באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי
3 בדצמבר 2009
הסרטון מלווה מתאר את השימוש של מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה, אשר מחיצות דגימות חלבון מורכב על בסיס משקל מולקולרי ומשחזרת את השברים בשלב נוזלי. הסרטון מתאר כיצד הטכנולוגיה עובדת, וכיצד נעשה בו שימוש, ומספק נתונים כתוצאה, עם ניתוח ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide של homogenate מופרדים בכבד בקר.
היי, שמי ג'יי הרקינס. אני מדען חוקר ב-Protein Discovery. היום אדגים כמה קל להשתמש במערכת 8,100 Fractionation החדשה ללא ג'ל כדי להשיג פיצול מבוסס משקל מולקולרי להתאוששות גבוהה.
באמצעות ג'ל ללא ג'ל, אתה יכול לטעון עד מיליגרם אחד של חלבון כולל לכל ערוץ, ולחלק באופן שחזורי עד שמונה דגימות תוך כ-90 דקות. אז המערכת כוללת מכשיר, מחסנית חד פעמית וכל המאגרים הדרושים לביצוע הניסוי. אז בואו נתחיל.
התחל הליך זה על ידי הגדרה ותיוג של עד שמונה צינורות של 500 מיקרוליטר לכל צינור. הוסף עד מיליגרם אחד של דגימת החלבון בנפח של עד 112 מיקרוליטר. כמות החלבון בדגימה תלויה במורכבות הדגימה.
עבור דגימות מורכבות יותר, כגון הומוגנאט הרקמה המשמש להדגמה זו, 150 עד 200 מיקרוגרם לערוץ יניבו את התוצאות הטובות ביותר. לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי חמישה, המסופק בערכת המחסניות ללא ג'ל. לכל דגימת חלבון, הוסף שמונה מיקרוליטרים של DTT טוחנת אחת.
לאחר מכן התאם כל דגימה במים לנפח סופי של 150 מיקרוליטר. לאחר מכן מחממים את הבקבוקונים למשך חמש דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס כדי לפגוע בדגימה. הניחו לדגימות המחוממות להתקרר לטמפרטורת החדר בזמן שהדגימה מתקררת.
הסר את מחסנית 8, 100 ללא ג'ל מנרתיק נייר הכסף. הסר והשליך את אוטם הצלחות. הסר את מאגר האחסון מתאי מיכל הדיו באמצעות פיפטה.
אם ייעשה שימוש בכל שמונת התאים של המחסנית, הפוך את המחסנית כדי לנקז את מאגר האחסון מהתאים. שמונה מיליליטר הבאים של מאגר ריצה ללא ג'ל מתווספים לכל אחד ממאגרי מאגר האנודה. שישה מיליליטר מתווספים לכל אחד ממאגרי חיץ הקתודה, ו-100 מיקרוליטר מוזרמים לכל אחד מתאי האיסוף.
בעזרת צינור שמונה תעלות של 100 עד 200 מיקרוליטר, הסר והשליך כל מאגר שזרם ממאגר חיץ הקתודה לתא טעינת הדגימה וטען מיד את הדגימות לתאי הטעינה. לאחר טעינת הדגימות, הנח את המחסנית בתחנת ההפרדה ללא ג'ל 8, 100. לאחר מכן הורד את מערכי האלקטרודות וסגור את המכסה באמצעות ממשק המשתמש הגרפי הקל לתכנות בתצוגת מסך המגע של המכשירים, עבור לרשימת השיטות הזמינות המתוכנתות מראש.
בחר את השיטה המתאימה על ידי לחיצה על כפתור השיטה. לחץ על כפתור האחזור והזן את מספר השיטה הרצויה שתוכנתה מראש באמצעות לוח המקשים שעל המסך לחץ על אישור. לאחר מכן לחץ על כפתור ההחלה.
השיטה שיושמה תופיע בתחתית המסך הראשי. כל אחת מהשיטות המתוכנתות מראש מורכבת ממתחים מוגדרים והפסקות מבוססות זמן שנועדו לפתור חלבונים בטווח מסוים של משקלים מולקולריים. לאחר בחירת השיטה המתאימה, לחץ על כפתור הערוץ במסך הראשי.
לאחר מכן בחר את הערוצים שישמשו בריצה. כדי לבחור את כל שמונת הערוצים, לחץ על בחר הכל. לאחר מכן לחץ על סיום.
כדי לחזור למסך הראשי, ודא שמכסה הבטיחות סגור ושנורית החיווי ירוקה בתחתית המסך. כעת לחץ על התחל כדי להתחיל את הניסוי בזמן שהמערכת פועלת, העיגולים המוצגים בתיבה בצד שמאל של המסך מתארים את המצב של כל ערוץ. עיגול ירוק מציין שהערוץ פעיל.
המתחים והזרמים המופעלים מוצגים מימין למעגלי מצב הערוץ. ה-8, 100 ללא ג'ל יושהה אוטומטית לאיסוף שברים במרווח שצוין בשיטה. כאשר המכשיר מושהה כדי לאסוף שברים, תופיע תיבת טקסט המודיעה לך שהתרחשה הפסקה ועיגולי הסטטוס יהפכו לצהובים.
בתוך המחסנית מופעל מתח קבוע בין מאגרי האנודה והקתודה. תחת פוטנציאל זה, תערובת החלבון מונעת אלקטרופורטית מתא הטעינה לתוך יציקת הדיוק שתוכננה במיוחד. חלבוני ג'ל נערמים תחילה בתוך פס חד בג'ל הערימה ולאחר מכן נפתרים על סמך המשקל המולקולרי שלהם בג'ל הפתרון.
כאשר חלבונים נפלטים מהג'ל, הם נלכדים ומרוכזים בשלב נוזלי. בתא האיסוף ללא ג'ל. לאחר מכן המכשיר מושהה.
בהתבסס על מרווחי זמן שנבחרו מראש, ושברים נאספים באמצעות פיפטה. ואז הפוטנציאל מופעל שוב כדי לרמוז ללכוד את חלק המשקל המולקולרי השני המעניין. לאחר מכן חוזרים על תהליך זה עד לאיסוף כל השברים הרצויים.
כל מחסנית מכילה שמונה ערוצים אלקטרופורטיים עצמאיים כך שהמשתמש יכול להפעיל כמה ערוצים שהוא צריך ולשמור את הערוצים שאינם בשימוש לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להסיר את השברים, פתח את מכסה המכשיר ולאחר מכן השתמש בפיפטה של התעלה המולדת. העבירו את 150 המיקרוליטר של הנוזל בכל אחד מתאי האיסוף לצינורות איסוף או לצלחת מרובת בארות.
לאחר הסרת השברים, שטפו את תא האיסוף פעמיים עם מאגר פועל ללא ג'ל על ידי הוספת 100 מיקרוליטר לתעלה ופיפטינג למעלה ולמטה פעמיים. לאחר הכביסה, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר רץ ללא ג'ל בחזרה לתאי האיסוף. סגור את המכסה ולחץ על כפתור קורות החיים.
ה-8, 100 ללא ג'ל יפעל עד מרווח הזמן הבא. הזמן הכולל שנותר בניסוי מוצג בצד ימין של המסך. לחץ על הכפתור מעל התיבה המציג את הזמן כדי לעבור בין הזמן שנותר, הזמן שחלף לזמן ההפסקה.
לאחר איסוף כל השברים, ניתן להשתמש בהם מיד להכנה נוספת במורד הזרם, כגון מיקוד איזואלקטרי או אלקטרופורזה של ג'ל או לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה או זיקה חיסונית. בהדגמה זו, שמונה דגימות חלבון במשקל 200 מיקרוגרם כל אחת חולקו ל-12 שברים כל אחת בסך הכל 96 שברים. כדי להמחיש את תוצאות הפיצול והפיצול של כל אחד מ-12 השברים מכבד הבקר, דגימת הומוגנאט הופעלה לאחר מכן על ג'ל 1D סטנדרטי וצבוע בכסף.
כפי שמוצג באיור זה, דגימת החלבון חולקה ל-12 שברים נפרדים המשתרעים על טווח המשקל המולקולרי מ-3.5 קילודלטון ל-150 קילודלטון. הג'ל המוצג כאן מדגיש את היכולת של מערכת 8,100 ללא ג'ל לפירוק כמות גדולה של חלבון לשברי משקל מולקולרי נפרדים. זהו כלי רב עוצמה להפליא עבור פרוטאומיקה מלמעלה למטה ומלמטה למעלה באמצעות ספקטרומטריית מסה כמו גם ניסויי זיקה חיסונית שבהם נדרש שבר משקל מולקולרי שלם של חלבון מטוהר יחיד.
זה היה תענוג להראות לך כמה קל להשתמש במערכת הפיצול ללא ג'ל 8, 100 כדי לחלק את הדגימה שלך לשברי משקל מולקולרי נפרדים, ולהשיג התאוששות פאזה נוזלית גבוהה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את מערכת הפרקציונציה GELFREE 8100, המבצעת חלוקה יעילה של דגימות חלבון מורכבות על בסיס משקל מולקולרי. תהליך זה מאפשר השבה גבוהה של פרקציות במופע נוזלי, ובכך מקל על ניתוחים נוספים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פרקציונציה של חלבונים
- אלקטרופורזה
- ניתוח ביוכימי
רקע
- מערכת ה-GELFREE 8100 תוכננה לניתוח חלבונים בתפוקה גבוהה.
- היא מאפשרת הפרדה של חלבונים ללא שימוש בג'לים.
- שיטה זו שימושית במיוחד עבור דגימות מורכבות כגון הומוגנאטים של רקמה.
- פרקציונציה יעילה יכולה לשפר יישומים המשכיים.
מטרת המחקר
- להדגמת הפונקציונליות של מערכת הפרדת הפракציות GELFREE 8100.
- להדגמת קלות השימוש והיעילות של המערכת.
- לספק תובנות לגבי תהליך הפרדת הפракציות והנתונים המתקבלים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות חלבון באמצעות באפרים ספציפיים.
- שימוש במחסית (cartridge) חד-פעמית לצורך פרקציונציה.
- הפרדה אלקטרופורטית על בסיס משקל מולקולרי.
- איסוף פרקציות להמשך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- חלוקה מוצלחת של דגימות חלבון למספר פראקציות.
- הוכחת שחזוריות ויעילות באיסוף הפראקציות.
- תוצאות ויזואליות מניתוח אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
- פוטנציאל ליישומים מיידיים של ניתוחים המשכיים (downstream).
מסקנות
- מערכת ה-GELFREE 8100 מספקת שיטה מהימנה לפרקציונציה של חלבונים.
- היא מפשטת את זרימת העבודה עבור חוקרים בתחום ניתוח החלבונים.
- הטכנולוגיה משפרת את היכולת לנתח תערובות חלבונים מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכת השבירה GELFREE 8100 מאפשרת הפרדת חלבונים המבוססת על משקל מולקולרי בשיעור התאוששות גבוה ובפאזה נוזלית, ובכך היא מבטלת שלבים התלויים בג'ל ומשפרת את השחזוריות. יכולת זו תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי יצירת פראקציות מטוהרות לניתוחים פרוטאומיים המשכיים, ומפחיתה שונות טכנית בתהליכי תיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות. תכנונה הרב-ערוצי המבוסס על מחסניות מאפשר עיבוד מקבילי של עד שמונה דגימות, ובכך הוא מגביר את התפוקה במאמצים לזיהוי מובילים (lead identification) ולהפחתת סיכונים מכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד של פרקציות חלבון שלמות בטווח רחב של משקלים מולקולריים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות פרקציונציה הדירה של דגימות מורכבות, כגון הומוגנאטים של רקמות.
- ערך חיזוי: מייצר פרקציות מנוקות המשפרות את רמת הוודאות בנוגע למעורבות המטרה (target engagement) ובניתוח מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פראקציות בשלב נוזלי התואמות לבדיקות המשך כגון ספקטרומטריית מסות ולכידה אימונו-אפיניטית.
- ערך תפעולי: מבטל את שלבי חיתוך הג'ל, ובכך מגביר את הסטנדרטיזציה ומפחית את זמן העבודה המעשית.
- יכולת הרחבה: מאפשר הכנה של ספריות פראקציות סטנדרטיות עבור מסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תוצרי הפרקציות שומרים על תכונות פיזיקו-כימיות, מה שתומך בהלימה של סממנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מקל על ביסוס מתאם בין פרקציות ספציפיות למשקל מולקולרי לבין פעילות תפקודית במערכות רלוונטיות למחלה.
- מיון פורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי בידוד פרוטאופורמים לצורך תיקוף תפקודי.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
המערכת משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת תוצרי פרקציונציה המשמשים כתשומות לתהליכי עבודה של תיקוף אנליטי ותפקודי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי הפרדה של תערובות מורכבות לפרקציות בעלות משקל מולקולרי נפרד.
- סקרים (Screening): מייצרת פרקציות מוכנות לבדיקה עם רמת שחזור ושחזוריות גבוהה לצורך סקר של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת תוצרי פאזה נוזלית כמותיים המתאימים לאנליזת LC-MS ו-western blot.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי שמירה על שלמות החלבון עבור בדיקות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון מבוסס מחסנית מאפשר אחסון של ערוצים שלא נעשה בהם שימוש להרצות עתידיות, ובכך מקדם יעילות במשאבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון בחיזוי באמצעות הפרדה נאמנה של משקל מולקולרי והפחתה באובדן דגימות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות וביטול שונות המאפיינת שיטות מבוססות ג'ל.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות נתוני פרקציונציה אמינים והפחתה בשיעורי כשל טכניים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות בהתבסס על נתונים תפקודיים ספציפיים לפרקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת דגימות חלבון ובעקרונות הפרדה אלקטרופורטית.
- תלוי בגישה למכשיר GELFREE 8100 ולמחסניות ולבופרים הקנייניים.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לטעינת דגימות, הפעלת מתח ותזמון איסוף פרקציות.
- שיקולי התאמה לסוגי דגימות משתנים (למשל, סרום, ליזאטים של תאים, הומוגנאטים של רקמות).
- מגבלה מעשית: רזולוציית הפרקציות מוגבלת על ידי הפסקות מוגדרות מראש המבוססות על זמן בשיטה, דבר המצריך אופטימיזציה של השיטה עבור טווחי מסה חדשים.
