Name: איחזור של ביציות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: למד שיטה לאיחזור ביציות ועוברים ממערכת הרבייה של נקבות Peromyscus. הפרוטוקול מדגים זיהוי מבנים אנטומיים כמו האינפונדיבולום והזרקת מדיה FHM לבידוד תאים לשימוש במחקר גנטי ותעתיקי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני רוצה להודות מייק דיואי ממרכז במלאי Peromyscus הגנטי על הסבלנות שלו, עזרה וידע.

העובר / הביצית אחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות שעתיים לפני שליפה של עוברים / ביציות, KSOM ממוקם 37 º C-CO 2 החממה FHM חייב להיות מופשר מ -20 °. צלחת זכוכית המכיל שלוש בארות רדודות קעור משמש טיפות הבית של KSOM בחממה. כדי למנוע התייבשות, KSOM ואת צלחת ממוקמים במכולה עפעפיים כי יש מים בתחתית. מנגנון זה מונע אידוי ללא שימוש של שמן מינרלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oviducts מן הנקבה מבייצת ממוקמים התקשורת FHM. כדי להבטיח התמצאות infindibulum שלם, קטע קטן של השחלה הוא חתך יחד עם הסעיף oviduct קטן של הרחם. מחט קהה 30 מד משמש לגרש עוברים / ביציות מן oviduct על ידי החדרת מחט לתוך infindibulum בוטה. Infindibulum יש להשתמש כדי לאחזר את העוברים מאז צינורות oviduct קטן מדי עבור מחט לעבור. במקרה infindibulum נהרס, oviduct חייב להיות פרוס או פתוח או עוברים סחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים / ביציות נמצאים בתקשורת FHM ידי התמקדות מיקרוסקופ על טיפות שומן אשר שקעו לתחתית צלחת פטרי. העובר / בידוד הביצית יכולה להיות מושגת על 20x כמו זה מספק שטח צפייה גדול יותר בהגדלה גבוהה. העובר / ביציות נראים כמו טיפות שומן עגול, כי יש טבעת ברור סביבו. Pipetting הפה, בעזרת כוס משך נימי, משמש להעברת עוברים / ביציות כדי KSOM עבור הדגירה ומניפולציה נוספת. </li></ol> נוהל אחזור הביצית הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי FHM ולהכין kSOM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה שעות קודם לכן, kSOM מקום בתוך מכולה ביצה אחזור ומקום בתיבת טיפ עם מים בתחתית, מקום CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מביאים כלובים למעבדה להרוג את הנקבות קציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את oviduct נזהר לחתוך חלק השחלה וחלק של הרחם כדי לוודא שאתה לא כורתים חלק oviduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בתקשורת FHM בצלחת פטרי קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כמה FHM יותר בתקשורת צלחות פטרי לשמש שטיפה. </li></ol> הסמקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט שטיפה (30 מד בוטה) מחובר מחט 1ml עם סוף ספירלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח אחד oviduct בכל פעם, באמצעות מחט, להכניס לתוך משפך נמצא ליד החלק של השחלה השמאלית מחוברת. אם משפך הוא נהרס ולא ניתן להשתמש בו, ואז לקחת שני מלקחיים והחזק קצה אחד של oviduct. עם המלקחיים השני, ללחוץ בעדינות, כמו שפופרת משחת שיניים, כדי להוציא כל העובר של. הערה: פעולה זו תיצור כמות גדולה של בלגן בצלחת פטרי, כמו הרבה רקמות יבוא עם זה, ולכן מומלץ להשתמש בצלחת פטרי שונה לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לראות את העוברים, להתמקד מיקרוסקופ על פיסות שומן לחפש &quot;חתיכת שומן&quot; עגול עם עיגול מסביב זה ברור. הערה: יש העוברים את המראה כמו השומן, כך שהוא עשוי להיות קשה למצוא. עוברים לשקוע לתחתית, כך נראה שם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם מריחות הנרתיק של נקבות הנמען. בשלב זה, הם צריכים להיות pseudopregnant. </li></ol>

במאמר זה, אנחנו מדגימים שליפה של ביציות מן הביוץ המושרה (superovulated) Peromyscus. השימוש superovulation (לעומת מחזור הייחום טבעי) נפוץ בשל המספרים וכתוצאה מכך הרבה יותר. עם זאת, זהירות יש לנקוט בפרשנות התוצאות ניצול כזה ביציות / עוברים, כמו גם בשימוש בהורמונים כדי לגרום הביוץ culturing עשויה להיות השפעה. כאשר הייחום אושרה, הנקבות הן euthenized ו oviducts התאושש יחד עם חלק קטן של השחלה. אזור קטן של השחלה משמש כסמן לגבי מיקומו של infindibulum. Infindibul...

<table><tbody><tr><td>מחט שטיפה</td><td>כלי</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G blunt</td></tr><tr><td>פינצטות (2)</td><td>כלי</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>בעל חיים</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כלי</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>מצע FHM HEPES Buffered Media</td><td>ריאגנט</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>מצע לתרבית עוברי KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL)</td><td>ריאגנט</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת פה</td><td>כלי</td><td></td><td></td><td>משיכה מקפילריות זכוכית וחיבור לצינור גומי</td></tr><tr><td>צלחת להחזקת אוקיציטים</td><td>כלי</td><td></td><td></td><td>מכל זכוכית עם שקעים קעורים</td></tr></tbody></table>

איחזור של ביציות עכבר

Retrieval of Mouse Oocytes

נכון להיום, רק מעט מחקרים דיווחו על מניפולציות מוצלחת של העובר Peromyscus או לביולוגיה של הרבייה. יחד עם מאגר גנטי Peromyscus מרכז (http://stkctr.biol.sc.edu), אנחנו המאפיינת את ההבדלים הבולטים צורך לפתח את המערכת. המטרה העיקרית הייתה לייעל את הביצית / אחזור העובר המוקדם.

פרוטוקול זה ממחיש את הטכניקה עבור ביציות לחילוץ או בשלב מוקדם, עוברים מן oviduct מופרית של עכברים. היכולת לזהות את infindibulum והכנס מחט סוף בוטה לתוך זה הכרחי נכון לבצע את ההליך.

עד כה, רק מספר מצומצם של מחקרים דיווחו על מניפולציות מוצלחות של embryogenesis או של הביולוגיה הרפרודוקטיבית של Peromyscus. יחד עם ה-Peromyscus ...

שמי הוא אמאנדה דלי. אני מהמעבדה של ד"ר פול וורנה באוניברסיטת קליפורניה ארווין. היום אציג בפניכם את הפרוצדורה לשאיבת ביציות.תהליך זה כולל בידוד את ה-videx מהנקבה. לאחר בידוד ה-ovex, נזריק מצע FHM דרך ה-videx, ואז ה-cytes אמורים לצאת מהרחם. עם סיום פעולה זו, נבודד את ה-cytes בתוך המצע ונשתמש בהם לניסויים עתידיים.בנוסף לבידוד תאים, ניתן להשתמש בפרוצדורה זו לבידוד עוברים בנקודות זמן ספציפיות. סיבה אחת לכך שכדאי לצפות בפעולה זו בפורמט של וידאו היא שחלקיה השונים של חסום הביצה עשויים להיות קשים מאוד לזיהוי. בסרטון זה, אצביע על ה-infundibulum, שם תזריקו את מצע ה-FHM.כלי הניתוח שבהם תשתמשו הם שתי מערכות של פינצטות חדות וזוג מספריים חדים. צינורות השחלה שהוצאו מהנקבה יונחו במצע FHM, בתוך צלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר. הביציות יוחלצו באמצעות מחט בעלת קצה קהה של 30 מילימטר המחוברת למזרק של 1 מיליליטר, וה-uc ייוצב באמצעות פינצטה חדה.FHM הוא מצע אחסון המשמש לאיסוף התאים. KSOM הוא המצע המשמש לגידול התאים בתוך האינקובטור במקרה שהם הופרו. לאחר שליפת הביצים והעוברים מהביציות (oviduct), נשתמש בפיפט העברה מזכוכית שנמשך מצינור קפילרי, נחבר אליו צינוריות ונשאב אותם בעזרת פיפט פה לתוך מצע אחסון.משתמשים בכלי זכוכית קעור להחזקת העוברים והביצים. ניתן למקם אותם בכל עיגול קעור כך שיהיו במיקום נפרד, מה שמקל על מציאתם. כלי זה מוצב בתוך המיכל כדי שניתן יהיה להכניסו למדגרה עם CO2 ללא שימוש בשמן.מעל מצע ה-FHM או ה-KSOM, בהתאם לסוג המצע, מוסיפים מים לבסיס, סוגרים את הברז והנוזל נשאר במקומו. נעשה שימוש ב-70% ethanol כדי להבטיח ששערות לא יחדרו פנימה. נבצע חתך קטן באזור הבטן וחתך בחלל הבטן.נגדיל את החתך כדי לחשוף את אזור הבטן. לאחר מכן, כדי לחשוף את הרחם, נזיז את המעיים הצידה, ואז הרחם נמצא למטה. הרחם הוא בצורת Y והם מוציאים בזהירות חלק מהרחם.כאשר היא נגזרת, צינור הביצים נראה כמו ספגטי. אני אנסה לקחת חלק מצינור הביצים. אני אקח את ה-UCT וחלק מהשחלות, העטופות בשומן.הצד השני יטופל כעת. בשלב זה, שוב, נרים את השחלה או את הרחם. נרים כאן את הרחם, ונחתוך מתחת לנקודת ההצמדה שלנו. צינורות ההובלה נמצאים בשלב זה.אני אקח חלק מהשחלה של ה-OV איתנו. לאחר מכן, חלק זה ימוקם במצע גידול. הרחם עדיין במצב של התכווצות.הרחם מורכב משריר חלק, כך שגם כאשר הוא מופרד מהגוף, הנוירונים עדיין פועלים. הרחם מוצג כאן. בעוד שצינור הביצים נראה כמו פסטה והשחלה נמצאת מעליו, צינור הביצים אינו מחובר למעשה לשחלה.בעוד שהצגנו רק חלק מהשחלה בשלב זה, ידי הדומיננטית היא יד ימין, שבה אני מחזיק את המחט בעלת הקצה הבלתי חד (blunt end needle) בקוטר 30 gauge. אני משתמש בה כפינצטה כדי לבודד את ה-in fibula. ברגע שזו תבודד, אדקור את המחט הבלתי חדה לתוך ה-in fibula ואזריק מעט נוזל שיזרום החוצה מהרחם.בידי שמאל אני מחזיק פינצטה חדה. היא משמשת לבידוד ה-in fibula ולהחזקת כל הרכיבים במקומם. ה-am dula היא מבנה מבודד בעל צורת חצוצרה.קצה המחט שלי נמצא בפיבולה, שהחדירה דרך שכבת הרקמה. כדי להבטיח שבידדתי את כל העוברים והביצים, אני נוהג לסחוט את הרחם בדומה לסחיטת שפופרת משחת שיניים. ברגע שמתמקדים בכריות השומן, מחפשים מה שנראה כטיפות שומן סימטריות לחלוטין.יש שם כעת אחד ממש משמאל לאותוו שומן ארוך. זהו ביצית אחת בודדת. לכן, מה שאעשה הוא להשתמש בפיפט, לשאוב את הביצית ולהעביר אותה למצע החזקה נוסף, כדי שנוכל לבודד את הביציות עצמן.היום הראיתי לכם כיצד לבודד תאים ממערכת הרבייה הנקבית. בנוסף, הצגתי בפניכם את המבנים השונים שלוואת הביض (oviduct). בפרט, את האינפונדיבולום (infundibulum), שהוא המבנה היחיד שבו ניתן להזריק את מצע ה-FHM.השתמשתי במחט בכילוג 30. באמצעות טכניקה זו, בידדתי ציטוקיטים ועוברי שהיו נוכחים בדרכי הרבייה של הנקבה. אני יכול להשתמש בהם למחקרי ביטוי גנים או לעבודה טרנסגנית.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

סרטון זה מתאר את הבידוד של ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו. ביציות אנטראליות אלה יכולות לשמש לאפיון נוסף ולמחקרים התפתחותיים.

בידוד ביציות אנטראליות של עכבר: שיטה לבידוד ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

הסרט הזה ואת פרוטוקול נועדו לסייע למידה העברת גרעיני.

העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

למד שיטה לאיחזור ביציות ועוברים ממערכת הרבייה של נקבות Peromyscus. הפרוטוקול מדגים זיהוי מבנים אנטומיים כמו האינפונדיבולום והזרקת מדיה FHM לבידוד תאים לשימוש במחקר גנטי ותעתיקי.

איחזור של ביציות עכבר

גלה סרטונים נוספים