Name: החלב להשתלות אפיתל נוהל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למדו כיצד לקצור אפיתל חלבי, לנקות את כרית השומן החלבית ולהשתיל אפיתל זר כדי לחקור את התפתחות בלוטת החלב בעכברים. שיטה זו מאפשרת לבחון צמיחת עץ האפיתל החלבי ותפקידו בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנה של האפיתל להשתלות רקמות התורם טריים או קפואים אפיתל ניתן להשתיל לתוך כרית שומן פינה, אבל הכנה מוקדמת של האפיתל תורם קפוא נוח יותר עם ירידה מזערית יעילות ההשתלה (&gt; יעילות 85%). פרוטוקול להכנת אפיתל תורם קפוא הוא כדלקמן: לפני הכנת השתלת אפיתל התורם, להכין התקשורת להקפיא את האפיתל ואת aliquot על 1ml לתוך cryovials. זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים עד הצורך. הקפאת התקשורת מכיל DMEM/F12 התקשורת שנאגרו עם HEPES ו NaHCO 3, 10% בסרום שור העובר (FBS) ו sulphoxide דימתיל 10% (DMSO). קציר אפיתל החלב מן העכבר נקבה מורדמים לאחרונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העכבר עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך באמצע sagittal דרך הקיר הגוף המשתרעת חיק אל עצם החזה ללא חודר את הקרומים הריריים של הגוף הגחון. בצע חתך אלכסוני מן החתך הראשוני על חיק לעבר כל רגל אחורית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הקיר הגוף הרחק ממברנות הצפק לחשוף את בלוטת החלב 5 th מפשעתי המצורפת fascia על החלק התחתון של הקיר הגוף. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא על ידי אוחז בקרום הצפק בזהירות עם החלק המעוגל של זוג מלקחיים מעוקל, נזהרים שלא לנקב את חלל הגוף הגחון. במקביל, לתפוס את הקצה של integument לחתוך ישר עם מלקחיים משוננת ולמשוך את קיר הגוף הרחק קרום הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את קשרי לימפה בתוך בלוטת החלב. קשר הלימפה ממוקמת בצומת של שלושה כלי דם בולטים בלוטת החלב וניתן הרגשתי גולה צפופה בתוך כרית השומן (איור 2). עם קצה של זוג מספריים העין, צביטה השומן הרקמה הסובבת את הצומת. עם אצבע הקדמי בצד האפידרמיס של העור, להפעיל לחץ כדי להעלות את את הצומת של כרית שומן ולצבוט אותו עם זוג מלקחיים מעוקל. מחק את הצומת לימפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את השוליים של העור, לתפוס את כרית שומן החלב עם קצה מעוגל של זוג מלקחיים מעוקל ובהדרגה לקלף כרית שומן מן הקיר הגוף. בצע את הכיוון של כרית השומן כלפי המשטח הגבי של העכבר תוך כדי להסיר את בלוטת החלב כולו בחתיכה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את בלוטת החלב על גוש פלסטיק סטרילי לחיתוך. הוספת כמות קטנה של כלי התקשורת, על μl 200, על פני השטח של בלוטת כדי לשמור אותו לח. לקצץ את בלוטת לחתיכות 1mm בסכין גילוח טרי. מחלקים את בלוטת טחון לארבע מנות ולהפיץ בין ארבעה cryovials התקשורת להקפיא עם מלקחיים. שים את cryovials ב הקפאה "מר התא Nalgene פרוסטי שבה יש 250 מ"ל של אלכוהול איזופרופילי בתא החיצוני. שים את במקפיא Nalgene בתוך מקפיא -70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. Store בקבוקונים של שברי החלב קפוא בחנקן נוזלי עד נדרש השתלה. cryovial כל יכיל שברי בלוטת החלב מספיק השתלת לתוך רפידות שומן פינה של 4 עד 8 עכברים המארח. </li></ol> 2. הכנת תאים להשתלות במעבדה שלנו יש להשתיל תאים מסוגים שונים, כולל החלב קווי הנציח תא אפיתל, החלב שורות תאים סרטניים או תאים החלב הראשוני לעכבר פינה כרית שומן. פרוטוקול להכנת פסיק-D תאים להשתלה הוא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Comma-D תאים בתרבית התקשורת MECL רגיל המכיל DMEM: F12 בתוספת 2% למבוגרים שור סרום (ABS), mEGF, אינסולין, אנטיביוטי / Antimycotic (AB / PM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Comma-D תאים קציר כאשר התאים הם ומחוברות -90% -85%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא 1200rpm במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend התאים התקשורת MECL טריים להתאים את ריכוז התאים 5 x 10 6 / ml. </li></ol> עבור השתלה של תאים החלב הראשוני, התאים העיקריים אפיתל החלב מבודדים מבלוטות החלב עכבר 5 th באמצעות ניתוק מכני האנזימטית. תאים הם resuspended ב DMEM: התקשורת F12 והותאמו הריכוז הרצוי, בדרך כלל 5 x 10 6 / ml. 3. הנוהל המקובל עבור ניקוי משטח עכבר שומן החלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את שלושת עכבר ישן שבוע המארח. בחר עכברים כי הם &lt;12 גר 'כדי להבטיח צמיחה ductal החלב לא היה יזם. אנו משתמשים 200mg/kg ממשקל הגוף של tribromoethanol-2,2,2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי העכבר הוא הרדים, בתוקף לרסן את העכבר, בצד הגחוני עם גפיים המושטת, על הבמה כירורגי כך הבטן היא להקניט. לפני הניתוח, לנהל משככי כאבים, או bupivacaine (1mg/kg &lt;) או עצירות (0.05mg/kg), תת עורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את העור עם מלקחיים כמה מילימטרים מעל האגן והרם אותו כלפי מעלה מהבטן . ניפ את העור עם מספריים ולעשות חתך באמצע sagittal דרך הקיר הגוף המשתרעת חיק אל עצם החזה. אין לנקב את הקרומים הריריים של הגוף הגחון. אל תעשה חתך הראשונית שלך קרוב מדי השופכה, כך קליפים הפצע לא יפריע היכולת של העכבר כדי להשתין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן החתך הראשוני, לבצע חתכים אלכסוניים דרך העור מאמצע קו לרוחב האגן כלפי כל רגל אחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזור המעוגל של מלקחיים המעוגל בעדינות כדי לתפוס את קרום הצפק. שימוש במלקחיים רקמות לתפוס את שולי חתך של העור ולמשוך את קיר הגוף הרחק ממברנות הצפק ולחשוף את בלוטת החלב 5 th מפשעתי ממוקם על fascia על החלק התחתון של הקיר הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצרוב, הפטמה הצומת ושני העורקים המובילים אל הצומת (איור 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את בלוטות הרביעי והחמישי. לצרוב את השוליים של בלוטת החמישי כדי למנוע ingrowth מבלוטת 6 ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את כרית השומן של בלוטת החלב הרביעי של חיתוך פני כרית שומן עם מספריים רק הגחון (צד לעבר הפטמה) של הצומת. שימוש במלקחיים מעוקל כדי לתפוס בחוזקה את החלק הגחוני של כרית השומן למשוך אותו מהקיר הגוף בחתיכה אחת. לחצו על החלק הגחוני של כרית השומן בין שתי שקופיות לשים צלחת היסטולוגיה מכתים זכוכית המכיל מקבע של Carnoy. רקמה זו תהיה קבועה מוכתם לאחר מכן עם פתרון אלום ארגמן לבדוק שולי פינה (איור 3). נקו את fascia סביב האזור של החלק הסיר של כרית שומן כדי להסיר את כל עקבות של בלוטת החלב עם מלקחיים מעוקל. </li></ol> 4. הליך אלטרנטיבי "מתחשבת עבור ניקוי Pad שומן אחרי אחד הפך מוכשר עם הליך סטנדרטי עבור ניקוי משטח העכבר שומן החלב, הם יעדיפו לנסות את ההליך חוסך פחות פולשני שפותח על ידי בריל et al. (2008) 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את העכבר כמו בנוהל הרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס את הפטמה של בלוטת החלב מפשעתי הרביעי וחתך 3-5 מ"מ היקף המעגל סביב הפטמה עם קצה של מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את הפטמה מהגוף לנתק את החלק לחתוך העור לצייר את בלוטת החלב fourth מפשעתי החוצה דרך החור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הצומת. השתמש כויה כדי לצרוב את הצומת ואת בלוטת החלב 6 th דרך החור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לנתק את החלק השטחי ביותר של בלוטת החלב 5 th ממש לפני הצומת. , באזור הפטמה מעגלי של עור חלק משטח אפיתל החלב שומן המכיל יוסרו בחתיכה אחת. </li></ol> 5. רקמות / השתלת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שברי אפיתל השתלה, להפשיר cryovial של האפיתל ולהעביר את שברי אפיתל כדי בצלחת פטרי המכילות מדיה טרי לדלל את DMSO. עושים חור בכיס קטן או כרית שומן פינה עם קצה מספריים עבור אפיתל חדש. שים חתיכת 1mm של האפיתל תורם לכיס עם מחט מלקחיים. החזק את כיס סגור עם מלקחיים רקמות כמו שאתה למשוך את מחט מלקחיים כך הרקמה נשארת במקומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים השתלה, להזריק 50,000 תאים μl 10 של מדיה לתוך כרית כל השומן באמצעות מזרק 50μl המילטון עם מחט מד 22s. </li></ol> 6. סגירת / התחייה של עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרים את העור הסגירה. אחוז המתנגדים שולי העור, להחזיק אותם יחד עם מלקחיים, להרים אותם הרחק את הקרומים הריריים של הגוף הגחון ולסגור עם קליפים הפצע. בדרך כלל, יש צורך להשתמש בשני קליפים כדי לסגור את החתך באמצע sagittal קליפ אחד עבור כל חתך אלכסוני עבור ההליך הסטנדרטי. הימנע חוסם את השופכה. זה עשוי להיות נחוץ כדי לסגור פערים העור בצומת של חתכים אמצע sagittal ו אלכסונית עם תפר. ההליך חוסך רק דורשים קליפ אחד פצע לכל צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . מניחים את העכבר בתוך הכלוב שלה לשמור את הכלוב תחת מנורת חימום עד העכבר מתאושש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפים הפצע יש להסיר לאחר 2 שבועות. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הפגנה של דפוס החתך. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מיקום של הלימפה, כלי הדם, הפטמה אפיתל אנדוגני. לצרוב במקומות המצוין. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הר שלם מוכיח כי אפיתל אנדוגני היא מוגבלת לאזור בתוך המעגל ולכן השוליים הם "ברור". 7. נציג תוצאות _r.jpg "alt =" איור 4 "/&gt; איור 4. הר שלם של כרית השומן להסיר העכבר 3 בשבוע הישן מראה שולי פינה. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. הר שלם של העכבר בן 10 בשבוע מראה כרית שומן פינה של האפיתל החלב אנדוגני. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. Hematoxylin וסעיף eosin מוכתם של כרית שומן פינה מהעכבר 10 בשבוע הישן. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7. הר שלם של העכבר בן 10 בשבוע מראה נורמלי עץ ductal החלב התפתח אפיתל המושתלים. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="איור 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 8"> איור 8. Hematoxylin וסעיף eosin מוכתם של צינוריות החלב התפתח אפיתל המושתלים. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="איור 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 9"> איור 9. Hematoxylin ו eosin סעיף מוכתם של גידול החלב התפתח אפיתל המושתלים.

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

בדו&quot;ח זה, אנו מציגים שתי שיטות חלופיות עבור ניקוי משטח העכבר שומן החלב לקראת השתלות אפיתל החלב. הנוהל המקובל כבר בשימוש מאז הפיתוח שלה בשנת 1959 על ידי DeOme et al. 1 בעוד פולשני יותר, השיטה המקובלת היא השיטה המועדפת להכשרת טירון כי המבנה והכיוון של בלוטת החלב נתפסים בקלות. עם זאת, ההליך חוסך עשוי להיות מועדף על ידי מנתח מנוסה יותר בשל מספר יתרונות 2. והחשוב מכל, את ההליך חוסך היא פחות פולשנית, דורש פחות זמן יכול להתבצע באמצעות תקופה קצרה של הרד...

החלב להשתלות אפיתל נוהל

Mammary Epithelial Transplant Procedure

מאמר זה מתאר ומשווה את כרית השומן אישור נוהל שפותח על ידי DeOme KB et al. 1 ו את ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B et al. 2, ואחריו הליך ההשתלה החלב אפיתל. הליך ההשתלה החלב נעשה שימוש נרחב על ידי ביולוגים החלב משום שהיא מנצלת את העובדה התפתחות משמעותית של האפיתל החלב אינה מתרחשת רק לאחר גיל ההתבגרות. ב 3 שבועות של גיל, צמיחה של עץ אפיתל החלב מוגבל באזור הפטמה ולוח נטול שומן ברובו של האפיתל החלב, אלא על ידי 7 שבועות של גיל העץ ductal אפיתל משתרע לאורך כרית שומן כולו. לכן, אם זה חלק קטן של כרית שומן המכילה אפיתל, האזור בין הפטמה לבין הלימפה, מוסר בשעה 3 שבועות של גיל, אפיתל אנדוגני לא יהיה לאכלס את כרית שומן החלב ולוח שומן מתואר &quot;כחכח &quot;. בשלב זה, אפיתל החלב ממקור אחר ניתן להשתיל בפנקס השמן פינה שבה יש פוטנציאל להרחיב עצים ductal החלב החוצה דרך כרית שומן. הליך זה נוצל במודלים ניסיוניים רבים, כולל בדיקה של פנוטיפ גידול רקמות אפיתל מהונדס החלב ללא תופעות של בלבול גנוטיפ על החיה כולה 3, בזיהוי של בתאי גזע החלב ידי השתלת תאים דילול מוגבל 4,5, קביעת אם גושים hyperplastic להמשיך גידולים החלב 6, כדי להעריך את ההשפעה של חשיפה מוקדמת ההורמון על התנהגות של האפיתל החלב 7,8. בן שלוש בשבוע עכברים מארח מורדמים, ניקה מאופקת על הבמה כירורגי. חתך אמצע sagittal נעשית דרך העור, אך לא את הצפק, המשתרעת חיק אל עצם החזה. קיצוץ אלכסוני נעשות דרך העור מפני חתך באמצע sagittal לרוחב האגן לכיוון רגל. העור הוא התרחק הצפק לחשוף את בלוטת החלב 4 מפשעתי. כרית שומן מנוקה על ידי הסרת רקמות שומן הקדמי כרית אל הצומת לימפה. שברי אפיתל או לתאי האפיתל מושתלים לתוך כרית הנותרים פינו את השומן ואת העכבר סגור.

מאמר זה מדגים את נוהל שפותח על ידי DeOme KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) ואת ההליך חוסך שפותחה על ידי בריל B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) עבור ניקוי משטח 4 מפשעתי שומן החלב של עכבר מתבגרת לקראת השתלה של שברי החלב, לתאי האפיתל החלב, או תאים סרטניים החלב.

מאמר זה מתאר ומשווה בין הליך פינוי כרית השומן שפותח על ידי DeOme KB ואח'.1 לבין הליך השימור שפותח על ידי Brill B ואח'.2, ...

סרטון זה מדגים פרוצדורות לאיסוף אפיתל של בלוטת העלה, פינוי של כרית השומן של בלוטת העלה והשתלת אפיתל אקסוגני כדי לחקור את התפתחות בלוטת העלה בעכברים בני שלושה שבועות; בשלב זה, צמיחתו של העץ האפיתלי של בלוטת העלה מוגבלת לסביבת הפטמה, וכרית השומן נטולת ברובה אפיתל של בלוטת העלה. ככל שהעכבר מבשיל, העץ האפיתלי גדל דרך כרית השומן.עד לשבוע השביעי לחייהן, עץ התעלות האפיתליאליות מתפשט בכל רחבי כרית השומן. אם החלק הקטן של כרית השומן המכיל אפיתל יוסר בשבוע השלישי לחייהן, האפיתל האנדוגני לא יאכלס לעולם את כרית השומן הזיכרון, וכרית השומן תוגדר כנקייה ותישאר נקייה בבגרותה. עם זאת, לאפיתל, לתאי אפיתל או לזיכרון תורם מושתל יש פוטנציאל להרחיב עצי תעלות זיכרון בכל רחבי המאחס הנקי.כרית שומן. ניתן להשתמש בהיסטולוגיה כדי לנטר את התקדמות התפתחות הזיכרון ברקמות מושתלות מבעלי חיים טרנסגניים או חיות ניסוי. שלום, שמי ג'וזף ג'רי, ואני מהמחלקה למדעי הווטרינריה והחיים באוניברסיטת מסצ'וסטס.שלום, שמי קארן דאנפי. אני עובדת במעבדת ג'רי. היום נבצע השתלה של אפיתל השד.אנו משתמשים בנוהל זה כדי לחקור את הבסיס המולקולרי והתאי להיווצרות גידולי שריר הזיכרון ומודל לסרטן השד. אז בואו נתחיל. השלב הראשון של הליך ההשתלה הוא קציר של רקמה אפיתליאלית של שריר הזיכרון מהעכבר התורם.התחילו בשטיפת עכברת נקבה שהורדמה לאחרונה ב-70% ethanol, ללא פגיעה בממברנות של ה-SRUs בחלל הגוף הוונטרלי. בצעו חתך סגיטלי מרכזי דרך העור, המשתרע מהפובsetIs עד לסטרנום. לאחר מכן, בצעו חתך אלכסוני מהחתך הראשוני בפובsetIs לכיוון כל אחת מהרגליים האחוריות.באמצעות פינצטה קמורה, אחזו בממברנות של ה-SRUs. לאחר מכן, באמצעות פינצטה ישרה עם שיניים, אחזו בקצה החתוך של העור וקלפו בזהירות את דופן הגוף מהממברנות של ה-S cs.כדי לחשוף את בלוטת הזיכרון המפשעת הרביעית המחוברת לצדו התחתון של דופן הגוף, יש לאתר את קשרי הלימפה בתוך בלוטת הזיכרון בנקודת המפגש של שלושה כלי דם בולטים בבלוטה; ניתן להרגישם כקשרית דחוסה בתוך כרית השומן. בעזרת קצה של מספרי עיניים, יש לקטום את הרקמה השומנית המקיפה את קשרי הלימפה. לאחר מכן, בעזרת אצבע המורה בצד האפידרמלי של העור, יש להפעיל לחץ כדי להרים את הקשרי הלימפה מתוך כרית השומן ולנתק אותם בתנועת צביטה.באמצעות זוג פינצטות קמורות, השליכו את קשרית הלימפה. כעת, תוך כדי החזקת שולי העור, תפסו את רפידת השומן של בלוטת הע remembered (mammary fat pad) בעזרת הקצה הקמור של זוג פינצטות קמורות וקלפו בהדרגה את רפידת השומן מדופן הגוף. בהתאם לכיוון רפידת השומן לעבר השטח הגבי של העכבר, הסירו את בלוטת הע remembered (mammary gland) כולה כיחידה אחת.הניחו את בלוטת הזיכרון על משטח חיתוך פלסטי סטרילי עם כמות קטנה של מצע, כ-200 microliters, על פני השטח של הבלוטה כדי לשמור עליה לחה. לאחר מכן, קצצו את הבלוטה לחתיכות של מילימטר אחד באמצעות להב תער חדש. חלקו את הבלוטה הקצוצה לארבע מנות.לאחר מכן, בעזרת פינצטה, חלק את התאים בין ארבעה מבחנות קריו (cryo vials) המכילות מדיום הקפאה. הנח את מבחנות הקריו במקפיא תאים מסוג Nalgene עם 250 milliliters של isopropyl alcohol בתא החיצוני. לאחר מכן, הנח את מקפיא התאים בטמפרטורה של minus 70 degrees Celsius למשך 24 שעות.לאחר 24 שעות, העבירו את המבחנות ההקפאה של מקטעי הזיכרון לחנקן נוזלי עד למועד ההשתלה. כל מבחנה קריוגנית מכילה מספיק מקטעים של בלוטת הזיכרון להשתלה במגעי השומן המרוקנים של ארבעה עד שמונה עכברי מאכסן. לאחר אימות עומק ההרדמה של עכבר מאכסן בן שלושה שבועות באמצעות צביטה בבהונות, קבעו את העכבר בחוזקה כאשר צדו הגחוני פונה כלפי מעלה וגפיו פרושות על משטח ניתוח, כך שבטנו תהיה מתוחה.יש להעניק משכך כאבים טרום-ניתוחי, bupivacaine או buprenorphine, בהזרקה תת-עורית. חטא את אזור הניתוח באמצעות אלכוהול ותמיסת קרצוף מבוססת יוד בעזרת פינצטה. תפוס את העור מספר מילימטרים מעל האגן והרם אותו מהבטן.צבטו בזהירות את העור, תוך הבטחה שהחתך הראשוני אינו קרוב מדי לשופכה, שכן מיקום של קליפסי סגירת פצעים עלול להפריע ליכולת ההשתנה של העכבר. לאחר מכן, תוך הקפדה שלא לנקב את קרומי ה-SRUs, בצעו חתך סגיטלי מרכזי דרך העור, המשתרע מהפיובס ועד לעצם החזה (sternum).כעת, מהחתך הראשוני, בצעו חתכים אלכסוניים דרך העור מקו האמצע לרוחב האגן לכיוון כל אחת מהרגליים האחוריות. בעזרת פינצטה מעוקלת, אחזו בעדינות בממברנות ה-S ceros של דופן הגוף הוונטרלית. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה לרקמות כדי לאחוז בשולי העור החתוך ומשכו את דופן הגוף הרחק מממברנות ה-ceros.כדי לחשוף את בלוטת הזיכרון המפשעת הרביעית, זהו את בלוטת הזיכרון הרביעית. זהו את בלוטת הזיכרון החמישית, צרוב את קשרי הפטמה ואת שני העורקים המובילים לקשר. הפרד בין הבלוטות הרביעית והחמישית, ולאחר מכן צרוב את שולי הבלוטה החמישית.בשלב הבא, בעזרת מספריים, גזרו לרוחב כרית השומן, ממש ונטרלית לצומת, כדי להפריד את כרית השומן של בלוטת הזיכרון הרביעית. בעזרת פינצטה קמורה, אחזו בחוזקה בחלק הוונטרלי של כרית השומן ומשכו אותה הרחק מדופן הגוף. מומלץ להניח את הרקמה שהוסרה, כיחידה אחת, בין שתי זכוכיות כיסוי מסומנות ולקבע אותה בקיבוע Carnot.מאוחר יותר ניתן לצבוע את הרקמה, לקבע אותה ולבחון את שולי הגזירה. בעזרת פינצטה, הסר את כל השאריות של בלוטת הזיכרון מסביב לאזור החלק שהוסר מסינני השומן (fat pad). בעל החיים מוכן כעת להשתלת רקמה או תאים.ניתן להשתיל רקמה אפיתליאלית של תורם, טרייה או שהוקפאה בהקפאה מהירה, אל תוך גוש השומן שהורחקה ממנו השומן (cleared fat pad). לחלופין, ניתן להשתיל שורות תאים אפיתליאליים ממורחנים, שורות תאים של גידולים ממורחנים או תאים ראשוניים. לפרטים על הכנת התאים, אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף להשתלת מקטעי אפיתל שהוכנו.סרטון זה מתחיל בהפשרה של מבחנה קריוגנית של אפיתל והעברה של השברים לצלחת פטרי המכילה מצע טרי. כדי לדלל את ה-DMSO, צרו באמצעות מספריים כיס באפיתל של גוש השומן המנוקה של העכבר המקבל. לאחר מכן, בעזרת פינצטה דקה, הניחו פיסה של מילימטר אחד של אפיתל התורס בתוך הכיס.במידת הצורך, החזיקו את הכיס סגור באמצעות פינצטת רקמה והוציאו את פינצטת המחט כך שהרקמה תישאר במקומה. אחזו בשולי העור הנגדיים. החזיקו אותם יחד באמצעות פינצטה.הרם אותם הרחק ממברשמות ה-ceros של חלל הגוף הגחוני וסגור באמצעות סיכות לסגירת פצעים. השתמש בשתי סיכות לסגירת החתך המדיסגיטלי ובסיכה אחת עבור כל חתך אלכסוני. הימנע מחסימה של השופכה במידת הצורך.סגרו את המרווחים בעור בנקודת המפגש של החתכים המיד-סגיטליים והאלכסוניים באמצעות תפר. החזירו את העכבר לכלובו והשאירו את הכלוב תחת מנורת חימום עד להתעוררות העכבר. יש להסיר את סיכות הסגירה של הפצע לאחר שבועיים.השקופיות הבאות מציגות תמונות מייצגות של מה שניתן לצפות למצוא בבלוטת הזיכרון של המארח לאחר ניקוי הרפידה המוזנת והשתלת אפיתל; תמונה זו מראה את אפיתל הזיכרון האנדוגני שהוסר מעכבר בן שלושה שבועות. בהליך ניקוי הבלוטה, שימו לב לשוליים הנקיים בקצה החתך. יש להכין דגימה שלמה (whole mount) כזו לאחר כל הליך כדי להעריך את ניקיון השוליים.תמונה זו מציגה את גוש השומן המנוקה של העכבר שבעה שבועות לאחר הליך הניקוי. שימו לב שגוש השומן כולו נטול ממקרופאגים, אפיתל, המטין ואציני. צביעה של גוש שומן מנוקה שבעה שבועות לאחר הליך הניקוי מדגימה גם כי בבלוטה אין אפיתל.מוצגת דוגמה של דגימה שלמה (whole mount) של פד שומן שעבר בידור (cleared) ואליו הותסב אפיתל זיכרון מתורם מעכבר בן 10 שבועות. שימו לב כי האפיתל שהותסב ייצר עצי תעלות אפיתליאליות תקינים, המטין ואסיני. צביעה של פד שומן שעבר בידור וזיכרון.השתלה של אפיתל בגיל זה חושפת ייצור תקין של צינוריות אפיתליאליות מהאפיתל החיצוני. כאן, צביעה של גוש שומן שעבר בירוח בעזרת hematin ו-asin מראה השתלה אפיתליאלית שהתפתחה לגידול שד. כעת הצגנו בפניכם כיצד לאסוף אפיתל של בלוטת השד ולבצע השתלה של אפיתל שד.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנתק את החיבורים בין בלוטה ארבע וחמש כדי לצרוב את הקשרית ואת הפטמה, ולהסיר את כל השאריות של אפיתל אנדוגני. יש לוודא שלא קיימת אפשרות שרקמה אפיתלית אנדוגנית תצמח לתוך רפידת השומן שהורחקה. בנוסף, מומלץ לבצע בדיקה של כל חלקו של המקטע שהוסר מבלוטת החלב כדי לוודא ששוליים נקיים.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בדו"ח זה, אנחנו מדגימים מערכת לבודד התורם התרבות תאים מבלוטת החלב העכבר, ו orthotopically השתלת תאים אלה בעכברים הנמען לנתח סטרומה: אינטראקציות אפיתל במהלך התפתחות הגידול החלב.

השתלה של תאים סטרומה החלב ותאי קרצינומה של עכברים C57BL/6J

הדמית זמן לשגות משמשת כדי להעריך את ההתנהגות של תאים ראשוניים preneoplastic חלב האפיתל הנגזרים ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סיכון לסרטן שד על מנת לקבוע אם יש קשר בין פרמטרים התנהגותיים ספציפיים ונגעים גנטיים מובחנים.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

מודלים פרה-קליניים המעריכים טיפול אדג'ובנטי למיקוד גרורות לסרטן השד נעדרים. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מודל Murine של novo ריאתי אדמוקרצינומה החלב ריאתי, שבו טיפולים שניתנו הגדרה אדג'ובנטית (כריתה כירורגית לאחר ניתוח) ניתן להעריך את היעילות להשפיע על גרורות בעבר ריאתי seeded.

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של דה נובו גרורות סרטן החלב

פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיהור, quantitating, אפיון שלפוחית ​​תאיים (EVs) / exosomes מ שאינם חסיד / mesenchymal תאים אפיתל החלב ועל השימוש בהם כדי להעביר את בלוטת החלב יוצרי היכולת לתאי אפיתל החלב לומינל. EVS / exosomes נגזר גזע כמו תאי אפיתל החלב יכול להעביר תכונה זו התא לתאים לבלוע EVs / exosomes.

העברת בלוטת החלב ביצירת יכולת בין תאי אפיתל בסל החלב תאים לומיני החלב באמצעות שלפוחיות תאיים / אקסוסומות

עבודה זו מדגימה גישה חדשנית להעריך את התפשטות, הבחנה, ואת היכולת להרכיב פוטנציאל של תאי גזע אנדותל כלי הדם (VESCs) באמצעות השתלת כרית שומן החלב ואחריו הכנת רקמות הר שלם עבור תצפית מיקרוסקופית. א השושלת מעקב אחר אסטרטגיה לחקור את ההתנהגות של VESCs in vivo מוצג גם.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

המטרה של הפרוטוקול הזה היא לתאר את הגישה החדשה מידול סרטן השד מבוסס על הזרקת הפנים של יצור-הבעת אדנווירוס לתוך בלוטות החלב של העכבר. גישה זו מאפשרת גם מניפולציה ייחודית לסוג תא ולעוגב של אירועים אונגניים באופן זמני מבוקר.

דוגמנות סרטן השד באמצעות הזרקת הפנים של המין-אדנווירוס המבטא לתוך בלוטת החלב של העכבר

מאמר זה מתאר שיטת השתלת להשתיל השתל בפטמות האפיתל התאים לתוך משטח שומן לבן של בעלי חיים הנמען. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון את השפעות המארחים ו/או התורמים בהתפתחות האפיתל של הפטמות ומבטלת את הצורך בניקוי מראש, ובכך מרחיב את התועלת שבטכניקה זו.

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

מודלים של קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה ומודלים של עכברים מהונדסים גנטית הניתנים להשתלה מחדשים בנאמנות מחלות אנושיות והם מודלים מועדפים לחקר בסיסי ותרגום של סרטן השד. כאן, שיטה מתוארת להשתלה אורתוטופית שברי גידול השד לתוך כרית השומן הממארי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול ולהעריך את תגובת התרופה.

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

שיטת ההדמיה התוך-ורידית המתוארת כאן משתמשת בדור ההרמוני השני של הקולגן ובפלואורסצנציה אנדוגנית מהקו-פקטור המטבולי NAD(P)H כדי לפלח באופן לא פולשני מיקרו-סביבה של גידול ללא תווית לתוך תאי גידול, סטרומל וכלי דם לצורך ניתוח מעמיק של תמונות תוך-ורידיות 4D.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

כאן, אנו מציגים הליכים כירורגיים מפורטים לכריתת שד אנדוסקופית דו-צדדית חוסך פטמה באמצעות חתך יחיד בבית השחי עם שחזור שד מיידי טרום חזה מבוסס שתל. הליך זה הוא שיטה בטוחה ובת קיימא עבור חולות סרטן השד.

כריתת שד אנדוסקופית דו-צדדית חוסך פטמה באמצעות חתך יחיד בבית השחי עם שחזור שד מיידי טרום חזה מבוסס שתל

המחקר הנוכחי מדווח על פרוטוקול קל יותר, חוסך זמן וחסכוני לבידוד וגידול יעיל של תאי אפיתל חלב אנושיים ראשוניים (HMECs) מכמויות קטנות של רקמת חלב. פרוטוקול זה מתאים לייצור מהיר של HMECs ראשוניים הן ליישומים מעבדתיים והן ליישומים קליניים.

בידוד ותרבית של תאי אפיתל ראשוניים של חלב אנושי

למדו כיצד לקצור אפיתל חלבי, לנקות את כרית השומן החלבית ולהשתיל אפיתל זר כדי לחקור את התפתחות בלוטת החלב בעכברים. שיטה זו מאפשרת לבחון צמיחת עץ האפיתל החלבי ותפקידו בביולוגיה התפתחותית.

החלב להשתלות אפיתל נוהל

גלה סרטונים נוספים