרום באמצעות assay haemagglutination

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Haemagglutination היא צורה ספציפית של התלכדות והוא משמש כאשר נוגדנים נקשרים לתאי דם אדומים, אשר פועלים כמו אנטיגן חלקיקי. כדוריות דם אדומות מטרות שימושי במיוחד כאשר הם זמינים ו התלכדות הוא הנצפה באמצעות בעין בלתי מזוינת. טכניקה זו משמשת בדרך כלל כדי לקבוע את titre של נוגדן (AB), עבור קיבוץ דם וכימות ויראלי. בסרטון הזה, השלבים מעורבים בהכנת וביצוע assay haemagglutination מודגמת באמצעות נוגדנים ספציפיים לקבוצת דם A-אנטיגנים להוסיף כדוריות דם אדומות (Revercells). Antiserum הוא מדולל סדרתי בתוך מגש 96 גם microtitre U-התחתונה, שאליו מתווסף השעיה של Revercells. דגימות הן מעורבות מודגרות אז 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר תקופה זו, הדגימות אז יכול להיות הבקיע בקלות יש, יש + ביניים התגובות (-/+) haemagglutination. גישה זו מאפשרת תגובתיות ו titre מדגם בסרום להיות מוערך באמצעות טכניקה מהירה ופשוטה. הווידאו יכסה את התיאוריה מאחורי assay, איך התוצאות לקרוא ולפרש, איך titre נקבע, כיצד assay יכולות להיות משונות כל הנושאים הקשורים לשימוש בטכניקה זו.

Haemagglutination היא סוג של התלכדות שבו הנוגדנים להיקשר לתאי דם אדומים. כדוריות הדם האדומות הן וזמין והתוצאות נצפות בקלות באמצעות בעין בלתי מזוינת. סרט הווידאו הזה ממחיש את שלבים ב assay haemagglutination, לפרש את התוצאות וקביעת titre.

קביעת ריאקטיביות Titre של סרום באמצעות Assay Haemagglutination

המגלוטינציה (Haemagglutination) היא צורה ספציפית של agglutination, והיא נעשהת כאשר נוגדנים נקשרים לתאי דם אדומים, המשמשים כאנטיגן חלקיקי. תאי דם אדומים...

קביעת התגובתיות והטיטר של סרום באמצעות בדיקת המגלוטינין. הגלוטינציה היא תגובה המתרחשת בין נוגדנים מסיסים לבין אנטיגנים חלקיקיים. אלו יכולים לכלול תאים או מולקולות נשאות.אפיטופים על פני השטח של הנשא מאפשרים לנוגדן להיקשר ולהקשר את הנשאיים יחד, דבר המוביל להיווצרות סריג מורכב הנקרא קומפלקס נוגדן-אנטיגן. המגלוטינציה של כדוריות דם אדומות (Hem agglutination) היא צורה ספציפית של הגלוטינציה שבה נוגדנים נקשרים לתאי דם אדומים, המשמשים כאנטיגן החלקיקי. תאי דם אדומים הם מטרות שימושיות מכיוון שהם זמינים במידה רבה והתוצאות ניתנות לצפייה בקלות בעין בלתי מזוינת.מדגמי סרום מדללים בסדרת דילול ולאחר מכן מוכנסים לצלחת U-bottom בעלת 96 בארות. לאחר מכן מוסיפים תרחיף של תאי דם אדומים. כאשר נוכחים נוגדנים בריכוז גבוה, מתרחשת קישור לתאי הדם האדומים, דבר היוצר רשת גדולה.כאשר סריג זה שוקע כתוצאה מכוח הגרוויטציה, הוא מתאים את עצמו לצורת פלטת ה-ubo. במבט מלמעלה, נראה גליון רחב של תאי דם אדומים. זוהי תגובת המגלוטינין חיובית.כאשר רמות הנוגדנים נמוכות, לא נוצר סריג ותאי הדם האדומים מקבלים את צורתו של לוח ה-UBO ומתרכזים בבסיסו תוך יצירת משקע קטן. זוהי תגובת המגלוטינציה שלילית. דיאגרמה זו מציגה תגובה חיובית.התאים יוצרים סריג בעודם שוקעים, והם נצמדים לצורתו של תחתית הלוח בצורת U. משמאל ומימין, אנו רואים מבט מלמעלה שבו נראה גילי רחב של תאי דם אדומים. אם קיימת כמות בינונית של נוגדנים, ייראו תצורות דמויות אותיות.הגלוטינציה של כדוריות דם מאפשרת גם לבחון את התגובתיות של דגימות סרום שונות כנגד האנטיגן הידוע. כמו כן, ניתן לקבוע את הטיטר של דגימת הסרום, כאשר הטיטר הוא הדילול האחרון שבו נצפתה תגובה חיובית.בדרך כלל, ככל שריכוז הנוגדנים בדגימת הסרום גבוה יותר, כך הטיטר גבוה יותר. תרשים זה מראה תגובת המגלוטינציה שלילית. כמות הנוגדנים הנוכחת אינה מספיקה ליצירת קשרי צלב בין כדורי הדם האדומים.בעוד התאים שוקעים כתוצאה מכוח הכבידה, הם מחליקים במורד דופן הבאר ויוצרים משקע (pellet) הדוק בתחתית. הדיאגרמה מימין מציגה את תאי הדם האדומים כפי שהם נראים במבט מלמעלה. עבור ניסוי זה, תזדקקו לפלטה אחת בעלת 96 בארות עם תחתית בצורת U.חיוני להשתמש בלוחית בעלת תחתית בצורת U, כיוון שלוחותית בעלת תחתית שטוחה לא תאפשר לתאים לשקוע למשקע, דבר שיהפוך את הפרשנות לבלתי אפשרית. פפטה המסוגלת להעביר 50 µL של סרום, תמיסה של 1% של תאי Riva ותמיסת PBS אחת לכל באר בשורה. לכל באר בטווח שבין 1 ל-12, העבירו 50 µL של PBS.זה משמש כמדלל שלך. כעת העבר 50 µL של סרום לבבור A1. זהו הדילול הראשון שלך ביחס של 1:2.באמצעות הפרפט (perpet), ודא שדגימת הסרום מעורבבת היטב. לאחר הערבוב, העבר 50 µL מבאר A1 לבאר A2. זהו הדילול השני שלך ביחס של 1:2, מה שנותן דילול של פי ארבעה.המשיכו את סדרת הדילול זו באמצעות בארות 3 עד 11. אל תניחו סרום בבאר 12, שכן זוהי בקרת השלילה שלכם ב-roal buffer saline. כעת קחו את תמיחת ה-Riva cells בריכוז 1%, לאחר שערבבתם אותה היטב, והעבירו 50 µL לבארות A1 עד A12.לאחר הוספת התאים, כסו את הפלטה והקישו עליה בעדינות כדי להבטיח ערבוב של הדגימות והתאים. כעת דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות. דגירה באינקובטור לח היא מתאימה.במהלך תקופת הדגירה של 60 דקות, יתרחשו אינטראקציות בין אנטיגן לנוגדן והתאים יתחילו לשקוע. סרטון הווידאו שאתם צופים בו הוא צילום השהיה (time lapse) של כל תקופת ה-60 דקות. זוהי תצוגה מקربة של בארות 5 עד 10.כבר בחנו את באר 12, שהייתה בקרת ה-VBS שלכם בניסוי זה. ניתן לראות כי התאים יצרו משקע הדוק, מה שמעיד על כך שהבדיקה תפקדה כראוי. בארות חמש ושש הן דוגמאות להמגלוטינציה חיובית.ובכן, באר שבעה היא דוגמה לתוצאה ביניים של אגלוטינציה, בעוד שבארה שמונה, תשע ועשרה התוצאה להמגלוטינציה היא שלילית. על סמך תוצאה זו, התר יקבע לפי הדילול עבור באר שבעה, שכן זו הייתה הבאר האחרונה שבה נצפתה תגובה חיובית.

determining-reactivity-titre-serum-using-haemagglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

הסרטון מדגים בדיקת עיכוב hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגנים ספציפיים. אישור של עיכוב המגלוטיציה בבאר הבדיקה והמגלוטינציה בבאר הבקרה מושג באמצעות דפוסים חזותיים ברורים. בדיקה זו ממלאת תפקיד מכריע בהערכת התגובה החיסונית, יעילות החיסון וחקר זיהומים נגיפיים בווירולוגיה ובאימונולוגיה.

בדיקת עיכוב Hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגן מטרה

סרטון זה מדגים בדיקות מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים באמצעות תאי כליות כלבים Madin-Darby המבטאים יתר על המידה חומצה סיאלית מקושרת α2,6 בסרה. בדיקה זו משמשת לעתים קרובות עבור סרולוגיה אנושית...

בדיקת מיקרו-נטרול למדידת נוגדנים מנטרלים בסרום אנושי

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת שפעת נוירמינידז (NA) המעכבת טיטרים נוגדנים בדגימת סרום. דגימת סרום המכילה נוגדנים נגד NA מתווספת לצלחת מיקרווול מצופה פטואין. עם הוספת הנגיף, הנוגדנים מונעים מ-NA נגיפי לנתק את הפטואין ולחשוף את הגלקטוז שלו. לאחר מכן מוסיפים לקטין מצומד פרוקסידז, שנקשר לגלקטוז החשוף. טיטר נוגדנים מעכבי NA נקבע באמצעות בדיקה קולורימטרית, שבה מצע פרוקסידאז נבקע על ידי פרוקסידאז מצומד לקטין משותק כדי לייצר צבע.

בדיקה למדידת נוגדנים מעכבי שפעת Neuraminidase Inhibition Titers

אנו מתארים את בדיקת הלקטין המקושרת לאנזים (ELLA) למדידת טיטר נוגדנים לעיכוב שפעת נויראמינידאז (NA) ב-sera. הבדיקה משתמשת באגלוטינין בוטנים כדי לכמת שאריות גלקטוז שהופכות לנגישות כאשר NA מסיר חומצה סיאלית מצלחות מצופות פטואין, 96 בארות.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

הפרוטוקולים הציג מתארים כיצד לבצע וזמינותו עיכוב hemagglutination לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers מן הדוגמאות סרום מקבלי החיסון נגד שפעת. הבדיקה הראשונה קובע ריכוזים מיטביים אנטיגן ויראלי על-ידי hemagglutination. הבדיקה השניה מכמתת נוגדן ספציפי שפעת titers על ידי עיכוב hemagglutination.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

מאמר זה מציג שיטה פשוטה להכנת אנטיגן של 4 יחידות המגלוטינציה לבדיקה סרולוגית של נגיף מחלת ניוקאסל. על ידי קביעה מדויקת של טיטר ההמגלוטינציה של האנטיגן, בשילוב עם שיטת טיטרציה לאחור קפדנית יותר, ותהליך התאמה מוגדר היטב, הוא משפר את יעילות הבדיקה, מפחית תוצאות חיוביות כוזבות ומשפר את מעקב המחלות בעופות.

אופטימיזציה של הכנת אנטיגן לבדיקת עיכוב המגלוטינציה של סרולוגיה של נגיף מחלת ניוקאסל

מסלול קלאסי מופעל על ידי נוגדן ו לשיאו תמוגה תא היעד.

מדידת משלים Haemolytic 50% (CH 50) פעילות של סרום

למדו לבצע מבחן הצמדת תאי דם אדומים לזיהוי וכימות נוגדנים בסרום. השיטה כוללת דילול טורי של דגימות סרום בתצלובת U-bottom וניקוד חזותי של תבניות ההצמדה לקביעת רמת הריאקטיביות והטיטר.

קביעת ריאקטיביות Titre של סרום באמצעות Assay Haemagglutination

גלה סרטונים נוספים