Name: מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: למד לחקור כימוטקסיס חיידקי באמצעות מכשיר מיקרו-זורמי. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחרי תנועת E. coli RP 4 37 בתגובה למשתני כימיים במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן הלאומית למדע (CBET 0,846,453).

1. המצאה של אדונים סיליקון באמצעות photolithography סטנדרטי SU-8 1 (לא רואים בסרט הזה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תקן SU-8 שיטות photolithography ליצור SU-8 "אמן" (SU-8 2025, MicroChem, ניוטון, MA) בודה את התבנית PDMS המכיל את רשת microfluidic קאמרית chemotaxis. תבניות הורים כאלה יכולים להיות מפוברק בכל מתקן microfabrication (למשל, סטנפורד מיקרופלואידיקה יציקה; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שכפול PDMS, לחשוף את SU-8 המאסטר אדי fluorosilane בתוך תא ייבוש המחובר למקור ואקום כדי להקל על שחרור קל של PDMS מן האדון. הוסף ירידה של fluorosilane על מגבת נייר וליישם ואקום דקות אחד. הסר את האבק ולאפשר 30 דקות עבור בתצהיר של fluorosilane. שמור את המאסטר SU-8 בכלי סגור לשימוש עתידי. </li></ol> 2. דפוס Replica של PDMS ממורה SU-8: שכבת fluidic ואת השכבה מלאה מיוצרים על ידי דפוס העתק של PDMS ממורה SU-8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את PDMS מראש פולימר צולבות מקשר ב wt 10:01. יחס דגה ב dessicator במשך שעה 1 (או עד בועות אוויר יוסרו מן התערובת PDMS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המאסטר SU-8 בצלחת פטרי ובזהירות לשפוך את התערובת PDMS על גבי יחידת SU-8 בעובי הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את צלחת פטרי שמכילה את PDMS ואת SU-8 עובש אמן 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לרפא את PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את נרפא PDMS מכוסה SU-8 הורים מתוך פלטה חשמלית לבין קליפת עובש PDMS מן האב SU-8. המבנה הרצוי יהיה מוטבע עובש PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודח חורים עובש PDMS עבור צינורות אל הגנרטור שיפוע כניסת התא באמצעות 20 מד בוטה לקצה המחט. </li></ol> 3. Bonding PDMS של מכשירים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה מיקרוסקופ זכוכית שקופית עם isopropanol ויבש עם חנקן או זרם אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את PDMS והחלק הזכוכית פלזמה חמצן אשר פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מביאים את התבנית PDMS במגע עם שקופיות הזכוכית. מחממים את השקופית קשר עם עובש PDMS עד 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li></ol> 4. הרכבת המכשיר PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, לחתוך צינורות ב 45 ° זווית באורך הנכון הנדרש עבור המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה אחד של הצינור לתוך החורים אגרוף המכשיר (למשל, שקע) באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להכניס מחט קהה 30-מד אל הקצה השני של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.2 עבור כל החורים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 1mL של chemotaxis חיץ (CB) בתוך מזרק 3mL, מקפיד להסיר בועות אוויר מן המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רכזת המחט בקצה אחד של הצינור לשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף CB לרכזת את המחט, והקש הרכזת מחט כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלחצי קצת לא CB של קצה המזרק וחבר את המזרק 3mL לרכזת את המחט ללא השמנה האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push CB דרך המכשיר עד שכל רכזות מחט הנותרים מלאים עם CB. זה אמור להסיר את רוב בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי שני מזרקים 500μL עם CB המכיל ריכוזי המתאימה של chemoeffector נבדק. מנע היווצרות בועת אוויר על ידי לחיצה על ירידה קטנה של תכולת המזרק נוגע טיפה לנוזל ב לרכזת את המחט מצרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, לחבר מזרק המכיל CB אל כניסת חיידקים. זו תוסר כאשר החיידקים מוחדרים לתוך המכשיר. </li></ol> 5. צמיחה של E. ניעתי מאוד coli <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות לילה של E. coli RP437 עם הבעה GFP פלסמיד ב 20 מ"ל של tryptone מרק (TB) בשעה 32 ° C עם רעד. הוסף בריכוז המתאים של אנטיביוטיקה כדי לשמור על פלסמיד. בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים נמוכה להעתיק pCM182 פלסמיד לאיתור חיידקים מבוסס על הקרינה במכשיר. עבור א coli, תרבויות גדל ב 32 ° C מומלצת תנועתיות גבוהה, כמו תנועתיות נמוכה בטמפרטורות גבוהות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תרבות לילה לחסן תרבות 20 מ"ל של שחפת בקבוק 250 מ"ל Erlenmeyer צפיפות אופטית ב 600nm של ~ 0.05. לגדול עם התרבות רועד ב 32 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים ב OD של 600 ~ 0.35 0.45 על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ב XG 400 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים OD של 600 ~ 0.35 ב CB המכיל את chemoeffector בריכוז הצפוי באמצע הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף RFP שכותרתו תאים מתים על OD של 600 ~ 0.35 ל-GFP להביע תאים חיים. המתים (אדום) התאים משמשים בקרה פנימית על מנת להבטיח כי כל הגירה היא לא בשל תופעות זרימה. </li></ol> 6. ניטור chemotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כמה מן CB המחט כניסת תאהרכזת. מילוי עם ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא בעדינות את המזרק 50μL עם התאים resuspended. צעד זה צריך להיעשות לאט כמו שוטונים יכול להיות טעון ו תפחית תנועתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המזרק 50μL לרכזת כניסת המחט, כפי שמתואר בשלב צעדים 4.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המכשיר על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה במהירות גבוהה לרכישת התמונה. מניחים את כניסת מזרקים (גם 500 מזרקים שיפוע μL ואת מזרק 50 תא μL) לתוך המשאבה מזרק וליזום תזרים כזה שיפוע נוצר ותאי זורמים דרך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים להיכנס לחדר chemotaxis, לחכות ~ 20 דקות עבור מערכת לייצוב לפני הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ירוק (חי) ואדום (מת) תמונות הקרינה במקומות שונים לאורך החדר (המקביל ל בזמנים חשיפה שונה). בדרך כלל, אנו אוספים 100 תמונות במיקום אחד ב 3 שניות במרווחים. </li></ol> 7. ניתוח נתונים: השלבים הבאים ניתן לבצע באמצעות ניתוח כלשהו זמין מסחרית תמונה התוכנית (למשל, ImageJ, Metamorph) או באמצעות קודי פשוט כתוב ב-Matlab. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקע פיקסלים בתמונה (כלומר, סף לקבוע עוצמת פיקסל ולהסיר את כל פיקסלים כי יש אינטנסיביות פחות מ סף). זה רעש ממזער בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש את המיקום של התאים המתים (אדום פלואורסצנטי) כדי לקבוע את מרכז התמונה. מאז תאים מתים להראות שום chemotaxis, זה מייצג את העמדה שבה תאים נכנסו לחדר chemotaxis ויהיה מזוהה בהעדר כל הגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור תאים חיים (פלואורסצנטי ירוק) בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את התמונה לתוך ערוצים לקבוע את מספר תאים חיים בכל ערוץ. בשנת העבודה הקודמת שלנו 3, 1050 הרחב מיקרומטר chemotaxis קאמרית חולקה 64 ערוצים, כי הם כל ~ 16 מיקרומטר רחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 7.1 7.3 לתמונות כל סכום ספירת תאים הכולל לכל ערוץ לאורך כל התמונות. זה נותן את מספר התא הכולל זוהה על כל ערוץ במשך כל תקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את מקדם החלוקה chemotaxis (CPC), המייצגת את כיוון הנדידה, כדלקמן: כל תא הממוקם בריכוז גבוה (מימין) וריכוז נמוך (משמאל) צידי תאים מתים מוקצה מכפיל של 1 ו -1 , בהתאמה. כלומר, תא נודד במעלה שיפוע מוכפל 1 בעוד התאים נע לאורך שיפוע מוכפלים ב -1. כל הערכים כפול מתווספים מעלה מנורמל למספר הכולל של תאים זוהה. לדוגמה, ערך עלות לקליק של 0.40 עולה כי 40% יותר חיידקים סך עבר לצד ריכוז גבוה מאשר בצד ריכוז נמוך (כלומר, chemoeffector מהווה attractant כמו חיידקים יותר התגלו נעה במעלה מדרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מקדם ההגירה chemotaxis (CMC), אשר שוקל את ההגירה של תאים על ידי המרחק נסע, כדלקמן: תא משקל לספור בכל ערוץ בפקטור כי הוא יחסי למרחק כי תאים נודדים. תא שזז לתפקיד ריכוז גבוה הרחוק (ערוץ 64) ניתנת גורם הניפוח של 1, ואילו אחד שזז לאמצע לצד ריכוז גבוה ניתנת גורם הניפוח של 0.5, ו - תא שעבר הרחוקה ביותר ריכוז נמוך המיקום משוקלל -1. לסכם את כל ספירת תא משוקלל לנרמל למספר תאים כדי להפיק את CMC. </li></ol> נציג תוצאות 3,4: השתמשנו במכשיר microfluidic (איור 1A) המתואר כאן לחקור chemotaxis של E. coli ב הדרגתיים של משיכה (חומצה אספרטית, autoinducer-2) ו דוחי (NiSO 4, אינדול) 3,4. אבטיפוס chemotaxis 5 זן E. coli RP437-GFP להביע שימש, יחד עם kanamycin-נהרגה E. coli TG1 תאים לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום כדי לפקח על תופעות זרימה. שיפוע הריכוז נוצרו המכשיר μFlow מוצג בתרשים 1B. כניסת התא היה כתרים כך שאין לזרום דרך אותו שיפוע יציב של 0 100 ng / mL של fluoresscein הוקמה בשנת המכשיר. עוצמת פיקסלים לרוחב המכשיר היה בשימוש כדי לקבוע את פרופיל ריכוז והעמסת. הנתונים מראים כי חיידקים המפגש שיפוע ליניארית כשהם נכנסים לחדר chemotaxis. 2A ו-B באיור מראה תמונות הקרינה של ה RP437 coli נודדות בתגובה הדרגתיים של חומצה אספרטית (0 100 מיקרומטר) ו NiSO 4 (0 225 מיקרומטר). התגובות שנצפו attractant אלה הקנונית ודוחה הם כצפוי. 3A איור מציג את התפלגות לכמת של E. coli RP437 בהעדר מפל ריכוזים (כלומר, שיפוע null של חומצה אספרטית), בעודאיורים 3 ב ו - ג המופע הפצה הדרגתיים של חומצה אספרטית ו NiSO 4. הספציפיות של התגובות הללו (כלומר, הטיה הגירה) בולטת כמו E. coli RP437 Δ זפת זן (כלומר, מאמץ חסר chemoreceptor טאר המשמש החיידק לחוש חומצה אספרטית ניקל ו) אין להדגים את הטיה הגירה בנוכחות מפל ריכוזים של חומצה אספרטית או NiSO 4. המגמות ניכרת את הפרופילים הפריסה המרחבית גם בקנה אחד עם ערכי על"ל מחושב CMC. לקליק ערכי הגירה של E. coli RP437 ב הדרגתיים של חומצה אספרטית או NiSO 4 הן 0.33 ו -0.33, בהתאמה. הערכים המתאימים CMC הן 0.13 ו -0.14, בהתאמה. לעומת זאת, עלות לקליק CMC ערכים עם E. RP437 coli Δ זן הזפת הדרגתיים של חומצה אספרטית או NiSO 4 זניחים. בנוסף, עלות לקליק CMC ב שיפוע ריק של חומצה אספרטית הן 0.03 ו - 0.02, בהתאמה, מעידים על חוסר הטיה הגירה בהעדר צבע. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="איור 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="איור 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1b"> באיור 1. התקן סכמטית ואת שיפוע הריכוז. (א) ייצוג סכמטי של המכשיר chemotaxis microfluidic. המכשיר מורכב מודול שיפוע, ערבוב (20 x 100 x 18,750 מיקרומטר) ואת מודול תצפית chemotaxis (20 x 1,050 x 11,500 מיקרומטר). רוחב של שני ערוצי צבע הזנת המכשיר הן 500 מיקרומטר ו רוחב של כניסת חיידקים הוא 50 מיקרומטר. הבלעה מתארת ​​שיפוע של מולקולת האיתות (אפור) חיידקים נודדים בעקבות זאת. חיידקים חיים מתוארים אליפסות מוצק, ואילו החיידקים מתים מוצגים אליפסות פתוח. (ב) מפל ריכוזים בין 0 ל 100 ng / mL והעמסת נוצר המכשיר צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות Fluorescence נרכשו לאחר 30 דקות ו לכמת ידי ניתוח התמונה. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Chemotaxis של E. coli RP437 במכשיר microfluidic. E. coli RP437 נחשף שיפוע של (A) L-000-100 מיקרומטר aspartate או (ב) 0-225 מיקרומטר NiSO 4 במכשיר ואת נדידת חיידקים חיים (ירוק) כלפי aspartate-L או הרחק ניקל צילמו כל 2.5 שניות למשך 30 דקות. חיידקים המלח (אדום) שימש לשלוט על ההשפעות תזרים במכשיר. תמונות היו לכמת באמצעות in-house פיתחה ניתוח program3. הנתונים המוצגים הם נציג פסאודו בצבע תמונות מתוך שלושה ניסויים עצמאיים. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="איור 3א" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="איור 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="איור 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3c"> איור 3: כימות פרופילים ההגירה attractant קנוני ודוחה. הפריסה המרחבית של RP437 במכשיר microfluidic בתגובה (א) אחיד 100 מיקרומטר L-aspartate (כלומר, ללא שיפוע), (B) 0 100 מיקרומטר שיפוע של aspartate, ו - (ג) 0 225 מיקרומטר שיפוע של NiSO 4 . חלוקת תאים מתים מוצג כקו יציב, חלוקת תאים RP437 מוצג כקו מקווקו, ועל חלוקת תאים RP437 EDA + Δ זפת מוצג כקו מקווקו. הנתונים המוצגים הם ממוצעים של שלושה ניסויים עצמאיים.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

מקדם החלוקה chemotaxis (CPC) ואת מקדם ההגירה chemotaxis (CMC) יכול להיות מחושב כפי שמתואר מאו ואח&#39; 5. אם תא מזוהה בצד ריכוז גבוה, הוא מקבל ערך של 1, ואילו תא זוהה בצד ריכוז נמוך ניתנת ערך של -1. הערכים סיכם ואמר מחולק במספר הכולל של תאים כדי להפיק את העלות. הסימן של עלות לקליק (חיובי או שלילי) נותן את הכיוון של הגירה (לכיוון או הרחק אות). למרות העלות מציין אם התאים מגיבים כימיים כמו attractant או דוחה, זה לא לכמת את מידת chemotaxis. לשם כך, אנו לחשב את CMC...

מכשיר microfluidic לכימות chemotaxis חיידקים gradients ריכוז אורווה

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis מאפשרת לחיידקים להתקרב למקורות של כימיקלים attractant או להימנע ממקורות של כימיקלים דוחה. חיידקים מנטרים את הריכוז של chemoeffectors ספציפי על ידי השוואת הריכוז הנוכחי לריכוז זיהה כמה שניות קודם לכן. השוואה זו קובעת את כיוון נטו של התנועה. למרות מרובים, הדרגתיים מתחרים לעתים קרובות להתקיים בטבע, גישות קונבנציונליות על חקירת chemotaxis חיידקים הם לא טובים לכימות הגירה בתגובה הדרגתיים ריכוז ו דוחי משיכה. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל chemotaxis microfluidic להצגת הדרגתיים ריכוז מדויק ויציב של chemoeffectors כדי חיידקים כמותית בחקירת תגובתם הדרגתי שהוחל. המכשיר הוא צדדי כי הדרגתיים ריכוז של כל ריכוז מוחלט הרצוי כוח הדרגתי יכול להיווצר בקלות על ידי ערבוב diffusive. המכשיר הוא הוכיח באמצעות תגובת<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 הדרגתיים של חומצות אמינו ויונים ניקל.

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של המכשיר microfluidic לחקירת chemotaxis חיידקים הדרגתיים ריכוז יציב של chemoeffectors.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

כימותקסיס (Chemotaxis) מאפשר לחיידקים להתקרב למקורות של כימיקלים מושכים או להימנע ממקורות של כימיקלים דוחים. חיידקים מנטרים ללא הרף את ה...

חיידקי E Coli RP 4 37 מוכנסים למכשיר כימותקס (כימוטקסיס), שבו הם נחשפים למדרג ריכוזים מרחבי מוגדר. תאים הנכנסים לתא נתקלים בנקודת האמצע של מדרג הריכוזים. בהתאם לשאלה האם האות נתפס כמושך או כדוחה, החיידקים נעים במהירות למעלה או למטה במדרג הריכוזים.שלום, אני דרק אנגלר מהמעבדה לביוטכנולוגיה של מערכות מולקולריות וממחלקת להנדסה כימית באוניברסיטת Texas A&amp;M. היום נציג בפניכם פרוצדורה לבדיקת כימותקסיס חיידקי במכשיר מיקרופלואידי. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדותינו כדי לחקור כיצד *E. coli* RP 4 37 ננדירה במדרג ריכוזים של nickel sulfate.אם כך, נתחיל. השכבה הפלואידית ושכבת הבקרה מיוצרות על ידי יציקה משכפלת של Polymethyl SUBOXANE או PDMS מהתבנית של SU eight. כדי להתחיל בהליך זה, ערבבו את הפולימר המקשר (pre polymer) של ה-PDMS ואת חומר הקישור (crosslinker) ביחס משקלי של 10 ל-1.בצעו ניקוי בועות (Degas) לתערובת בתוך מתבן למשך שעה אחת עד להסרת בועות האוויר. כאשר תערובת ה-PDMS מוכנה, הניחו את תבנית המאסטר של ה-SU eight בתוך צלחת פטרי ושפכו בזהירות את התערובת מעל תבנית המאסטר של ה-SU eight עד לעובי הרצוי. חממו את צלחת הפטרי המכילה את ה-PDMS ואת תבנית המאסטר של ה-SU eight בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך שעתיים כדי להקשות (cure) את ה-PDMS.לאחר שעתיים, הסירו את ה-SU-8 המאסטר המכוסה ב-PDMS שעבר פילמור מהפלטה החמה וקלפו את תבנית ה-PDMS מה-SU-8 המאסטר. המבנה הרצוי יהיה מוטמע בתבנית ה-PDMS; באמצעות מחט בעלת קצה קהה במידה 20 gauge, נקבו ארבעה חורים בתבנית ה-PDMS עבור הצינוריות למחולל המדרג (gradient generator), לכניסת התאים ולשלב היציאה של התאים. כעת אנו מוכנים להרכיב את התקן ה-PDMS כדי לבצע איחוי (bonding) של התקן ה-PDMS.ראשית, נקה זכוכית של שקופית מיקרוסקופ באמצעות איזופרופנול וייבש אותה באמצעות Airstream. לאחר מכן, חשוף את תבנית ה-PDMS ואת שקופית הזכוכית לפלזמה של חמצן במכשיר plasma etcher למשך כ-30 שניות. הבא את תבנית ה-PDMS למגע עם שקופית הזכוכית. חמם את השקופית ואת תבנית ה-PDMS במגע על פלטה מחממת בטמפרטורה של 65 °C למשך 15 דקות.להרכבת התקן ה-PDMS, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך את הצינורית בזווית של 45 מעלות לאורך המתאים, בהתאם להגדרות המיקרוסקופ. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הכניסו קצה אחד של הצינורית לאחד מארבעת החורים שננקבו בהתקן.הכנס מחבר מחט קהה בכיול 30 G לקצה השני של הצינורית. חזור על הכנסת הצינורית ומחבר המחט עבור כל שאר החורים. טען 1 mL של chemo taxes, באפר או CB למזרק של 3 mL.יש להקפיד להוציא את האוויר מהמזרק. הוסף CB למחבר מחט היציאה באמצעות פיפטה והקש על מחבר המחט כדי להוציא בועות אוויר. דחוף כמות קטנה של CB מקצה המזרק בנפח של שלושה מיליליטר וחבר את המזרק למחבר המחט ללא כליאת אוויר.הדחפו את ה-CB דרך המכשיר עד שכל שאריות נקיבי המחטים יתמלאו ב-CB. פעולה זו אמורה להסיר את מרבית בועות האוויר. לאחר מכן, מלאו שתי מזרקים של 500 microliter ב-CB המכיל את הריכוזים המתאימים של ה-chemo effector הנבדק.מנעו היווצרות בועות אוויר על ידי דחיפה של טיפה קטנה מתכולת המזרק, כך שתגע בטיפות הנוזל שבבסיס המחט, ואז חברו את המזרק כדי להכין חיידקים בעלי ניידות גבוהה. עבור ניסוי הכימוטקסיס, גדלו תרבית לילה של e coli RP 4 37 עם פלסמיד לביטוי GFP במצע tripton broth או TB בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם ניעור. למחרת, השתמשו בתרבית הלילה כדי להחדיר אותה לתרבית של 20 milliliter של TB בבีกר ארלנמאייר בנפח 250 milliliter, עד לצפיפות אופטית ב-600 nanometers של כ-0.05.גדלו את התרבית בטמפרטורה של 32 degrees Celsius עם ניעור כאשר התאים נמצאים ב-OD 600 של כ-0.35 עד 0.45. קצרו אותם באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה והשעו מחדש את התאים ל-OD 600 של כ-0.35 ב-CB המכיל את האפקטור הכימי בריכוז הצפוי במרכז התעלה. לבסוף, הוסיפו תאים מתים המסומנים ב-RFP ב-OD 600 של כ-0.35 לתאים חיים המבטאים GFP.תאים מתים אלו ישמשו כביקורת פנימית כדי להבטיח שכל נדידה אינה נובעת מהשפעות זרימה. תרחיף התאים מוכן כעת להעמסה אל תוך ההתקן המיקרופלואידי עבור ניסוי הכימוטקסיס. כדי להתחיל את ניסוי הכימוטקסיס, הסר חלק מה-CB ממרכז מחט כניסת התאים ומלא אותו מחדש בתרחיף התאים.מלאו בעדינות מזרק של 50 µL בתאים שהושעו מחדש. בצעו זאת לאט, שכן שוטים עלולים להיגזז, דבר שיפחית את הניידות. חברו את המזרק של 50 µL למחבר מחט הכניסה כפי שהודגם קודם לכן, על ידי דחיפה של טיפה קטנה מתכולת המזרק, נגיעה של הטיפה בנוזל שבמחבר המחט וחיבור המזרק. מקמו את המכשיר על השולחן של מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד במצלמהומהירה לרכישת תמונות.הכנס את שתי מזרקי הכניסה למשאבת המזרקים והפעל את הזרימה כך שייווצר המדרג (gradient) ותאים יזרמו דרך הפיתוליות. לאחר שהתאים נכנסים לתא הכימוטקסיס, המתן כ-20 דקות לייצוב המערכת. לפני הצילום, אסוף תמונות פלואורסצנציה של תאים חיים (בירוק) ותאים מתים (באדום) במיקומים שונים לאורך התא.בדרך כלל אנו אוספים 100 תמונות בכל מיקום במרווחי זמן של שלוש שניות. ניתן לנתח את תמונות הפלואורסצנציה שהתקבלו באמצעות כל תוכנה לניתוח תמונות הזמינה מסחרית, כגון Image J או metamorph, או באמצעות קודים פשוטים שנכתבו ב-matlab. בדוגמה זו, נשתמש בקודים של MATLAB.התחילו בהסרת פיקסלי הרקע בתמונה באמצעות הגדרת סף עצימות הפיקסלים, והסירו את כל הפיקסלים בעלי עצימות הנמוכה מהסף. פעולה זו מצמצמת את הרעש. בניתוח, השתמשו במיקומם של התאים המתים כדי לקבוע את מרכז התמונה.זה מייצג את המיקום שבו התאים נכנסו לתא הכימותקסיס (chemotaxis) ואת המיקום שבו הם היו מזוהים בהיעדר נדידה כלשהי. לאחר מכן, אתרו תאים חיים בתמונה, חלקו את התמונה לערוצים וקבעו את מספר התאים החיים בכל ערוץ. בעבודתנו הקודמת, תא הכימותקסיס ברוחב 50 µm חולק ל-64 ערוצים שרוחבם היה כ-16 µm כל אחד.לאחר חזרה על שלבים אלה עבור כל התמונות, סכמו את סך מספר התאים עבור כל ערוץ בכל התמונות. פעולה זו תספק את סך מספר התאים שזוהו בכל ערוץ לאורך משך הניסוי. חשבו את מקדם המשיכה הכימית (chemotaxis partition coefficient או CPC), המייצג את כיוון הנדידה.על ידי ביצוע השלבים הבאים, הקצו מכפיל של פלוס אחת לכל תא הממוקם בצד בעל הריכוז הגבוה (ימין) ומכפיל של מינוס אחת לכל תא בצד בעל הריכוז הנמוך (שמאל) של התאים המתים. סכמו את כל הערכים המוכפלים ונרמלו אותם למספר הכולל של התאים שזוהו. חשבו את מקדם נדידת הכימוטקסיס, או CMC, השוקל את נדירת התאים לפי המרחק שעברו.לתא שנע לעמדה בעלת הריכוז הגבוה ביותר בערוץ 64 ניתן מקדם שקלול של פלוס 1, בעוד שלתא שנע עד מחצית הדרך לצד בעל הריכוז הגבוה ניתן מקדם שקלול של פלוס 0.5. תא שנע לעמדה הרחוקה ביותר בעלת הריכוז הנמוך מקבל שקלול של מינוס 1. סכום כל ספירות התאים המשוקללות מנורמל למספר התאים כדי להפיק את ה-CMC.גרף זה מציג מדרג ריכוזים ליניארי או פרופיל שנוצר במכשיר המיקרופלואידי באמצעות fluorescein isothiocyanate. היווצרותו של מדרג ריכוזים מודגמת בדמות זו באמצעות צבעים בכחול ובצהוב. כניסת התאים הייתה סגורה (CA) כך שלא הייתה דרכה זרימה, וניתן לראות כי נוצר טווח של צבעים בין כחול לצהוב.להלן תמונות בצבעי פסאודו (pseudocolor) מניסוי כימוטקסיס מייצג, שבו חיידקי e coli RP 4 37 נחשפו במכשיר למדרג ריכוזים של 0 עד 100 µM L aspartate או 0 עד 225 µM nickel sulfate. נדידתם של חיידקים חיים בצבע ירוק לעבר L aspartate או הרחקא מ-nickel צולמה בכל 2.5 שניות במשך 30 דקות. חיידקים מתים, המוצגים באדום, שימשו כביקורת להשפעות זרימה במכשיר.הפיזור המרחבי של RP 4 37 במכשיר המיקרופלואידי בהיעדרו של מדרג ריכוזים מוצג בגרף זה בהשוואה לתגובתו למדרג ריכוזים של אספרטט ולמדרג ריכוזים של ניקל סולפט. הרגע הדגמנו כיצד לנטר את הכימותקסס של e coli RP 4 37 במדרג ריכוזים של ניקל סולפט. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצמצם את השקיפה (vortexing) של התאים כדי שניתן יהיה להשתמש בתת-אוכלוסייה בעלת ניידות גבוהה.זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

a-microfluidic-device-for-quantifying-bacterial-chemotaxis-stable

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ייצור של ערוצי microfluidic ויישומן ניסויים לחקר התנהגות ליקוט chemotactic של חיידקים ימיים בתוך נוף ים מזין אחידה והתנהגות שחייה של חיידקים בתוך זרם גזירה מתוארים.

תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

מחקרים Chemotaxis חיידקית שימוש מיקרופלואידיקה - ראיון

אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

מקור: שיידוויילר, ד., ואחרים. שילוב מכשירים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה לחקר הובלה מיקרוביאלית במדיה נקבובית בקנה מידה מרחבי. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לכימות תנועתיות חיידקית באמצעות מטריצה נקבובית המורכבת מעמודים מסודרים באקראי. חיידקים מסומנים פלואורסצנטית מוכנסים למכשיר, מצולמים במיקרוסקופיה כשהם נעים דרך המטריצה הנקבובית אל ערוץ התצפית, ומנותחים ליצירת עקומת פריצת דרך (BTC).

הערכת תנועתיות חיידקית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

סרטון זה מדגים בדיקת כימוטקסיס נויטרופילים בשיטת All-on-Chip. השיטה מאפשרת בידוד ישיר של נויטרופילים מהדם כולו על ידי ברירה שלילית אימונומגנטית ואחריה בדיקת כימוטקסיס על שבב מיקרופלואידי.

שיטה מיקרופלואידית מבוססת שבב לניתוח מהיר של כימוטקסיס נויטרופילים באמצעות דם מלא

פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.

פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

הגירה תא קולקטיבי בפיתוח, ריפוי הפצע, וגרורות סרטן מונחה לעתים קרובות על ידי מעברי הצבע של גורמי גדילה או מולקולות איתות. המתואר כאן היא מערכת ניסיונית המשלבת מיקרוסקופ המתיחה עם מערכת microflu, והפגנה של איך לכמת את המכניקה של הגירה קולקטיבית תחת הדרגתי הביוכימי.

מיקרוסקופ גרירה משולב עם מיקרופלואידיקה עבור הגירה קולקטיבית כימוטקטיק

פרוטוקול לדור של נופים כימיים דינמיים על ידי פוטוליזה בתוך microfluidic והגדרות מיליפלואידיג מוצג. מתודולוגיה זו מתאימה לחקר תהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל התנהגות נעים, ספיגת מזינים, או הסתגלות לכימיקלים של מיקרואורגניזמים, הן בתא יחיד ברמת האוכלוסייה.

יצירת מבוקרת, נופים כימיים דינמי ללמוד התנהגות מיקרוביאלית

מוצג כאן הוא הפרוטוקול עבור סיסאי chemotaxis סיטו, מכשיר מיקרופלויד שפותח לאחרונה המאפשר מחקרים של התנהגות מיקרוביאלית ישירות בסביבה.

ב סיטו Chemotaxis אסאי לבחון התנהגות מיקרוביאלית במערכות אקולוגיות מימיות

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

למד לחקור כימוטקסיס חיידקי באמצעות מכשיר מיקרו-זורמי. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחרי תנועת E. coli RP 4 37 בתגובה למשתני כימיים במעבדה.

מכשיר microfluidic לכימות Chemotaxis חיידקים Gradients ריכוז אורווה

גלה סרטונים נוספים