החלב להשתלות אפיתל נוהל
10 ביוני 2010
מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme KB Et al. (1959) ואת ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B Et al. (2008) עבור ניקוי משטח 4 מפשעתי שומן החלב של עכבר מתבגרת לקראת השתלה של שברי החלב, לתאי האפיתל החלב, או תאים סרטניים החלב.
סרטון זה מדגים פרוצדורות לאיסוף אפיתל של בלוטת העלה, פינוי של כרית השומן של בלוטת העלה והשתלת אפיתל אקסוגני כדי לחקור את התפתחות בלוטת העלה בעכברים בני שלושה שבועות; בשלב זה, צמיחתו של העץ האפיתלי של בלוטת העלה מוגבלת לסביבת הפטמה, וכרית השומן נטולת ברובה אפיתל של בלוטת העלה. ככל שהעכבר מבשיל, העץ האפיתלי גדל דרך כרית השומן.
עד לשבוע השביעי לחייהן, עץ התעלות האפיתליאליות מתפשט בכל רחבי כרית השומן. אם החלק הקטן של כרית השומן המכיל אפיתל יוסר בשבוע השלישי לחייהן, האפיתל האנדוגני לא יאכלס לעולם את כרית השומן הזיכרון, וכרית השומן תוגדר כנקייה ותישאר נקייה בבגרותה. עם זאת, לאפיתל, לתאי אפיתל או לזיכרון תורם מושתל יש פוטנציאל להרחיב עצי תעלות זיכרון בכל רחבי המאחס הנקי.
כרית שומן. ניתן להשתמש בהיסטולוגיה כדי לנטר את התקדמות התפתחות הזיכרון ברקמות מושתלות מבעלי חיים טרנסגניים או חיות ניסוי. שלום, שמי ג'וזף ג'רי, ואני מהמחלקה למדעי הווטרינריה והחיים באוניברסיטת מסצ'וסטס.
שלום, שמי קארן דאנפי. אני עובדת במעבדת ג'רי. היום נבצע השתלה של אפיתל השד.
אנו משתמשים בנוהל זה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי והתאי להיווצרות גידולי שריר הזיכרון ומודל לסרטן השד. אז בואו נתחיל. השלב הראשון של הליך ההשתלה הוא קציר של רקמה אפיתליאלית של שריר הזיכרון מהעכבר התורם.
התחילו בשטיפת עכברת נקבה שהורדמה לאחרונה ב-70% ethanol, ללא פגיעה בממברנות של ה-SRUs בחלל הגוף הוונטרלי. בצעו חתך סגיטלי מרכזי דרך העור, המשתרע מהפובsetIs עד לסטרנום. לאחר מכן, בצעו חתך אלכסוני מהחתך הראשוני בפובsetIs לכיוון כל אחת מהרגליים האחוריות.
באמצעות פינצטה קמורה, אחזו בממברנות של ה-SRUs. לאחר מכן, באמצעות פינצטה ישרה עם שיניים, אחזו בקצה החתוך של העור וקלפו בזהירות את דופן הגוף מהממברנות של ה-S cs.
כדי לחשוף את בלוטת הזיכרון המפשעת הרביעית המחוברת לצדו התחתון של דופן הגוף, יש לאתר את קשרי הלימפה בתוך בלוטת הזיכרון בנקודת המפגש של שלושה כלי דם בולטים בבלוטה; ניתן להרגישם כקשרית דחוסה בתוך כרית השומן. בעזרת קצה של מספרי עיניים, יש לקטום את הרקמה השומנית המקיפה את קשרי הלימפה. לאחר מכן, בעזרת אצבע המורה בצד האפידרמלי של העור, יש להפעיל לחץ כדי להרים את הקשרי הלימפה מתוך כרית השומן ולנתק אותם בתנועת צביטה.
באמצעות זוג פינצטות קמורות, השליכו את קשרית הלימפה. כעת, תוך כדי החזקת שולי העור, תפסו את רפידת השומן של בלוטת הע remembered (mammary fat pad) בעזרת הקצה הקמור של זוג פינצטות קמורות וקלפו בהדרגה את רפידת השומן מדופן הגוף. בהתאם לכיוון רפידת השומן לעבר השטח הגבי של העכבר, הסירו את בלוטת הע remembered (mammary gland) כולה כיחידה אחת.
הניחו את בלוטת הזיכרון על משטח חיתוך פלסטי סטרילי עם כמות קטנה של מצע, כ-200 microliters, על פני השטח של הבלוטה כדי לשמור עליה לחה. לאחר מכן, קצצו את הבלוטה לחתיכות של מילימטר אחד באמצעות להב תער חדש. חלקו את הבלוטה הקצוצה לארבע מנות.
לאחר מכן, בעזרת פינצטה, חלק את התאים בין ארבעה מבחנות קריו (cryo vials) המכילות מדיום הקפאה. הנח את מבחנות הקריו במקפיא תאים מסוג Nalgene עם 250 milliliters של isopropyl alcohol בתא החיצוני. לאחר מכן, הנח את מקפיא התאים בטמפרטורה של minus 70 degrees Celsius למשך 24 שעות.
לאחר 24 שעות, העבירו את המבחנות ההקפאה של מקטעי הזיכרון לחנקן נוזלי עד למועד ההשתלה. כל מבחנה קריוגנית מכילה מספיק מקטעים של בלוטת הזיכרון להשתלה במגעי השומן המרוקנים של ארבעה עד שמונה עכברי מאכסן. לאחר אימות עומק ההרדמה של עכבר מאכסן בן שלושה שבועות באמצעות צביטה בבהונות, קבעו את העכבר בחוזקה כאשר צדו הגחוני פונה כלפי מעלה וגפיו פרושות על משטח ניתוח, כך שבטנו תהיה מתוחה.
יש להעניק משכך כאבים טרום-ניתוחי, bupivacaine או buprenorphine, בהזרקה תת-עורית. חטא את אזור הניתוח באמצעות אלכוהול ותמיסת קרצוף מבוססת יוד בעזרת פינצטה. תפוס את העור מספר מילימטרים מעל האגן והרם אותו מהבטן.
צבטו בזהירות את העור, תוך הבטחה שהחתך הראשוני אינו קרוב מדי לשופכה, שכן מיקום של קליפסי סגירת פצעים עלול להפריע ליכולת ההשתנה של העכבר. לאחר מכן, תוך הקפדה שלא לנקב את קרומי ה-SRUs, בצעו חתך סגיטלי מרכזי דרך העור, המשתרע מהפיובס ועד לעצם החזה (sternum).
כעת, מהחתך הראשוני, בצעו חתכים אלכסוניים דרך העור מקו האמצע לרוחב האגן לכיוון כל אחת מהרגליים האחוריות. בעזרת פינצטה מעוקלת, אחזו בעדינות בממברנות ה-S ceros של דופן הגוף הוונטרלית. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה לרקמות כדי לאחוז בשולי העור החתוך ומשכו את דופן הגוף הרחק מממברנות ה-ceros.
כדי לחשוף את בלוטת הזיכרון המפשעת הרביעית, זהו את בלוטת הזיכרון הרביעית. זהו את בלוטת הזיכרון החמישית, צרוב את קשרי הפטמה ואת שני העורקים המובילים לקשר. הפרד בין הבלוטות הרביעית והחמישית, ולאחר מכן צרוב את שולי הבלוטה החמישית.
בשלב הבא, בעזרת מספריים, גזרו לרוחב כרית השומן, ממש ונטרלית לצומת, כדי להפריד את כרית השומן של בלוטת הזיכרון הרביעית. בעזרת פינצטה קמורה, אחזו בחוזקה בחלק הוונטרלי של כרית השומן ומשכו אותה הרחק מדופן הגוף. מומלץ להניח את הרקמה שהוסרה, כיחידה אחת, בין שתי זכוכיות כיסוי מסומנות ולקבע אותה בקיבוע Carnot.
מאוחר יותר ניתן לצבוע את הרקמה, לקבע אותה ולבחון את שולי הגזירה. בעזרת פינצטה, הסר את כל השאריות של בלוטת הזיכרון מסביב לאזור החלק שהוסר מסינני השומן (fat pad). בעל החיים מוכן כעת להשתלת רקמה או תאים.
ניתן להשתיל רקמה אפיתליאלית של תורם, טרייה או שהוקפאה בהקפאה מהירה, אל תוך גוש השומן שהורחקה ממנו השומן (cleared fat pad). לחלופין, ניתן להשתיל שורות תאים אפיתליאליים ממורחנים, שורות תאים של גידולים ממורחנים או תאים ראשוניים. לפרטים על הכנת התאים, אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף להשתלת מקטעי אפיתל שהוכנו.
סרטון זה מתחיל בהפשרה של מבחנה קריוגנית של אפיתל והעברה של השברים לצלחת פטרי המכילה מצע טרי. כדי לדלל את ה-DMSO, צרו באמצעות מספריים כיס באפיתל של גוש השומן המנוקה של העכבר המקבל. לאחר מכן, בעזרת פינצטה דקה, הניחו פיסה של מילימטר אחד של אפיתל התורס בתוך הכיס.
במידת הצורך, החזיקו את הכיס סגור באמצעות פינצטת רקמה והוציאו את פינצטת המחט כך שהרקמה תישאר במקומה. אחזו בשולי העור הנגדיים. החזיקו אותם יחד באמצעות פינצטה.
הרם אותם הרחק ממברשמות ה-ceros של חלל הגוף הגחוני וסגור באמצעות סיכות לסגירת פצעים. השתמש בשתי סיכות לסגירת החתך המדיסגיטלי ובסיכה אחת עבור כל חתך אלכסוני. הימנע מחסימה של השופכה במידת הצורך.
סגרו את המרווחים בעור בנקודת המפגש של החתכים המיד-סגיטליים והאלכסוניים באמצעות תפר. החזירו את העכבר לכלובו והשאירו את הכלוב תחת מנורת חימום עד להתעוררות העכבר. יש להסיר את סיכות הסגירה של הפצע לאחר שבועיים.
השקופיות הבאות מציגות תמונות מייצגות של מה שניתן לצפות למצוא בבלוטת הזיכרון של המארח לאחר ניקוי הרפידה המוזנת והשתלת אפיתל; תמונה זו מראה את אפיתל הזיכרון האנדוגני שהוסר מעכבר בן שלושה שבועות. בהליך ניקוי הבלוטה, שימו לב לשוליים הנקיים בקצה החתך. יש להכין דגימה שלמה (whole mount) כזו לאחר כל הליך כדי להעריך את ניקיון השוליים.
תמונה זו מציגה את גוש השומן המנוקה של העכבר שבעה שבועות לאחר הליך הניקוי. שימו לב שגוש השומן כולו נטול ממקרופאגים, אפיתל, המטין ואציני. צביעה של גוש שומן מנוקה שבעה שבועות לאחר הליך הניקוי מדגימה גם כי בבלוטה אין אפיתל.
מוצגת דוגמה של דגימה שלמה (whole mount) של פד שומן שעבר בידור (cleared) ואליו הותסב אפיתל זיכרון מתורם מעכבר בן 10 שבועות. שימו לב כי האפיתל שהותסב ייצר עצי תעלות אפיתליאליות תקינים, המטין ואסיני. צביעה של פד שומן שעבר בידור וזיכרון.
השתלה של אפיתל בגיל זה חושפת ייצור תקין של צינוריות אפיתליאליות מהאפיתל החיצוני. כאן, צביעה של גוש שומן שעבר בירוח בעזרת hematin ו-asin מראה השתלה אפיתליאלית שהתפתחה לגידול שד. כעת הצגנו בפניכם כיצד לאסוף אפיתל של בלוטת השד ולבצע השתלה של אפיתל שד.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנתק את החיבורים בין בלוטה ארבע וחמש כדי לצרוב את הקשרית ואת הפטמה, ולהסיר את כל השאריות של אפיתל אנדוגני. יש לוודא שלא קיימת אפשרות שרקמה אפיתלית אנדוגנית תצמח לתוך רפידת השומן שהורחקה. בנוסף, מומלץ לבצע בדיקה של כל חלקו של המקטע שהוסר מבלוטת החלב כדי לוודא ששוליים נקיים.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים פרוצדורות לאספירה של אפיתל השד, פינוי של כרית השומן של השד, והשתלה של אפיתל אקסוגני כדי לחקור את התפתחות השד בעכברים. המחקר מדגיש את דפוסי הגדילה של עץ האפיתל של השד ביחס לכרית השומן במהלך התבגרות העכבר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של בלוטות החלב
רקע
- כרית השומן של בלוטת החלב היא קריטית להתפתחות בלוטת החלב.
- הבנת צמיחתו של העץ האפיתליאלי יכולה לספק מידע על תהליכי התפתחות.
- מחקרים קודמים ביססו שיטות להשקיפות (clearing) ולהשתלה של רקמות בלוטת החלב.
- מודלים של עכברים משמשים בדרך כלל לחקר הביולוגיה של בלוטת החלב.
מטרת המחקר
- להדגמת פינוי של כרית השומן של בלוטת החלב בעכברים בגיל ההתבגרות.
- להקל על השתלה של מקטעי רקמה או תאים של בלוטת החלב.
- לבחון את ההשפעות של אפיתל אקסוגני על התפתחות בלוטת החלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר של אפיתלל השד מעכברי תורם.
- ניקוי של כרית השומן של השד להסרת אפיתלל אנדוגני.
- השתלה של אפיתלל שד אקסוגני לתוך כריות שומן מנוקות.
- מעקב אחר צמיחת עץ האפיתלל של השד לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- בעכברים צעירים, העץ האפיתלי גדל באופן מוגבל לסביבת הפטמה.
- עד לשבוע שבע, העץ הניתבי משתרע על פני כרית השומן כולה.
- הסרה של כרית השומן המכילה אפיתל בשבוע השלישי מונעת התאכלסות מחדש.
- אפיתל מושתל יכול להרחיב עצים ניתביים במארחים שעברו פינוי.
מסקנות
- פינוי רקמת השומן של העטב יעיל לחקר התפתחות העטב.
- תאי אפיתל חיצוניים יכולים לאכלס בהצלחה רקמות שומן שפונו.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי הביולוגיה וההתפתחות של בלוPayout העטב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הליך הש transplant של אפיתל השד מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית במחקרים על סרטן השד על ידי בידוד האינטראקציות בין האפיתל לסבב (stroma). הוא תומך בתיקוף של מטרות טיפוליות בכך שהוא מאפשר הערכה מבוקרת של פוטנציאל תומורגני במיקרו-סביבות מוגדרות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי ביטול משתנים מתבלבלים הנובעים מגנוטיפ המארח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי בדיקת אוטונומיה של תאי אפיתל ברקמת שומן שהורחקה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של תאי גזע של העטרה באמצעות השתלה בדילול מוגבל.
- ערך מדעי: קובע האם רקעים היפרפלסטיים מתפתחים לגידולים ללא גורמים מערכתיים מבלבלים.
- ערך תפעולי: מעריך את השפעות החשיפה להורמונים על התנהגות האפיתל במערכת מבודדת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכה כמותית של היווצרות עץ התעלות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פינוי רקמת השומן להבטחת השתחתוביות (engraftment) אפיתליאלית הניתנת לשחזור.
- ערך מדעי: תמיכה בסריקה ניתנת להרחבה של אפיתליום טרנסגני או אפיתליום לבדיקה לצורך בחינת פוטנציאל תומורגני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מידול הפתוגנזה של סרטן השד אנושי ברפיות שומן של עכברים.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות השתלה סדרתית.
- ערך מדעי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון בהתבסס על קינטיקה של צמיחה אפיתליאלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנחור עיבוד (Pipeline)
השיטה משולבת בביולוגיה של גילוי לבחינת השערות, לסריקת מוכנות של בדיקות, ולמחקר תרגומי להמשכיות פרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות באמצעות בידוד משתנים אפיתליאליים בפדים של שומן שעברו הבהרה.
- סריקה: מתאר את המוכנות של הבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של פדי שומן והשתלה אפיתליאלית.
- אנליטיקה: מדגיש ניתוח כמותי של דגימות שלמות (whole mount) להשוואת היווצרות העץ התעילתי האפיתליאלי.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי אפשור ניטור ארוך טווח של אפיתל מושתל.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את פד השומן המובהר כפלטפורמה רב-פעמית להערכות של אפיתל מתורמים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות הפחתת משתנים מבלבלים של הסטרומה והאפיתל.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות שלבי פינוי והשתלה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הערכת פוטנציאל תומורגני בסביבות מיקרו-סביבתיות מבוקרות.
- השפעה על תיק הפיתוח: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על מדדי צמיחה אפיתלית ויצירת גידולים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות ניתוח בעכברים ובזיהוי כריות שומן.
- מחייב שימוש במכשור כירורגי סטרילי ותשתית קריו-שימור עבור רקמות תורם.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של קריטריוני פינוי כדי להבטיח הכנה הדירה של כריות השומן.
- כולל שיקולי התאמה בין זני עכברים שונים ומקורות אפיתליאליים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון תלות בגיל המארח וסיכונים לפינוי חלקי.
