Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

סרטון זה מדגים שיטה לניתוח והנבטה של נוירונים כולוריים מהחוט השדרני העוברי. ההליך מתחיל באיסוף עוברי חולדה ביום העוברי E 13 ולאחר מכן בהוצאה של החוטים השדרניים. במהלך הניתוח, החוטים השדרניים נפתחים לאורך לוח הגג (roof plate) ומוכנים בתצורת "ספר פתוח".

רצועות רקמה גבייה מבודלות ונאספות למבחנה. הרקמה הגבייה מופרדת לתליה של תאים בודדים באמצעות טריפסין ופירוק מכני. לאחר מכן, נוירונים קומיסוריאליים (Commissural neurons) נזרעים על לבישי זכוכית או על צלחות תרבית רקמה מצופות פוליליזין.

ניתן להשתמש בהם לאחר מכן כדי לחקור את המכניזמים התאיים והמולקולריים של צמיחת אקסונים והנחייתם. שלום, אני סבסטיאן מהמעבדה לביולוגיה מולקולרית של התפתחות עצבית במכון למחקר קליני של מונטריאול. שלום, אני סטיב מואן, גם אני מהמעבדה לביולוגיה מולקולרית של התפתחות עצבית.

היום נדגים לכם הליך לביצוע דיסקציה וגידול של נוירונים קומיסורליים (commissural neurons) מחוט שדרה עוברי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים של הכוונת אקסונים. אז בואו נתחיל.

כיום, נבצע דיסקציה של חוט השדרה מעוברים של חולדה ביום ה-E 13 שנקצרו לאחרונה והונחו בצלחת עם מצע L 15 לאורך כל תהליך הדיסקציה. חשוב לשמור את העוברים והתמיסות על קרח. זכרו כי בכל שלבי הדיסקציה, קריטי להימנע ממתיחה של חוט השדרה, שכן הדבר עלול להפריע לבידוד של חוט שדרה שלם ותקין.

תחת מיקרוסקופ סטריאו, הפר את העובר מכל הרקמות חוץ-עובריות ומממברנות העובר. לאחר מכן, הנח עובר אחד בצלחת הניתוח. השתמש במספרי מיקרו כדי להסיר את הראש ואת החלקים האחוריים מהזוויות המוצגות כאן.

פעולה זו תיצור משטח שטוח שיסייע במיקום העוברי לצורך גישה קלה לעמוד השדרה. מקמו את העובר כאשר הצד הבטני פונה כלפי מטה והחלק הקדמי פונה הרחק מהסניגה. השתמשו בפינצטה כדי לקבע את העובר בחוזקה בצד אחד.

אין ללחוץ או לשחרר את הפינצטה, אחרת הרקמה תיקרע עם זוג הפינצטות השני. תפסו את העור לצד חבל השדרה. הזיזו את קצות הפינצטות התומכות.

קלפו את העור המכסה את גבו של העובר כדי לחשוף את חוט השדרה העטוף בקרומי העטיפה שלו, ונתקו באופן חלקי את הרקמה מימין לחוט השדרה. השתמשו בפינצטה סגורה כדי לדחוף את הרקמה, החל מהגובה שבו נמצאת פינצטת האחיזה. התקרבו ככל האפשר לחוט השדרה מבלי לגעת בו.

חזור על הפעולה מספר פעמים לאורך חוט השדרה. פעולה זו תצמידה חלק מגנגליון השורש הדורסאלי ותשבש איברים ונטראליים. השאר מעט רקמה מחוברת בקצוות הקדמי והאחורי, החל מהקצה הקדמי.

השתמשו במחט טונגסטן בצורת וו כדי לחתוך את קרומי המוח ולפתוח את חוט השדרה לאורך ה-roof plate. סובבו את העובר ב-180 מעלות והסִירו את הרקמה מהצד הנותר, תוך שימוש באותה שיטה.

לאחר מכן, נתקו לחלוטין את הרקמה בצד שמאל של חוט השדרה, הצד שהיה פגוע קודם לכן (שבמקור היה הצד הימני). הניחו את חוט השדרה על צדו והשתמשו בפינצטה כדי להסיר את רוב רקמת המזנכימה שנותרה ואת גנגליוני השורש האחוריים. השתמשו בפינצטה כדי לקלף פתח קטן של הקרומיות. בשלב זה, הקרומיות וחוט השדרה מהווים שתי שכבות של רקמה דמוית סנדוויץ'.

השתמשו בפינצטה כדי לקבע את החלק הגדול יותר של חוט השדרה בקצה הקדמי. אחזו את שני הסגמנטים המופרדים בפינצטה וקלפו את הקרומים (meninges). בצעו זאת בתנועה חלקה וקבועה; קילוף לא אחיד עלול לגרום לקרע בשכבת הקרומים או בחוט השדרה.

אם שכבת הקרומים נקרעת במהלך המשיכה, חלקו של חוט השדרה שנותר מחובר לקרומים בדרך כלל אינו ניתן להשגה. אם כי לעיתים הדבר אפשרי. השתמשו בפ pipette מפלסטיק כדי להעביר בעדינות את חוט השדרה המבודד לצלוחית עם מצע L 15 עם 10% סרום סוסים שעבר אינאקטיבציה בחום, על קרח, לפני עיבודו של מספר עוברים נוסף.

זכרו להחליף את המצע בכלי הניתוח ב-L 15 מקורר כדי לשמור על העובר קריר ולסייע בשימור שלמות הרקמה. אספו את השריכים השדרתיים מכל העוברים לפני המעבר לניתוחים של השריד השדרתי הגבי (dorsal spinal cord). כדי להתחיל בניתוח השריד הגבי, הניחו שריד שדרתי אחד שבודד acabado בצלחת פטרי המכילה L 15 עם 10% סרום סוס מחומם ומופעל.

חתכו והסירו את החלק הקדמי הרחב יותר, הכולל חלק מהמוח האחורי. לאחר מכן, השכיבו את חוט השדרה בצורה שטוחה ופרסו אותו כמו ספר פתוח. הרקמה הגבית ממוקמת בחלקים הלטרליים ביותר של חוט השדרה הפתוח; בעודכם מקבעים את החוט בעזרת מחט טונגסטן ישרה, השתמשו במחט טונגסטן בצורת L כדי לחתוך רצועה ברוחב של כחומש מרוחבו של חצי מחוט השדרה. חיתוך של רצועות רחבות יותר יעלה את התבגית, אך יפחית את טוהר התרבית.

העבירו מספר רצועות גב (dorsal strips) לפרועת קונית בנפח 15 milliliter המכילה מצע L 15 עם 10% horse serum והניחו את הפרועת על קרח. המשך הפרוצדורה יתבצע בסמיכות למכסה של מre-מabilis למטפחת רקמות או בתוכה. עבור תרבויות אלו, חשוב להכין את התמיסות והציוד מראש, בדרך כלל לפני הניתוח.

שלב ה-tation משתמש בצינורות פסטה שעברו ליטוש באש בשני גדלים, אחד שקוטרו הוא מחצית מהגודל המקורי והשני קטן ממנו מעט. לפני התחלת הפעולה, יש לצפות את שני הצינורות שעברו ליטוש באש במצע המכיל סרום, על ידי שאיבת מצע לתוך הצינורות והשארתו למשך 30 שניות. פעולה זו תפחית את מספר התאים שנדבקים לזכוכית במהלך ה-ation.

התחילו באימות שהפסים הגביים שקעו לתחתית המבחנה. תחת מכסה זרימה למינרית, הסירו את רוב הנוזל העליון (SUP natant) בעזרת פסטורת פשוטה לכל דגימה. שטפו במהירות עם 3 mL של HBSS קר, ללא מגנזיום וסידן.

המתינו שתי דקות להסתדרות של רצועת הצינור העצבי הגבי (dorsal neural tube strip). לאחר מכן, הסירו את ה-HBSS באמצעות הפסטה. הגביהו את הנפח ל-4.7 milliliters.

בעזרת HBSS חמים, הוסיפו 0.3 milliliters של 2.5% trypsin כדי להגיע לריכוז סופי של 0.15% trypsin וערבבו בעדינות; הדגירו במקלח מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שבע דקות, תוך ערבוב עדין פעם אחת במחצית זמן ההדגרה. עם סיום ההדגרה, הוסיפו DNase לריכוז סופי של 150 units per milliliter ומגנזיום סולפט לריכוז סופי של 0.15%, וערבבו קצרה.

נתחי צינור העצבים הגבי (dorsal neural tube) צריכים להיות כעת מרוסקים. סובב במרכז centrifuge את שברי הרקמה ב-200 G למשך ארבע דקות. הסר את העל-נוזל (supernatant) באמצעות פסטת פראפה (pasta perpe), כך שיישארו כ-50 עד 100 microliters של נוזל בתחתית המבחנה.

שקשקו את המבחנה בעדינות כדי לשחרר את המשקע. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של HBSS חם. הניחו לתאים לשקוע בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.

סובב במערך צנטריפוגה ושטוף את התאים שנית. הפעם, השהה אותם מחדש ב-2 milliliters של HBSS חם. השתמש בפיפט עם קצה מלוט בחום (fire polish) בעל קוטר חצוי כדי להומוגניзировать את התאים על ידי שאיבה ושחרור איטית של הנוזל למעלה ולמטה ארבע עד שש פעמים; השחרר את הנוזל כנגד דופן המבחנה כדי לפרק גושים גדולים ולהפחית את מוות התאים.

הימנעו מיצירת בועות ואל תערבבו יתר על המידה. השתמשו בפיפט זכוכית מלוט בעל הקוטר הקטן ביותר כדי להמשיך בפירוק התאים על ידי שאיבה ופליטה איטית של הנוזל שלוש עד ארבע פעמים באותו אופן. אין צורך לפרק את כל גושי התאים, שכן נטייה להיווצרות אגרגטים של תאים מתים ופסוליות היא שכיחה.

המתינו דקה עד שהשקיעים של רשמי הרקמה ישקעו. לאחר מכן, הוציאו 20 µL מהנוזל העליון (SUP natant), אשר אמור להכיל תאים תלוים לספירה ב-hemo soter; על הנוירונים להיות עם חיוניות של לפחות 95% לפי צביעת trypan blue. העבירו את הנוירונים למצע גידול neurobasal בריכוז המתאים ליישום שלכם.

לאחר 16 עד 18 שעות, החליפו את המצע למצע גידול עצבי בסיסי (neural basal growth media) כדי למנוע התנתקות. הסירו בעדינות את המצע מהנוירונים באמצעות פיפט במקום שאיבה עם משאבת ואקום. להלן מספר תוצאות מייצגות של נוירונים קומיסוראליים (commissural neurons) מבודדים שהושתלו על כיסויי זכוכית מצופים ב-PLL; ארבע שעות לאחר ההשתלה, הנוירונים נצמדו לפני השטח, 30 שעות לאחר ההשתלה.

למרבית הנוירונים יש אקסונים מוארכים עם תרון גדילה גלוי. ניתן להשתמש בנוירונים אלו בקלות בניסויי אימונופלואורסצנציה. בדוגמה זו, מיקרוטובולים מסומנים בירוק, actin באדום ו-NA בכחול.

הראינו לכם כיצד לבצע דיסקציה וטיפוח של נוירונים קומיסורליים (commissural neurons) מחוטי שדרה עובריים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי רמת הניקיון של הנוירונים הקומיסורליים תלויה בעובי הפס הדורסלי שמוצא בדיסקציה. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.