מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה
19 באפריל 2010
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.
E Coli RP 4 37 מוכנסים למכשיר כימוטקסיס שם הם נחשפים לריכוז מרחבי מוגדר. שיפועים תאים הנכנסים לתא נתקלים בנקודת האמצע של שיפוע הריכוז. תלוי אם האות נתפס כחומר מושך או דוחה, חיידקים נעים במהירות למעלה או למטה בשיפוע הריכוז.
היי, אני דרק אנגלר מהמעבדה לביוטכנולוגיה של מערכות מולקולריות והמחלקה להנדסה כימית באוניברסיטת טקסס. היום נראה לכם הליך החוקר מיסים כימותרפיים של חיידקים במכשיר מיקרופלואידי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדות שלנו כדי לחקור כיצד אי קולי RP 4 37 נודד בשיפוע ריכוז של ניקל גופרתי.
אז בואו נתחיל. השכבה הנוזלית ושכבת הבקרה מיוצרות על ידי יציקת העתק של פולימתיל SUBOXANE או PDMS מהמאסטר SU 8. כדי להתחיל בהליך זה, ערבב את הפולימר הקדם-PDMS ואת הקישור המוצלב ביחס משקל של 10 לאחד.
מסירים את התערובת בחומר ייבוש למשך שעה עד להסרת בועות אוויר. כאשר תערובת ה-PDMS מוכנה, מניחים את ה-SU שמונה מאסטר בצלחת פטרי ויוצקים בזהירות את התערובת על גבי ה-SU שמונה מאסטר לעובי הרצוי חום. צלחת הפטרי המכילה את ה-PDMS ואת תבנית המאסטר SU 8 ב-80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לרפא את ה-PDMS.
לאחר שעתיים, הסר את מאסטר ה-SSU שמונה המכוסה ב-PDMS מהפלטה החמה וקילף את תבנית ה-PDMS מהמאסטר SU 8. המבנה הרצוי יוטמע בתבנית ה-PDMS באמצעות ניקוב מחט קצה קהה בגודל 20 ארבעה חורים בתבנית ה-PDMS לצינורות למחולל השיפוע, כניסת התא ויציאת התא. כעת אנו מוכנים להרכיב את מכשיר ה-PDMS כדי לחבר את מכשיר ה-PDMS.
ראשית, נקו שקופית מיקרוסקופ זכוכית עם איזופרופנול ונסו אותה עם זרם אוויר. לאחר מכן, חשוף את תבנית ה-PDMS ואת מגלשת הזכוכית לפלזמת חמצן בתחריט פלזמה למשך כ-30 שניות. הבא את תבנית ה-PDMS למגע עם מגלשת הזכוכית מחממים את השקופית המגיעה ואת תבנית ה-PDMS ל-65 מעלות צלזיוס על פלטה חמה למשך 15 דקות.
כדי להרכיב את מכשיר ה-PDMS, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך צינורות בזווית של 45 מעלות לאורך הנכון הנדרש בהתאם להגדרת המיקרוסקופ. ואז באמצעות מלקחיים. הכנס קצה אחד של הצינור לאחד מארבעת החורים המנוקבים במכשיר.
הכנס רכזת מחט קהה בגודל 30 לקצה השני של הצינור. חזור על הכנסת הצינורות ורכזת המחט עבור כל החורים הנותרים. טען מיליליטר אחד של מסי כימותרפיה, חיץ או CB במזרק של שלושה מיליליטר.
הקפדה על הוצאת אוויר מהמזרק. הוסף CB לרכזת מחט היציאה באמצעות פיפטה והקש על רכזת המחט כדי להסיר בועות אוויר. דחוף מעט CB מקצה המזרק של שלושה מיליליטר וחבר את המזרק לרכזת המחט מבלי ללכוד אוויר.
דחוף את CB דרך המכשיר עד שכל רכזות המחט הנותרות יתמלאו ב-cb. זה אמור להסיר את רוב בועות האוויר. לאחר מכן, מלאו שני מזרקים של 500 מיקרוליטר ב-CB המכילים את הריכוזים המתאימים של אפקטור הכימותרפיה הנבדק.
מנע היווצרות בועות אוויר על ידי דחיפת טיפה קטנה מתכולת המזרק ונגיעה בטיפות הנוזל ברכזת המחט וחיבור המזרק להכנת חיידקים בעלי תנועה גבוהה. לניסוי הכימוטקסיס, גדלו תרבית לילה של אי קולי RP 4 37 עם ביטוי GFP, פלסמיד במרק טריפטון או שחפת ב-32 מעלות צלזיוס עם טלטול למחרת. השתמש בתרבית הלילה כדי לחסן תרבית של 20 מיליליטר של שחפת בבקבוק ארלנמאייר של 250 מיליליטר לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של כ-0.05.
גדל את התרבית ב-32 מעלות צלזיוס עם טלטול כאשר התאים נמצאים ב-OD 600 של כ-0.35 עד 0.45. קצור אותם על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה להשעות תאים ל-OD 600 של כ-0.35 ב-CB המכיל את אפקטור הכימותרפיה בריכוז הצפוי באמצע התעלה. לבסוף, הוסף תאים מתים עם תווית RFP ללא D 600 של כ-0.35 ל-GFP המבטא תאים חיים.
תאים מתים אלה יהוו בקרה פנימית כדי להבטיח שכל נדידה אינה נובעת מהשפעות זרימה. תרחיף התא מוכן כעת לטעינה במכשיר המיקרופלואידי לניסוי הכימוטקסיס. כדי להתחיל בניסוי הכימוטקסיס, הסר חלק מה-CB ממילוי רכזת המחט של כניסת התא עם תרחיף התא.
מלאו בעדינות מזרק של 50 מיקרוליטר בתאים התלויים. עשו זאת לאט מכיוון שניתן לגזור דגלים, מה שיפחית את התנועתיות. חבר את המזרק בנפח 50 מיקרוליטר לרכזת מחט הכניסה כפי שהוצג קודם לכן על ידי דחיפת טיפה קטנה מתכולת המזרק ונגיעה בטיפה לנוזל ברכזת המחט והצמדת המזרק למקם את המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה מהירה לרכישת תמונה.
הכנס את שני מזרקי הכניסה למשאבת המזרק והתחל זרימה כך שנוצר השיפוע והתאים זורמים דרך הצינור. ברגע שהתאים נכנסים לתא המסים הכימותרפיים, המתן כ-20 דקות עד שהמערכת תתייצב. לפני ההדמיה, אספו תמונות פלואורסצנטיות חיות, ירוקות ואדומות מתות במקומות שונים לאורך החדר.
בדרך כלל אנו אוספים 100 תמונות בכל מיקום במרווחים של שלוש שניות. ניתן לנתח את תמונות הקרינה שנרכשו באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרית כגון Image J או Metamorph, או באמצעות קודים פשוטים שנכתבו ב-matlab. בדוגמה זו, נשתמש בקודי MATLAB.
התחל בהסרת פיקסלי הרקע בתמונה באמצעות עוצמת פיקסלים מוגדרת זו, והסר את כל הפיקסלים בעלי עוצמה נמוכה מהסף. זה ממזער את הרעש. בניתוח, השתמש במיקום התאים המתים כדי לקבוע את מרכז התמונה.
זה מייצג את המיקום שבו תאים נכנסו לתא הכימוטקסיס והיכן הם יתגלו בהיעדר הגירה כלשהי. לאחר מכן, אתר תאים חיים בתמונה, חלק את התמונה לערוצים וקבע את מספר התאים החיים בכל ערוץ. בעבודה הקודמת שלנו, תא המסים הכימותרפיים ברוחב 10 50 מיקרומטר חולק ל-64 תעלות שכל אחת מהן הייתה ברוחב של כ-16 מיקרומטר.
לאחר חזרה על שלבים אלה עבור כל התמונות, חלק מסך התאים נספר עבור כל ערוץ בכל התמונות. זה נותן את ספירת התאים הכוללת שזוהתה בכל ערוץ לאורך הניסוי. חשב את מיסי הכימותרפיה, מקדם החלוקה או CPC, המייצג את כיוון ההגירה.
על ידי ביצוע השלבים הבאים, הקצה מכפיל של פלוס אחד ומינוס אחד לכל תא הממוקם בריכוז הגבוה או בריכוז הימני והנמוך או בצד השמאלי של התאים המתים בהתאמה. חבר את כל הערכים המוכפלים ונרמל למספר הכולל של תאים שזוהו. חשב את מיסי הכימותרפיה, מקדם הנדידה או CMC, המשקלל את נדידת התאים לפי מרחק הנסיעה.
תא שנע למיקום הריכוז הגבוה ביותר ערוץ 64 מקבל מקדם שקלול של פלוס אחד, בעוד שתא שנע באמצע הדרך לצד הריכוז הגבוה יותר מקבל מקדם משקל של פלוס 0.5 ותא. המעבר למצב הריכוז הנמוך הרחוק ביותר משוקלל במינוס אחד. חלק מכל ספירת התאים המשוקללת ומנורמלת למספר התאים ליצירת ה-CMC.
גרף זה מציג שיפוע ריכוז ליניארי או פרופיל שנוצר במכשיר המיקרופלואידי באמצעות פלואורסצאין איזותיוציאנט. היווצרות שיפוע ריכוז מודגמת באיור זה באמצעות צבעי צבע כחול וצהוב. כניסת התא הייתה CA כך שלא הייתה זרימה דרכה, וניתן לראות שנוצר טווח צבעים בין כחול לצהוב.
להלן תמונות פסאודו-צבע מניסוי כימוטקסיס מייצג שבו אי קולי RP 4 37 נחשף לשיפוע של אפס עד 100 מיקרו-מולרי L אספרטט או אפס עד 225 מיקרו-מולרי ניקל סולפט במכשיר. הנדידה של חיידקים ירוקים חיים לעבר אל אספרטט או הרחק מניקל צולמה כל 2.5 שניות למשך 30 דקות. חיידקים מתים המוצגים באדום שימשו כבקרה על השפעות הזרימה במכשיר.
ההתפלגות המרחבית של RP 4 37 במכשיר המיקרופלואידי, בהיעדר שיפוע, מוצגת בגרף זה בהשוואה לתגובתו לשיפוע אספרטט ולשיפוע ניקל גופרתי. זה עתה הראינו לך כיצד לנטר את מיסי הכימותרפיה של אי קולי RP 4 37 בשיפוע של ניקל גופרתי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למזער את מערבולת התאים כך שניתן יהיה להשתמש בתת-אוכלוסייה בעלת תנועתיות גבוהה.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של התקן מיקרופלואידי לחקירת כימוטקסיס חיידקי במדרגי ריכוז יציבים של כימו-אפקטורים. חיידקי E. coli RP 4 37 מוחדרים להתקן כדי ללמוד את תנועתם בתגובה למדרגי ריכוז מרחביים מוגדרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- כיmotaksיה חיידקית
- ביוטכנולוגיה
רקע
- כימוטקסיס חיידקי הוא תנועה של חיידקים לעבר גירויים כימיים או הרחק מהם.
- מכשירים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת של מדרגי ריכוז כימיים.
- הבנת כימוטקסיס ( chemotaxis) יכולה לספק תובנות לגבי התנהגות חיידקים ויישומים בביוטכנולוגיה.
- מחקר זה מתמקד ב-E. coli RP 4 37 ובתגובתו לניקל סולפט.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרופלואידי לחקר תנועת חיידקים.
- בדיקת התגובה של E. coli למדרגי ריכוזים שונים.
- העמקת ההבנה של מנגנוני כימוטקסיס בחיידקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של התקן מיקרופלואידי.
- החדרת E. coli אל תוך ההתקן.
- תצפית על תנועת חיידקים בתגובה למשפיעי כימיה (chemoeffectors).
- ניתוח דפוסי נדידה במעמקי מפל ריכוזים.
תוצאות עיקריות
- חיידקים מפגינים תנועה מכוונת לעבר חומרים מושכים ומרחיקים מחומרים דוחים.
- מסיפי ריכוז מוגדרים משפיעים באופן משמעותי על התנהגות חיידקים.
- ההתקן המיקרופלואידי מספק סביבה מבוקרת לחקר כימותקסיס.
- התוצאות תורמות להבנת המנגנונים של ניווט חיידקי.
מסקנות
- ההתקן המיקרופלואידי שפותח יעיל לחקר כימותקסיס של חיידקים.
- הממצאים מעמיקים את הידע על התנהגות E. coli בתגובה לאותים כימיים.
- למחקר זה יש השלכות על יישומים בביוטכנולוגיה המערבים חיידקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות של כימוטקסיס חיידקי במדרגי ריכוז יציבים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות אנטימיקרוביאליות, על ידי קישור בין חישוף למולקולות כימו-אפקטוריות לבין התנהגות פנוטיפית. גישה מיקרופלואידית זו תומכת בביטחון חזוי בזיהוי מובילים (lead identification) באמצעות אספקת נתוני נדידה כמותיים וניתנים לשחזור תחת תנאים כימיים מבוקרים. הפלטפורמה מגבירה את הרצף התרגומי מסריקת מטרות להערכה פרה-קלינית, על ידי סטנדרטיזציה של מדדי כימוטקסיס עבור צוותים רב-תחומיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת נדידה חיידקית לעבר או הרחק מכימואפקטורים ספציפיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות הערכה כמותית של תגובות למשיכים ודוחים.
- ערך מדעי: תומך ברמת הביטחון בניבוי על ידי יצירת מתאם בין התנהגות כיmotקטית לבין ביטוי גנים או פעילות של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות חיידקיים מתוקפות לסריקה המשכית על ידי קביעת תגובתיות כימוטקטית בסיסית.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות של הבדיקה באמצעות יצירת מדרג דיפוזיבי יציב.
- ערך מדעי: מספק תוצאות כמותיות, כגון מקדמי חלוקה ונדידה כימוטקטית, לצורך הערכת תרכובות.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- ערך מדעי: תואם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מידול של ניווט חיידקים בסביבות כימיות דמויות מאחסן.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני באמצעות פורמט מיקרופלואידי עקבי.
- ערך מדעי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות הפחתת סיכונים כימוטקטית של מטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
המכשיר משתלב בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות לגבי אינטראקציות בין כימואפקטורים לרצפטורים לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי קישור דפוסי נדידה למנגנוני זיהוי ספציפיים של כימואפקטורים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות יצירת מדרג ריכוזים יציב ותאימות לדימיון במהירות גבוהה.
- אנליטיקה: מייצרת מקדמים כימותקטיים מנורמלים המאפשרים השוואה של תגובות חיידקיות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות סטנדרטיזציה של מדדי התנהגות חיידקית במערכות מודל שונות.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת כימואפקטורים וזני חיידקים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בתגובות התנהגותיות של חיידקים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות ייצור מיקרופלואידי סטנדרטי ובקרת מדרג (gradient control).
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים של כימותקסיס לצורך תיעדוף מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי מטרות בעלות מנגנוני בריחה כימותקטיים מינימליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבת התקני מיקרופלואידיקה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות.
- תלוי ביציקת PDMS, קישור בפלסמה ותשתיות משאבות מזריקים ליצירת גרדיאנט.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ריכוזי chemoeffectors ופרוטוקולים של סגמנטציית תעלים.
- כולל שיקולי התאמה עבור זנים חיידקיים שונים, סמנים פלואורסצנטיים ומסיסויות של chemoeffectors.
- מוגבל על ידי הצורך לצמצם את מאמץ הגזירה במהלך טעינת התאים כדי לשמר את שלמות השוטונים ואת התנועתיות.
