בידוד והעשרה של תאים עכברוש mesenchymal גזע (MSCs) והפרדה של המושבה, סינגל נגזר MSCs
22 במרץ 2010
עכברוש MSCs נותקו מן עצמות הירך לבין tibias והעשירו מכן על ידי מיון התא מגנטי. תאים ממוין אושרו עבור ביטוי של סמני פני השטח על ידי cytometry הזרימה. תאים אלה בתרבית גם בצפיפות משובטים כדי ליצור מושבות אחת ואז מושבות אלה היו מופרדים על ידי שכפול צילינדרים.
תאי גזע מזנכימליים, המקוצרים כ-MSCs, מבודלים מחולדה נקבה מגזע rag dolly בת שש עד שמונה שבועות, ומגודלים בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים עד שהם מגיעים לכ-80% confluence. כדי להעשיר את ה-MSCs, התאים נצבעים עם נוגדנים ראשוניים מצומדים לביוטין, ולאחריהם חרוזי מגנט מצומדים לסטרפטאווידין. תאים מסומנים מופרדים לאחר מכן לשני פראקציות, הפראקציה השלילית והפראקציה החיובית, באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (magnetic activated cell sorting).
לאחר מכן, נעשה שימוש בניתוח פלוו ציטומטרי (flow cytometry) כדי לאשר את הביטוי של סממני שטח. לבסוף, נעשה שימוש בגלילי שיבוט (cloning cylinders) כדי להשיג MSCs שנגזרו מקולוניה בודדת. שלום, אני לי מהמעבדה של כריסטינה צ'אנג במחלקה להנדסה כימית ומדעי החומרים באוניברסיטת מדינת מישיגן.
היום נדגים לכם פרוצדורה לבידוד ולהעשרה של תאי גזע chy, וכן השגת תאים המופקים ממושבה בודדת. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את התנהגויות השגשוג וההבחנה של תאי גזע אדומים. אז בואו נתחיל.
תאי גזע מזנכימליים, או MSCs, יבודדו מחריקת נקבה מסוג spra dolly בת גיל ששה עד שמונה שבועות. כדי להתחיל בהליך זה, חיתכו את עצמות הפמור (ירך) והטיביה (שוקה) מהגפיים האחוריות של בעל החיים לאחר ההמתה. הסירו את העור והשרירים, הניחו את עצמות הפמור והטיביה המבודדות ב-70% isopropanol למשך מספר שניות, ולאחר מכן העבירו אותן ל-one X-D-P-B-S.
יש לבצע את השלבים הבאים במכסה בטיחות ביולוגית. ראשית, העבירו את ה-femur וה-tibia לצלחת של 10 סנטימטר המכילה DMEM. לאחר מכן, תוך כדי החזקת כל עצם באמצעות פינצטה, גזרו את שני הקצוות בעזרת מספריים.
חברו מחט במידה 22 למזרק של 3 mL ומלאו אותו ב-DMEM. הכניסו את המחט לאחד הקצוות הפתוחים של העצם ושטפו את מח העצם אל תוך מבחנה של 50 mL. חזרו על הפעולה פעמיים עד שלוש פעמים עבור כל עצם, עד לקבלת כל מח העצם.
הרחף מחדש את התאים, ולאחר מכן העבר את תרחיף התאים דרך מסנן תאים של 70 micrometer כדי להסיר שרידי עצם וצבירי דם. סבב את התאים ב-200 GS בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון באמצעות שאיבה, הרחף מחדש את התאים ב-25 milliliters של מדיום MSC seed.
10 milliliters של תרחיף תאים לכל אחת משתי צלחות תרבית בנפח 10 centimeter. דגרו את צלחות התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך שבוע עד שבועיים. כאשר ה-MSCs של החולדה שבודדו קודם לכן מגיעים לfluence של כ-80%, שאבו את המצע והוסיפו ארבעה עד חמישה milliliters של trypsin EDTA לכל צלחת.
החזירו את הצלחות לאנקובטור והדגירו למשך כחמש דקות. כדי לאפשר את ניתוק התאים, הוסיפו כמות שווה של מצע גידול כדי לנטרל את ה-trypsin. אספו את תרחיפי התאים למבחנה של 15 milliliters וסובבו את התאים ב-200 GS בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius למשך חמש דקות.
כעת נדגים את העשרת תאי MSCs באמצעות שני סמני שטח, CD 54 ו-CD 90. נשתמש ב-BD I magnet, מגנט להפרדת תאים מבית BD Biosciences. התחל בערבוב מחדש (Resuspend) של משקע התאים בבופר לצביעת תאים בריכוז של 20 million cells per milliliter.
בשלב הבא, הוסף נוגדן CD 54 עם ביוטין ונוגדן CD 90 עם ביוטין לתליה התאים וערבב בעדינות. לאחר דגירה בקרח למשך 15 דקות, שטוף את התאים המסומנים בנפח עודף של BD IMAG buffer בריכוז one X. סבב את התאים המסומנים ב-200 GS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הכן את חלקיקי ה-BD imag streptavidin על ידי ערבוב נמרץ במערבל (vortex), ולאחר מכן הוסף 40 microliters של חלקיקים לכל 10 מיליון תאים.
ערבבו היטב את החלקיקים עם התאים המסומנים והדגירו את התאים בטמפרטורה של 6 עד 12 °C למשך 30 דקות. במהלך זמן ההדגרה, סמנו מבחנה בעלת תחתית עגולה לאיסוף הפרקציה החיובית. עם סיום ההדגרה, הגבירו את נפח הסימון ל-20 מיליון תאים למילליליטר.
בעזרת בופר מגנטי אחד של Expedia I. העבירו את התאים המסומנים למבחנת איסוף של הפракציה החיובית. הניחו את מבחנת הפракציה החיובית על המגנט של ה-BDI והשאירו אותה שם למשך שש דקות.
לאחר מכן, כאשר מבחנת הפракציה החיובית עדיין על מגנט ה-BDI, הסירו את הנוזל העליון באמצעות פיפטת פסטורי מזכוכית. לאחר מכן, הסירו את מבחנת הפракציה החיובית ממגנט ה-BDI והניחו אותה על קרח. הוסיפו 1 mL של בופר XBDI mag קרר ושחזרו את התאים על ידי ערבוב עדין.
החזירו את המבחנה למגנט ה-BDI והשאירו אותה שם למשך שתי עד ארבע דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות פיפטת פסטור זכוכית חדשה. חזרו על פעולת השטיפה כפי שתואר בעבר.
פעם אחת נוספת. לבסוף, הסירו את הנוזל העליון באמצעות פיפטת פסטור מזכוכית חדשה. לאחר מכן, הוציאו את המבחנה ממעמד המגנט BDI.
שעו את התאים ב-1 ml של מצע תרבית והעבירו את ת сусפנזיית התאים למבחנה של 50 ml המכילה 25 ml מצע. בקבוק ריבוע של 175 cm² לתחזוקת התאים, וצלחת של 10 cm עבור ציטומטריית זרימה.
כדי להתחיל את הפרוצדורה להפרדת MSCs המופקים ממושבה בודדת, זרעו תאים בריכוז של כ-50 עד 100 תאים לכל צלחת של 10 סנטימטר, והדגירו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך שבוע עד שבועיים. במהלך תקופה זו של שבוע עד שבועיים, בחנו מושבות מבודדות היטב באמצעות מיקרוסקופ הפוך. לאחר שהמושבות הגיעו לגודל מספיק של יותר מ-100 תאים בכל מושבה, סמנו את המושבות בעזרת טוש קבוע בתחתית הצלחת.
בעת בחירת מושבה לסימון, ודאו שאין מושבות סמוכות מסביבה. שאבו את המצע ושטפו את הצלחת פעם אחת עם one X-D-P-B-S באמצעות פינצטה. קחו צילינדר שיבוט סטרילי והניחו אותו בעדינות סביב המושבה המסומנת.
חזור על פעולה זו עד שמעל כל מושבה מסומנת מונח גליל שיבוט. הוסף 100 µL של tripsin EDTA לכל גליל שיבוט והחזר את הצלחת לאינקובטור. לאחר חמש דקות, בדוק את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לראות אם הם הופכים עגולים.
כאשר התאים התנתקו, הוסף כמות שווה של מצע גידול כדי לנטרל את ה-trypsin. ערבב את תרחיף התאים באמצעות מיקרופיפט של 200 microliter והעבר את תרחיף התאים לצלחית של 60 millimeter המכילה שלושה milliliters של מצע גידול שחומם מראש. סמן את הצלחיות והחזר אותן לאינקובטור לאחר בידודם כעת תאים נצמדים לפלסטיק.
תאי MSCs צריכים להיות גלויים ביום למחרת לאחר הזריעה. ככל שהתאים ממשיכים להתרבות, תאים בהסנכרון (confluence) צריכים להיראות כמו התאים המוצגים בתמונת ניגודיות הפאזה זו, שבהם רובם בעלי מראה כישפתי או דמויי כוכב; תהליך הטיפוח מתאים כאשר התאים מגיעים לכ-80% הסנכרון.
לאחר הטרפסיניזציה (trypsinization), התאים שהסתלקו צריכים להיראות עגולים והם צריכים לצוף במצע. לאחר הגברת ריכוז ה-MSCs באמצעות מיון תאים מגנטי, מבוצעת ציטומטריית זרימה כדי לאמת את הביטוי של סמני השטח. אם ההעשרה הייתה יעילה, התאים צריכים להראות צביעה חיובית לסמני ה-MSC, CD 54 ו-CD 90, אך צביעה שלילית לסמן ה-HSC, CD 45; בקרת איזוטיפ של IgG2A ו-IgG1 משמשות כביקורות שליליות.
כאשר תאים מושבים בצפיפות קלונלית נאותה, מושבות צריכות לצמוח מתאים בודדים כפי שמוצג בדוגמה זו. ניתן להשתמש בצילינדרי שיבוט (Cloning cylinders) כדי להפריד את המושבות, ותאים שנגזרו מהמושבות ניתנים לתרבית בנפרד. בשני הדוגמאות הללו, התאים שנגזרו ממושבה אחת הם בעלי מראה סיבוב (spin alike), בעוד שהתאים שנגזרו ממושבה אחרת הם עגולים.
הראינו לכם כיצד לבודד ולהעשיר תאי גזע אקראיים ונפוצים, וכן כיצד להשיג תאים שמקורם במושבה בודדת. במהלך הליך זה, חשוב לזכור להסיר קרישי דם ושאריות עצם במהלך הבידוד. השתמשו בכמות האופטימלית של נוגדנים במהלך ההעשרה, וסמנו היטב מושבות שבודדו כראוי במהלך הפרדת המושבות.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בבידוד והעשרה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מעצמות הירך והשוק של חולדה. התאים ממוינים באמצעות מיון תאים מגנטי, והביטוי של סממני שטח מאושש באמצעות ציטומטריה של זרימה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות למיון תאים
- ציטומטריה של זרימה
רקע
- לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית.
- בידוד והעשרה של MSCs הם קריטיים לשימוש יעיל בהם במחקר.
- מיון תאים מגנטי הוא טכניקה נפוצה להעשרת תאים.
- ציטומטריית זרימה מאפשרת ניתוח של סמני שטח של תאים.
מטרת המחקר
- בידוד תאי גזע מזנכימליים (MSCs) מרקמות עצם של חולדה.
- העשרה של התאים המבודדים באמצעות שיטות מיון מגנטי.
- אישור זהותם של תאי ה-MSCs באמצעות אנליזה של סממני שטח.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד של MSCs מעצמות הירך והשוק של חולדות.
- העשרה של MSCs באמצעות נוגדים מצומדים לביוטין וחרוזי מגנט.
- הפרדה של תאים לfracctions חיוביים ושליליים באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS).
- ניתוח בציטומטריה של זרימה לאישור ביטוי של סממני שטח.
- תרבית של תאים בצפיפות קלונאלית ליצירת מושבות בודדות.
- שימוש בצילינדרי שיבוט להפרדת מושבות.
תוצאות עיקריות
- בידוד והעשרה מוצלחים של MSCs מרקמות עצם של חולדה.
- אישור ביטוי של סממני שטח באמצעות ציטומטריה עם זרימה.
- הקמת תרביות של MSCs שנגזרו ממושבה בודדת לצורך מחקרים המשכיים.
מסקנות
- השיטות שיושמו מבצעות בידוד והעשרה יעילים של MSCs.
- ציטומטריית זרימה היא טכניקה מהימנה לאישור זהות התאים.
- ניתן להשתמש ב-MSCs המופקים ממושבה בודדת למגוון יישומים במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד והעשרה של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) ממוח העצם של חולדה מאפשרים תיקוף של מטרות בשלב מוקדם במחקר בתחום הרפואה הרגנרטיבית. הפרוטוקול תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד של תתי-אוכלוסיות הומוגניות באמצעות מיון מגנטי והפרדה קלונאלית, ובכך משפר את רמת הוודאות החזויה ביישומים המשכיים. תהליך עבודה זה מציב את אפיון ה-MSCs כשלב הניתן לשחזור בקווי גילוי פרה-קליניים לפיתוח טיפולים תאיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ההטרוגניות של MSC על ידי בידוד של תתי-אוכלוסיות שמקורן במושבה בודדת לצורך הערכה תפקודית.
- ערך תפעולי: מספק שיטה סטנדרטית להעשרה של MSCs באמצעות סממני שטח CD54 ו-CD90, ובכך מפחית את השונות במודלים ניסיוניים.
- ערך חיזוי: תומך באישור המטרה על ידי תיקוף זהות ה-MSC באמצעות ציטומטריה של זרימה והדרה של HSC (שלילי ל-CD45), מה שמחזק סריקה מבוססת היפותזה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ייצור של אוכלוסיות MSC מטוהרות המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות ולסריקה רפרודוקבילית של תרכובות.
- ערך תפעולי: הפרדה מגנטית מספקת תוצרים כמותיים הניתנים להרחבה (scalable), התואמים לתהליכי עבודה בעוצמה גבוהה (high-throughput).
- מוכנות לבדיקה: צילינדרי שיבוט מאפשרים הפרדה של וריאנטים פנוטיפיים לצורך הערכה מקבילה של תכונות פרוליפרציה ודיפרנציאציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תאי גזע מזנכימליים (MSCs) המופקים ממושבה בודדת מספקים מערכות רלוונטיות למחלה להערכת פוטנציאלה של דיפרנציאציה ספציפית לשושלת.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: תת-אוכלוסיות איזוגניות מפחיתות רעשים בהערכות בטיחות ויעילות פרה-קליניות.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר תיעדוף של שיבוטי MSCs בעלי מולטיפוטנציאליות רצויה לצורך פיתוח נוסף.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ותומכת במעבר מבידוד MSC לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) באמצעות אפיון קלונאלי ותיקוף פונקציונלי.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקת היפותזות על תת-אוכלוסיות של MSC על ידי סילוק זיהום המטופויטי והעשרה של תאי CD54/CD90+.
- סריקה: מייצרת תרביות MSC נסמכות וסטנדרטיות המוכנות לסריקת ספריות תרכובות ומבחני תגובה למינון.
- אנליטיקה: ציטומטריה של זרימה מספקת נתונים כמותיים של ביטוי סמנים, המאפשרים השוואה אובייקטיבית בין אוכלוסיות מועשרות לאוכלוסיות נאיביות.
- מחקר תרגומי: הרחבה קלונאלית תומכת במחקרי התאמה של סמנים ביולוגיים על ידי קישור הפנוטיפ של פני השטח לתפוקה הפונקציונלית.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול מבסס פלטפורמה רב-פעמית להכנת MSC, הישימה במגוון פרויקטים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד תת-אוכלוסיות מוגדרות של MSC עם פנוטיפים של פני השטח שעברו תיקוף.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות שלבי מיון מגנטי ובידוד קלונלי סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקה של מחקר (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים של העשרה של MSC בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר הקצאת משאבים מותאמת סיכונים על בסיס עוצמה קלונלית ויכולת התמיינות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי גזע, מיון תאים מגנטי וציטומטריית זרימה.
- תלוי בגישה למערכת BD IMag, נוגדנים ביוטיניליים וגלילי שיבוט.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להעשרה עקבית של MSC ולצפיפות זריעה קלונלית.
- התאמה למינים אחרים או למקורות רקמה אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של העיכול האנזימטי ושל פאנלים של נוגדנים.
- מגבלות מעשיות כוללות את התמדת ההטרוגניות של ה-MSC למרות ההעשרה, ושונות ביעילות היווצרות המושבות.
