ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris

הפרוטוקול הבא מתאר ביטוי חלבון באמצעות שמרים של סוג methyl atrophic yeast opus. מוצגים הכנת תאי שמרים אלקטרו-קומפטנטים והטרנספורמציה של הווקטור עם הגן הרצוי לתוך PPAs, ולאחר מכן שלב של טיהור DNA של השמרים כדי לבדוק את האינטגרציה התקינה של הגן הרצוי אל תוך הגנום של השמרים. לבסוף, נבצע את ביטוי החלבון הרקומביננטי.

שלום, אני מריה מהמעבדה של Steven Hallam במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. אני מרכוס, גם אני ממעבדה של Helm. היום נראה לכם הליך לביטוי חלבונים רקומביננטיים בשמרורי TRO PQ.Past stories.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור חלבונים ממיקרואורגניזמים שלא בודדו, כאשר ה-DNA הסביבתי כבר הופק, נשמר וספריות מטא-גנומיות הוכנו. אם כן, בואו נתחיל. ביטוי של חלבונים רקומביננטיים בשמרים המטרופיים *Pichia pastoris* דורש שיבוט של הגן המבוקש בתוך וקטור ביטוי של *P. pastoris* ובמסגרת קריאה נכונה.

בניסוי שלנו, אנו משתמשים בווקטור PPIC Z alpha A. ווקטור זה מכיל את הפרומוטור AO X one לביטוי מבוקר בקפידה של הגן המבוקש בהשראת מתנול, את אות ההפרשה alpha factor להפרשת החלבון הרקומביננטי, את גן העמידות zaas לברירה הן ב-e coli והן ב-pic, ופפטיד ב-C terminal המכיל אפיתופ acemic ותג פולי-היסטדין לזיהוי וניקוי של החלבון הרקומביננטי. לפני הטרנספורמציה, לינאריזו את הווקטור המכיל את הגן המבוקש על ידי עיכול רסטריקציה. אנו משתמשים באנזים PME one, אך ניתן להשתמש באתרים של אנזימי רסטריקציה אחרים, כל עוד המקטע המוכנס אינו מכיל את אותו אתר רסטריקציה.

כדי להשיג כמות מספקת של DNA וקטורי ליניארי, הכינו שלוש עד ארבע תגובות עיכול של אנזימי הגבלה בנפח 50 µL במבחנות נפרדות. לאחר העיכול, שלבו את כל התמיסות ורכזו את המבנה שלכם. באמצעות יחידת סינון צנטריפוגית AmCon ויחידת סינון צנטריפוגית MicroCon, תזדקקו ל-5 עד 20 µg של DNA ליניארי ב-5 עד 10 µL של מים סטריליים לצורך טרנספורמציה לתוך PPA dous. כדי להכין תאי PPA dous בעלי כשירות לאלקטרופורזה (electrocompetent), בצעו מריחה של תאים על צלחת A-Y-P-D-S ללא SN ארבעה ימים לפני הטרנספורמציה המתוכננת; גדלו אותם בטמפרטורה של 30 °C למשך יום עד יומיים, או עד להיווצרות מושבות בודדות יומיים לפני הטרנספורמציה.

גדלו חמישה milliliters של ה-PPA או הזן במצע YPD בתוך מבחנת Falcon של 50 milliliters בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה. מקמו את מבחנת ה-Falcon בתוך בקבוק כדי לקבע אותה בשייקר יום אחד לפני הטרנספורמציה. השתמשו ב-0.25 milliliters מהתרבית של הלילה כדי להנחית (inoculate) 500 milliliters של מצע YPD טרי בבקבוק של שני liters.

גדלו שוב במהלך הלילה בשייקר בטמפרטורה של 30 degrees Celsius עד להגעה ל-OD 600 של 1.3 עד 1.5. ביום הטרנספורמציה, הכינו מראש קרח, מים סטריליים קרים וסורביטול בריכוז one molar. סנטריפוגו את התאים ב-1500 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius.

לאחר הצנטריפוגה, נשעה את המשקע ב-500 milliliters של מים סטריליים קרים בטמפרטורת קרח. בהתאם לנפח מבחנות הצנטריפוגה, ייתכן שיהיה עליכם לחלק את הנפח לשתי מבחנות נפרדות או לבצע מספר סבבים. בצעו צנטריפוגה לתאים פעם נוספת ושעהו את המשקע ב-250 milliliters של מים סטריליים קרים בטמפרטורת קרח.

בהתאם לנפח מבחנות הצנטריפוגה, ניתן לאחד את משקעי התאים הנפרדים למבחנה אחת. לאחר הצנטריפוגה, יש לסבב שוב את המשקע (resuspend). העבר את התאים שהוסבבו למבחנת פלקון של 50 מיליליטר ב-20 מיליליטר של סורביטול 1 molar קר בקרח, ובצע צנטריפוגה.

לאחר סבב סנטריפוגציה סופי, השביו את המשקע במיליליטר אחד של סורביטול 1 M קר בקרח, לנפח סופי של כ-1.5 מיליליטר. את התאים שהושבו בנבובות מיקרו-סנטריפוגה אחסנו בקרח או בטמפרטורה של 4 °C עד לשימושם לצורך טרנספורמציה. לפני ביצוע טרנספורמציה של המבנה הלינארי המרוכז לתוך תאי PPA, הכינו את הריאגנטים והמכשירים הבאים.

מלאו מבחנה למיקרו-צנטריפוגה ב-1 mL של sorbitol בריכוז 1 M והניחו אותה על קרח. הניחו קטרת electroporation של 0.2 cm על קרח.

סמנו מבחנה מזכוכית סטרילית בנפח 15 milliliter והכינו פיפטת זכוכית סטרילית. העבירו 80 microliters של התאים electro competent שהוכנו קודם לכן לכלי electroporation בנפח 0.2 centimeter המקומם על קרח.

הוסיפו את תמיסת ה-DNA מהפלסמה לתאים וערבבו על ידי הזזת קצה הפ pipette מצד לצד. בכלי האלקטרופורציה. דגרו את הכלי עם התאים על קרח למשך חמש דקות.

בשלב הבא, נגב את החלק החיצוני של ה-cuvette בעזרת טישיו ובצע פולס לתאים בהתאם לפרמטרים עבור שמרים מנבטים (budding yeast), כפי שהומלץ על ידי יצרן מכשיר האלקטרופורציה שברשותך. בהדגמה זו נעשה שימוש ב-BioRad gene Pulser עם התנאים הבאים: מתח טעינה של 1500 volts, קיבוליות של 25 micro farads והתנגדות של 200 ohms מיד לאחר הפולס.

הוסיפו מיליליטר אחד של סורביטול 1 molar קר מאוד למבחנה. העבירו את תוכן המבחנה למבחנה סטרילית של 15 מיליליטר באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית. דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 30 °C ללא ניעור למשך 1.5 שעות.

לאחר 1.5 שעות, התאים שעברו אלקטרופורציה מוכנים לזריעה. הוסיפו חמישה עד 10 חרוזי זכוכית סטריליים לכל אחת מארבע צלחות YPTS מסומנות המכילות 100 micrograms per milliliter של Zain. פזרו 250 microliters מהאלקטרופורציה.

ערבבו בכל צלחת ונערערו את הצלחת אופקית כדי לפרוס את התאים באופן שווה. הניחו לצלחות להתייבש למשך 15 דקות ולאחר מכן הסירו את החרוזיים מהאגרו (agro) על ידי היפוך הצלחות. עטפו את הצלחות בפלסטיק שחור כדי למנוע פירוק של ה-Zain הרגיש לאור, והדגירו את הצלחות כשהן הפוכות למשך יומיים עד שלושה ימים ב-30 degrees Celsius עד להיווצרות מושבות.

בחרו 12 מושבות. טהרו אותן על ידי מריחת השיבוטים על צלחות YPDS טריות המכילות 100 µg/mL של zein. כדי להכין תאי PPA לביטוי חלבון, בחרו מושבה בודדת מתוך מושבות ה-pichia המטוהרות והחדירו אותה ל-25 mL של מצע VMGY בבקבוק סטרילי של 250 mL; גדלו בטמפרטורה של 30 °C באינקובטור עם ניעור עד שהתרבית תגיע ל-OD 600 של שניים עד שישה.

כאשר התאים מגיעים ל-OD 600 המתאים, הכין מאגר גליצרול של התאים לאחסון. העבר 800 µL של תרבית התאים למבחנה קריוגנית של 2 mL והוסף 200 µL של גליצרול סטרילי. אחסן את מאגר הגליצרול בטמפרטורה של 80- °C.

בנוסף, העבירו 1.5 milliliters של תרבית התאים למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה. קצרו את התאים על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-1300 GS למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. שמרו את המשקע בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.

תאים אלו ישמשו לטיהור DNA משמרים כדי לנתח את רצועות ה-pichia לאחר PCR עם פריימרים ספציפיים למקטע המוכנס על ג'ל אגרוז, על מנת לאשר שהגן המבוקש השתלב בתוך הגנום של ה-pichia. העבר את שאר תרבית ה-25 milliliter לשפופרת Falcon של 50 milliliter ואסוף את התאים על ידי סנטריפוגציה במהירות של 3000 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שפוך את הנוזל העליון והנח את השפופרת הפוכה על נייר סופג להסרת שאריות מדיום. כדי לשטוף את משקע התאים, השהה אותו מחדש על ידי וורטקס או שאיבה הלוך ושוב ב-20 milliliters של מדיום BMMY, ולאחר מכן בצע סנטריפוגציה.

לאחר שפיכת הנוזל העליון, השהה מחדש את משקע התאים על ידי ערבוב בוורטקס או שאיבה חוזרת בפיפטה עד להגעה ל-OD 600 של 1.0 בתווך BMMY, שהוא התווך להשראת הביטוי. העבר את התרבית לבקבוק עם מחיצות (baffled flask) בנפח של ליטר אחד וכסה את הבקבוק בביקר של 200 מיליליטר.

אנו ממליצים מאוד להשתמש בבקבוקים עם מחיצות (baffled flasks) כיוון שהם מחדירים יותר חמצן לתרבית. עבור ביטוי חלבון יעיל במהלך השראת מתנול, יש להדגיר את הבקבוק באינקובטור כדי להמשיך את הגדילה ב-30 °C. חשוב שהטמפרטורה לא תעלה על 30 °C במקרה שהטמפרטורה באינקובטור שלכם תנודתית.

הגדירו את הטמפרטורה ל-28 °C. הוסיפו מתנול טהור שעקר לריכוז סופי של 0.5% methanol מדי 24 שעות כדי לשמר את האינדוקציה. בנקודות זמן מסוימות לאחר תחילת הביטוי, העבירו 1 mL מהתרבית לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL וסובבו בצנטריפוגה ב-1300 Gs למשך 2.5 דקות. בטמפרטורת החדר, העבירו את העלייה (supernatant) לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נפרדת של 1.5 mL.

יש לאחסן את העלייה והמשקעים התאיים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. הדגימות מנקודות זמן שונות ינותחו כדי לקבוע את פרק הזמן האופטימלי לביטוי חלבונים לאחר השראת הביטוי. כעת נציג מספר תוצאות מייצגות של ביטוי מוצלח של חלבונים רקומביננטיים תוך שימוש ב-PIA Pastis כמערכת מאכסנת.

תמונת Western blot זו מציגה ארבעה חלבונים שהובעו לאחר 24 שעות של ביטוי. הנוגדן ששימש עבור ה-immuno blotting היה נוגדן acemic HRP. הנתיב השני הוא ביקורת שלילית ונטען בו על-נוזל (supernatant) מתאים של תאים שאינם מבטאים חלבון רקומביננטי מכיוון שהם עברו טרנספורמציה עם וקטור האב.

הרגע הדגמנו כיצד לבטא חלבונים רקומביננטיים באמצעות המארח האיקריוטי PQ.Plus. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא כי הרצף של הקונסטרוקט שלכם נסקר כדי לאשר שגן העניין שובט והמסגרת שלו נכונה, וכי כל הצלחות הפטריות והריאגנטים מוכנים לפני התחלת העבודה. כמו כן, חשוב להכין כמות מספקת של פלסמיד ליניארי כדי להשיג מספר גבוה של טרנספורמנטים לפני ביטוי החלבון באמצעות אינדוקציה במתנול. ודאו שאתם שוטפים היטב את משקע התאים כדי להסיר שאריות של גליצרול שעלולות לעכב את ביטוי החלבון.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים.