הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח
2 בנובמבר 2010
נוהל זבול Xenopus ביציות לפי שיטת העברת המארח.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשיג עוברים בשלבי התפתחות שנגזרו מאתרי OO שתומננו בתרבית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד אתרי oo מתרומה של נקבה אחת ותמניפם בתרבית לפי הרצוי. השלב השני של ההליך הוא גירוי של תאים אלו להבשלה באמצעות פרוגסטרון, והזרקת גונדוטורופין לנקבות עמקי פוטנציאליות כדי לעורר השכבת ביצים.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא צביעת התאים התורמים בצבעים חיוניים והכנת נקבה שתשמש כמארחת. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא העברה כירורגית של התאים התורמים לחלל הגוף של המארחת, וכעבור מספר שעות שאיבה והפריה של הביציות שהועברו. בסופו של דבר מתקבלים עוברים המתחלקים באופן נורמלי, שנגזרו מהתורם שעבר מניפולציה ניסויית.
ניתן להשיג ולנתח Cytes בדיוק כמו עוברים רגילים. שלום, אני דאג יוסטון מאוניברסיטת איווה. היום אנחנו בקורס Xap ב-Cold Spring Harbor כדי להראות לכם כיצד לבצע את הליך העברת המאכסן.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את תפקידם של תוצרי גנים אימהיים ולקבוע את תפקידם בהתפתחות מוקדמת של zap. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הניתוח, וודאו ששטח הניתוח חומא ושהמדיה הטריה והכלים הסטריליים מוכנים.
אחזו במחט תפירה בעזרת תומך המחט בכיוון הרצוי. הניחו צפרדע נקבה מורדמת על גבה על מגבת ניתוח לחה. בעזרת מספרי איריס קטנים, בצעו חתך של one centimeter בעור בחלק התחתון של הבטן, לצד קו האמצע.
אין לחתוך אל תוך שריר הבטן. השתמשו בפינצטה כדי להרים את שכבת השריר ואת הפסציה הלבנה שמסביבה. השתמשו במספרי איריס כדי לבצע חיתוך מהיר אחד בקו ישר דרך השריר.
הרחב את החתך לסנטימטר אחד כדי לחשוף את השחלה. השתמש בפינצטה כדי לתפוס את השחלה ולמשוך החוצה אונה אחת. השתמש במספריים כדי לגזור את האונה בגובה דופן הגוף.
הניחו את הרקמה בצלחת בעלת קוטר 90 מילימטר המכילה מצע גידול לאוציטות או OCM, והעריכו מיד את איכות השחלה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. ניתן להסיר מספר מעטפות (follicles) באמצעות פינצטה. אם האוציטות מוצקות ובעלות גודל וצבע אחידים, הסירו את הכמות הרצויה של רקמת השחלה מהצפרדע והניחו אותה בצלחת פטרי בעלת קוטר 90 מילימטר עם OCM.
סגרו את החתך. הכניסו את המחט מספר מילימטרים לצד החתך, תוך וידוא מעבר דרך השריר והפסציה כאחד. השתמשו בפינסטה כדי להכוויח את המחט, והקפידו לא למשוך את קצה התפר עד הסוף.
סגרו את הפצע באמצעות תפריר פשוט בשיטה קטועה (simple interrupted) וקשרי ריבוע של מנתחים. הטכניקה מתוארת בפירוט בטקסט הנלווה. חזרו על התפירה בשכבת העור.
שטפו את הנקבה במים דאיוניים והניחו אותה בדלי התאוששות מלא במים קרירים. מיד לאחר סיום הניתוח, השתמשו במספריים כדי לחלק את השחלה. חתכו את האונות הבודדות, השטיחו אותן וחתכו אותן לחתיכות ריבועיות של שני סנטימטרים.
שטפו עם מדיום נקי והשתמשו בפינצטה. העבירו חמשה עד שישה חלקים לצלח חדש של 90 מילימטר עם OCM כדי לבודד תאים בודדים. התחילו בהעברה של אחד החלקים לצלח קטן של מדיום והביאו אותו למיקרוסקופ דיסקציה.
השתמשו בפינצטת שעונים כדי להוציא ידנית שלושה עד חמישה oocytes. תפסו את שכבת הרקמה המחברת הסובבת oocyte בשלב שש בוגר קרוב למקור באמצעות זוג פינצטות שני. תפסו את השחלה הסמוכה ל-oocyte באמצעות זוג הפינצטות הראשון.
משכו קלות מעל האוציט כדי לקרוע את שכבת הזקיק. הוציאו בעדינות את התא מהרקמה באופן מוצלח. לתאים ללא זקיק (Defoliated cytes) אין כלי דם נראים והם רכים יותר מאשר תאים עם זקיקים שלמים.
השתמשו בפיפט עם פקק צמר שעבר הרמאה באש כדי להעביר קבוצות של 100 עד 150 ציטות לצלוחי תרבית של 60 מילימטר המכילים שמונה מיליליטר של OCM. אחסנו את האוציטים בצלוחים בטמפרטורה של 18 degrees Celsius. כעת ניתן לבצע מיקרו-הזרקה לאוציטים, לפי הרצון, של antisense oligonucleotides או mRNAs בהתאם למספר פרוטוקולים, ולאחר מכן לגדלם ב-OCM בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 18 degrees Celsius.
השתמשו בציטות (oocytes) להעברה בתוך 96 שעות מהבידוד, בערב שלפני ביצוע ההעברה. דגרו את הציטות הדרושות עם פרוגסטרון להבשלתן, על ידי הוספה של 16 µL של פרוגסטרון בריכוז 1 mM למדיום המכיל את הציטות, כדי להגיע לריכוז סופי של 2 µM. דגרו למשך 10 עד 12 שעות בטמפרטורה של 18 °C באותו ערב, והזריקו לשלוש עד חמש נקבות 1000 units של הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי (human chorionic gonadotropin) לכל צפרדע כדי לעודד את השכבת הביצים.
השאירו את הנקבות בטמפרטורת החדר או ב-18 degrees Celsius למשך לילה לפני בוקר ההעברה. בדקו תחת מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לוודא שהתאים שהושרבנו עברו הבשלה. הוסיפו את הצבעים החיוניים וסובבו במהירות גבוהה מ-10, 000 Gs למשך חמש דקות.
כדי להפחית את הרקע משאריות, הוסיפו 80 µL של הצבע החיוני המתאים לכל קבוצת ניסוי של ציותים. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על מכשיר נדנוד (rocker). העבירו את הביצים הצבועות לצלחת של 90 מ"מ עם o cm טרי וסובבו קלות כדי לשטוף אותן.
הכינו פיפט להעברת התאים. השתמשו בעיפרון יהלום כדי לחרוץ את הפיפט כ-2 cm מתחת לחלק המצר, ושברו אותו בצורה נקייה. פעולה זו תיצור פיפט עם פתח בקוטר של 1.5 mm, הגדול מספיק כדי להכיל ביצית אחת.
שייף את הקצה עד שהשוליים יהיו חלקים, מבלי לסגור את הקצה. השתלה של ביציות. יש לבצע את הניתוח במהירות המרבית האפשרית.
בצעו חתך כפי שנעשה קודם לכן בנקבה מורדמת המטילה ביצים באיכות טובה. חתך זה צריך להיות באורך המינימלי הנדרש כדי להכניס בדיוק את פיית ההעברה. שאבו באמצעות פיפטה פחות מסנטימטר אחד.
סובבו את צלחית הביציות הניסיוניות כדי לרכז אותן במרכז הצלחית. השתמשו בפיפט הפסטור שהוכן כדי לשאוב כמה שיותר ביציות. אפשרו לביציות לשקוע לקצה הפיפט כדי לצמצם את כמות הנוזל המועברת לצפרדע.
השתמשו בפינצטה כדי לתפוס ולהרים מקפל אחד של שריר ופסציה. הכניסו את קצה הפ pipette לתוך החתך ואפשרו לאוציטים לטפטף באיטיות אל תוך חלל הגוף. חזרו על הפעולה עד שכל האוציטים הועברו.
אל תשחרר את שכבת השריר כדי למנוע מהוואוציטים להישפך מהחתך. השתמש בפינצטה כדי לתפוס את שני צדי החתך ולהקרב אותם זה לזה, ובכך אפשר לתאים לשקוע אל תו חלל הגוף. התחל בתפירה של שכבת השריר והפשיה כפי שנעשה קודם, תוך הקפדה על שמירת מתיחה כלפי מעלה עד לקשירת הקשר הראשון.
תפרו את העור. שטפו את הנקבה במים דה-יוניים ואפשרו לה להתאושש כפי שנעשה קודם לכן. הנקבה אמורה להתחיל להטיל ביצים כרגיל לאחר הניתוח, החל משעתיים עד שלוש שעות לאחר הפרוצדורה.
אספו את הביצים באמצעות לחיצה רגילה בכל חצי שעה, עד שהנקבה תפסיק להטיל, אל תוך כלי עם ביצים שנאספו. הוסיפו ארבעה מיליליטרים של תרחיף של זרע שנאסף טרי ב-one XMMR והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. שטפו את הביצים באופן נרחב בטמפרטורת החדר.
דגום אחד של XMMR הודגרה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפעלה ושבירה. ניתן להשתמש בציסטאין בכל שלב כדי להסיר את מעטפת הג'לי. לאחר מכן ניתן למיין את העוברים שהועברו לצלחונות נפרדים בהתאם לצבעם, ולגדלם כעוברים רגילים.
בדרך כלל, יותר משני שלישים מהביצים המועברות יפעילו את עצמן תוך דקות מההפריה, ויפגינו התכווצות קורטיקלית חזקה בקוטב החייתי. ברוב הניסויים, למעלה ממחצית מהביצים המועברות יעברו את השלב הראשון של ההחלוקה באופן תקין. לעיתים ההחלוקה תהיה מושהית ב-20 דקות בערך ביחס לביצי המארח שבידינו.
30 עד 60% מהעוברים שהועברו יגיעו לשלב הגסטולציה באופן תקין וישרדו מעבר לשלב העצבי. העוברים שהועברו ישמרו על צבע הצבע החיוני לאורך ימים רבים של התפתחות. עוברים שהופקו מאוציטים של ביקורת שלא הוזרקו ייראו תקינים כצפוי.
לעומת זאת, לעוברים שנגזרו מאוציטים שהוזרקו להם beta catenin ואוליגואים אנטי-סנס (antisense oligos), למשל, יהיה מראה מרכזי. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשיג עוברים מאוציטים שעברו מניפולציה בתרבית.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב להתחיל עם ציטות (oocytes) בריאות ובשלות של תורמות, ולהשתמש בנקבות מאכסנות בעלות ביציות באיכות גבוהה. כמו כן, הצלחת השיטה נוטה להיות תלויה במהירות שבה מבודדים את הציטות ומבצעים את הניתוחים. לכן, ייתכן שיידרש תרגול מסוים עד להשגת תוצאות עקביות.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
נוהל זה מפרט את תהליך ההפריה של ציטות (oocytes) של Xenopus באמצעות שיטת העברה למאכסן. התהליך כולל בידוד ציטות מתורמת, גירוי הבשלתן והעברתן למאכסן לצורך הפריה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירוביולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של הרבייה
רקע
- ביצי Xenopus משמשות באופן נפוץ במחקרי התפתחות.
- מניפולציה של תאי ביצית מאפשרת בקרה ניסויית על ההתפתחות העוברית.
- הבנת טכניקות ההפריה חיונית למחקר בביולוגיה התפתחותית.
- שיטת ההעברה למארח מספקת דרך ללימוד של אווציטים שעברו מניפולציה in vivo.
מטרת המחקר
- להשגת עוברים בשלבי התפתחות מביציות שעברו מניפולציה.
- לבחינת ההשפעות של טיפולים ספציפיים על הבשלת הביצית וההפריה.
- לשיפור טכניקות לחקר התפתחות עוברית ב-Xenopus.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ציותים תורמים מנקבת Xenopus.
- מניפולציה של ציותים בתרבית.
- סטימולציה של הבשלה באמצעות פרוגסטרון.
- העברה כירורגית של ציותים לנקבת מאכסנת.
תוצאות עיקריות
- ביציות שהופרו בהצלחה הופקו מהמארחת.
- עוברים התפתחו באופן תקין מביציות התורם שעברו מניפולציה.
- הפרוצדורה הדגימה טכניקות יעילות למחקרים in vivo.
- התוצאות תורמות להבנת תהליכי התפתחות עוברית.
מסקנות
- שיטת ההעברה למארח היא טכניקה יעילה להפריית ציטות של Xenopus.
- גישה זו מאפשרת לחקור ציטות שעברו מניפולציה בסביבה טבעית.
- הממצאים תומכים במחקר נוסף בביולוגיה התפתחותית תוך שימוש במודלים של Xenopus.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
שיטת ההעברה למארח עבור הפריה של ביצי Xenopus מאפשרת מניפולציה וניתוח מדויקים של תפקוד גנים אימהיים בהתפתחות חוליתיים, ובכך היא עוקפת את המגבלות של מודלים גנטיים מסורתיים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית ובתיקוף מטרות על ידי מתן אפשרות להערכה ישירה של הפרעות גנטיות בשלבי embryogenesis מוקדמים. הגמישות והיעילות שלה הופכות אותה לכלי בעל ערך עבור שלבי גילוי במו"פ ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של גנים בעלי השפעה אימהית ומסלולי אותיות בעוברי חולייתנים.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות גניות באמצעות מניפולציה מבוקרת של תאי ביצית וניתוח עוברי עוקב.
- תומך בביטחון חיזוי לגבי מעורבות מסלולים על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה של הפרעות גניות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה להכנת ציותות (oocytes) שעברו תיקוף ומניפולציה לצורך סריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מבטיחה הדירות וסטנדרטיזציה על ידי בקרה על איכות הציותות ועל תנאי המניפולציה.
- מאפשרת הערכה כמותית של תוצרי התפתחות בעקבות התערבויות ספציפיות בגנים או במסלולים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את התוצרים הניסויים למסלולי פיתוח הרלוונטיים למחלה, כגון סיגנלינג של Wnt.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מתן אפשרות לביצוע מחקרים מכניסטיים במערכת של חוליתנים.
- מפחית את הסיכון הביולוגי על ידי הבהרת ההשפעה התפקודית של תוצרי גנים אימהיים לפני קידום מועמדים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי התיקוף של המטרה, ומגשרת בין מניפולציות in vitro לבין ניתוח התפתחותי in vivo בעוברים של Xenopus.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי היתמכנות לשיבוש גנים ממוקד בביציות.
- סריקה: מספק ביציות שעברו מניפולציה ומוכנות לבדיקה לצורך הערכה פנוטיפית אמינה.
- אנליטיקה: מספק מדדי פיתוח כמותיים להשוואה בין תנאי ניסוי לתנאי ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמה למסלולים רלוונטיים למחלה ולדרישות של מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע תהליך עבודה ניתן לשימוש חוזר למחקרי תפקוד גנים מגוונים במספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות מוקדמים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והניתנות להרחבה (scalability) של בדיקות תפקוד גנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לוולידציה תפקודית מהירה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום מטרות עם תפקידים התפתחותיים מוכחים.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות במניפולציה של תאי ביצית, מיקרו-הזרקה וטכניקות של העברה כירורגית.
- דורש גישה למכשור ייעודי לתרבית תאי ביצית, מיקרו-הזרקה ואנליזה של עובריו.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדית בין הצוותים לגבי איכות תאי הביצית וקריטריונים לבחירת המארח.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מטרות גניות שונות או מסלולי איתות בהתאם למטרות הניסוי.
- שיעורי ההצלחה תלויים במיומנות הטכנית ובאיכות החומרים הביולוגיים, כפי שצוין בפרוטוקול.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:54
Introduction
1:15
Surgical Removal of Donor Ovary Tissue
3:02
Culturing and Defolliculating the Donor Oocytes
4:31
Pre-transplantation Preparation of Oocytes and Prospective Host Females
5:55
Oocyte Transplantation
7:12
Recovery of Oocytes and in vitro Fertilization
7:51
Representative Results
8:40
Conclusion
