Name: הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למדו את שיטת העברת המארח להפריית ביציות Xenopus לחקר ביולוגיה התפתחותית. השיטה מאפשרת לחקור השפעות ניסויות על התפתחות עוברית בסביבה טבעית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים חברי הודות המעבדה יוסטון לקריאה ביקורתית של כתב היד. המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM083999) הוענק DWH

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+Embryology%3A+Techniques+and+procedures%22">Experimental Embryology: Techniques and procedures</a>. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של ​​איווה IACUC הוועדה.

העברה מוצלחת תגרום דישון מחשוף נורמלי של 50%&gt; של ביציות (איור 3). בדרך כלל בין 30-60% של ביציות הועבר ישרדו בעבר בשלבים neurula. אנחנו בדרך כלל להעביר 75-150 ביציות לכל קבוצת הניסוי, אשר תניב עוברים מספיק מספר סוגים של ניתוח (באתרו, RT-PCR) וכן לדמיין את הפנוטיפ. השתלת ביציות באופן משמעותי יותר לא נראה להגדיל באופן משמעותי את התשואה. כמו כן, לפחות 30 ביציות לכל קבוצה יש להעביר להבטיח כי לפחות חלק לעשות את זה דרך gastrulation. צבעים חיוניים בדרך כלל אינם משפיעים על העוברים תחת ה...

פתרונות מתכונים: OCM (תרבות בינוני הביצית; שונה מן ויילי et al, 1996). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 70% L-15 של ליבוביץ בינוני (המכיל L-גלוטמין) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA, חלק V) </td><td> (Sigma A-9418-50 גרם) </td></tr><tr><td> 1x פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> התאם את ה-pH 7.6-7.8 עם 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> בצע טרי בחנות שבועי, בשעה 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (פתרון השתנה מארק רינגר;. צוק et al, 1998) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> NaCl 1M </td></tr><tr><td> 20 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 20 מ&quot;מ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> להתאים את ה-pH 7.6-7.8 </td></tr><tr><td> חנות ב -4 ° C </td></tr></tbody></table> הרדמה פתרון <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 גרם / L 3-Aminobenzoic חומצה קראטין אתיל אסתר (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0.7 g / L נתרן ביקרבונט </td></tr><tr><td colspan="2"> מתמוססים במים Amquel שטופלו </td></tr><tr><td colspan="2"> בצע טרי שבועי </td></tr></tbody></table> הפרוגסטרון מניות <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 10 mM הפרוגסטרון (Sigma P-0130) ב 100% אתנול </td></tr><tr><td> מדולל עד 1 מ&quot;מ ב EtOH 100% במניה 500x / עובדים פתרון </td></tr><tr><td> חנות ב -20 ° C </td></tr></tbody></table> צבעים ויטל (שונה מן Heasman et al., 1991) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כחול: 0.1% הנילוס הכחול </td><td> (אולדריץ 121479-5G), </td></tr><tr><td> אדום: אדום ניטרלי 0.25% </td><td> (סיגמה N-6634) </td></tr><tr><td> בראון: 1% ביסמרק בראון </td><td> (Sigma B-2759) </td></tr><tr><td colspan="2"> גרין (80 כחול + 80 μl חום μl), </td></tr><tr><td colspan="2"> במוב (80 μl כחול אדום + 80 μl). </td></tr><tr><td colspan="2"> צבע השישי, אורנג&#39; (80 μl אדום + חום μl 80), יכול לשמש גם אבל לעתים קרובות קשה להבחין בין חום. </td></tr></tbody></table> מניות של כחול, אדום וחום בנויים במים deionized ב 50 צינורות מ&quot;ל, מודגרות במשך 20 דקות עם נדנדה וסובב בצנטריפוגה קליני. Supernatants הם aliquotted לתוך צינורות microfuge ומאוחסנים ב -20 ° C.

הפריה של xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

הלומד את תרומתה של מולקולות בירושה אימהי על התפתחות החולייתנים הראשונים נפגעת לעתים קרובות על ידי הזמן וההוצאות הדרושים כדי ליצור חיות השפעה אימהית מוטנטי. בנוסף, רבים של טכניקות כדי overexpress או לעכב תפקוד הגן באורגניזמים כגון Xenopus ו דג הזברה מצליחים מספיק יעד קריטי מסלולי איתות אימהית, כגון איתות Wnt. ב Xenopus, מניפולציה לתפקד גנים ביציות בתרבית ולאחר מכן זבול אותם ניתן לשפר את הבעיות הללו במידה מסוימת. ביציות הן defolliculated ידני מרקמת השחלה התורם, הזריק או מטופל בתרבות כפי הרצוי, מגורה אז עם פרוגסטרון כדי לזרז הבשלה. לאחר מכן, ביציות הן הציג לתוך חלל הגוף של צפרדע מארח הביוץ הנשי, ואז הם יהיו translocated דרך oviduct של המארח ולרכוש שינויים ומעילים ג&#39;לי הכרחי הפריה. עוברים שהתקבל לאחר מכן ניתן להעלות לבמה הרצוי ניתחו את ההשפעות של כל הפרעות ניסיוני. שיטה זו המארח להעביר כבר יעיל מאוד בחשיפת המנגנונים הבסיסיים של ההתפתחות המוקדמים, ומאפשר מגוון רחב של אפשרויות ניסיוני אינו זמין בכל אורגניזם מודל חוליות אחרים.

נוהל זבול<em&gt; Xenopus ביציות</em&gt; לפי שיטת העברת המארח.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

חקר תרומתן של מולקולות העוברות בירושה מהאם להתפתחות מוקדמת של חולייתנים נתקל לעיתים קרובות במכשולים בשל הזמן וההוצאות הנדרשים כדי...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשיג עוברים מתפתחים שנגזרו מאתרי OO שעברו מניפולציה בתרבית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד אתרי oo מתורמת אחת וביצוע מניפולציות בהם בתרבית לפי הצורך. השלב השני של ההליך הוא גירוי של תאים אלו להבשלה באמצעות פרוגסטרון, והזרקה של גונדוטרופין לנקבות המיועדות להיות מאחסנות כדי לעודד הטלת ביצים.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא צביעת התאים התורמים בצבעי חיוניות והכנת נקבה שתשמש כמארחת. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא העברה כירורגית של התאים התורמים לחלל הגוף של המארחת, וכעבור מספר שעות איסוף והפריה של הביציות שהועברו. בסופו של דבר מתקבלים עוברים המתחלקים באופן נורמלי, המהווים נגזרת של התורם שעבר מניפולציה ניסיונית.ניתן להשיג ולנתח Cytes בדיוק כמו עוברים רגילים. שלום, אני דאג יוסטון מאוניברסיטת איווה. היום אנחנו בקורס Xap ב-Cold Spring Harbor כדי להראות לכם כיצד לבצע את הליך ההעברה למארח.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את תפקידיהם של תוצרי גנים אימהיים ולקבוע את תפקידיהם בהתפתחות מוקדמת של zap. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הניתוח, ודאו שאזור הניתוח חומצה ושהמדיום הטרי והכלים הסטריליים מוכנים.אחזו במחט תפירה בעזרת מחזיק מחטים בכיוון הרצוי. הניחו צפרדע נקבה שהורדמה על גבה על גבי מגבת נייר כירורגית לחה. באמצעות מספרי איריס קטנים, בצעו חתך של סנטימטר אחד בעור בחלק התח

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הביצים של Xenopus laevis שלם, lysed, ו / או מופרדים שימושיים עבור מגוון רחב של ניסויים. פרוטוקול זה מראה כיצד לגרום הנחת ביצה, לאסוף את הביצים dejelly, ולמיין את הביצים כדי להסיר ביצים פגומות.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת...

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

למדו את שיטת העברת המארח להפריית ביציות Xenopus לחקר ביולוגיה התפתחותית. השיטה מאפשרת לחקור השפעות ניסויות על התפתחות עוברית בסביבה טבעית.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

גלה סרטונים נוספים