Name: הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למדו את שיטת העברת המארח להפריית ביציות Xenopus לחקר ביולוגיה התפתחותית. השיטה מאפשרת לחקור השפעות ניסויות על התפתחות עוברית בסביבה טבעית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים חברי הודות המעבדה יוסטון לקריאה ביקורתית של כתב היד. המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (GM083999) הוענק DWH

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+Embryology%3A+Techniques+and+procedures%22">Experimental Embryology: Techniques and procedures</a>. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של ​​איווה IACUC הוועדה.

העברה מוצלחת תגרום דישון מחשוף נורמלי של 50%&gt; של ביציות (איור 3). בדרך כלל בין 30-60% של ביציות הועבר ישרדו בעבר בשלבים neurula. אנחנו בדרך כלל להעביר 75-150 ביציות לכל קבוצת הניסוי, אשר תניב עוברים מספיק מספר סוגים של ניתוח (באתרו, RT-PCR) וכן לדמיין את הפנוטיפ. השתלת ביציות באופן משמעותי יותר לא נראה להגדיל באופן משמעותי את התשואה. כמו כן, לפחות 30 ביציות לכל קבוצה יש להעביר להבטיח כי לפחות חלק לעשות את זה דרך gastrulation. צבעים חיוניים בדרך כלל אינם משפיעים על העוברים תחת ה...

פתרונות מתכונים: OCM (תרבות בינוני הביצית; שונה מן ויילי et al, 1996). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 70% L-15 של ליבוביץ בינוני (המכיל L-גלוטמין) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA, חלק V) </td><td> (Sigma A-9418-50 גרם) </td></tr><tr><td> 1x פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> התאם את ה-pH 7.6-7.8 עם 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> בצע טרי בחנות שבועי, בשעה 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (פתרון השתנה מארק רינגר;. צוק et al, 1998) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> NaCl 1M </td></tr><tr><td> 20 מ&quot;מ KCl </td></tr><tr><td> 20 מ&quot;מ CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> להתאים את ה-pH 7.6-7.8 </td></tr><tr><td> חנות ב -4 ° C </td></tr></tbody></table> הרדמה פתרון <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 גרם / L 3-Aminobenzoic חומצה קראטין אתיל אסתר (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0.7 g / L נתרן ביקרבונט </td></tr><tr><td colspan="2"> מתמוססים במים Amquel שטופלו </td></tr><tr><td colspan="2"> בצע טרי שבועי </td></tr></tbody></table> הפרוגסטרון מניות <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 10 mM הפרוגסטרון (Sigma P-0130) ב 100% אתנול </td></tr><tr><td> מדולל עד 1 מ&quot;מ ב EtOH 100% במניה 500x / עובדים פתרון </td></tr><tr><td> חנות ב -20 ° C </td></tr></tbody></table> צבעים ויטל (שונה מן Heasman et al., 1991) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כחול: 0.1% הנילוס הכחול </td><td> (אולדריץ 121479-5G), </td></tr><tr><td> אדום: אדום ניטרלי 0.25% </td><td> (סיגמה N-6634) </td></tr><tr><td> בראון: 1% ביסמרק בראון </td><td> (Sigma B-2759) </td></tr><tr><td colspan="2"> גרין (80 כחול + 80 μl חום μl), </td></tr><tr><td colspan="2"> במוב (80 μl כחול אדום + 80 μl). </td></tr><tr><td colspan="2"> צבע השישי, אורנג&#39; (80 μl אדום + חום μl 80), יכול לשמש גם אבל לעתים קרובות קשה להבחין בין חום. </td></tr></tbody></table> מניות של כחול, אדום וחום בנויים במים deionized ב 50 צינורות מ&quot;ל, מודגרות במשך 20 דקות עם נדנדה וסובב בצנטריפוגה קליני. Supernatants הם aliquotted לתוך צינורות microfuge ומאוחסנים ב -20 ° C.

הפריה של xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

הלומד את תרומתה של מולקולות בירושה אימהי על התפתחות החולייתנים הראשונים נפגעת לעתים קרובות על ידי הזמן וההוצאות הדרושים כדי ליצור חיות השפעה אימהית מוטנטי. בנוסף, רבים של טכניקות כדי overexpress או לעכב תפקוד הגן באורגניזמים כגון Xenopus ו דג הזברה מצליחים מספיק יעד קריטי מסלולי איתות אימהית, כגון איתות Wnt. ב Xenopus, מניפולציה לתפקד גנים ביציות בתרבית ולאחר מכן זבול אותם ניתן לשפר את הבעיות הללו במידה מסוימת. ביציות הן defolliculated ידני מרקמת השחלה התורם, הזריק או מטופל בתרבות כפי הרצוי, מגורה אז עם פרוגסטרון כדי לזרז הבשלה. לאחר מכן, ביציות הן הציג לתוך חלל הגוף של צפרדע מארח הביוץ הנשי, ואז הם יהיו translocated דרך oviduct של המארח ולרכוש שינויים ומעילים ג&#39;לי הכרחי הפריה. עוברים שהתקבל לאחר מכן ניתן להעלות לבמה הרצוי ניתחו את ההשפעות של כל הפרעות ניסיוני. שיטה זו המארח להעביר כבר יעיל מאוד בחשיפת המנגנונים הבסיסיים של ההתפתחות המוקדמים, ומאפשר מגוון רחב של אפשרויות ניסיוני אינו זמין בכל אורגניזם מודל חוליות אחרים.

נוהל זבול<em&gt; Xenopus ביציות</em&gt; לפי שיטת העברת המארח.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

חקר תרומתן של מולקולות העוברות בירושה מהאם להתפתחות מוקדמת של חולייתנים נתקל לעיתים קרובות במכשולים בשל הזמן וההוצאות הנדרשים כדי...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשיג עוברים מתפתחים שנגזרו מאתרי OO שעברו מניפולציה בתרבית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד אתרי oo מתורמת אחת וביצוע מניפולציות בהם בתרבית לפי הצורך. השלב השני של ההליך הוא גירוי של תאים אלו להבשלה באמצעות פרוגסטרון, והזרקה של גונדוטרופין לנקבות המיועדות להיות מאחסנות כדי לעודד הטלת ביצים.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא צביעת התאים התורמים בצבעי חיוניות והכנת נקבה שתשמש כמארחת. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא העברה כירורגית של התאים התורמים לחלל הגוף של המארחת, וכעבור מספר שעות איסוף והפריה של הביציות שהועברו. בסופו של דבר מתקבלים עוברים המתחלקים באופן נורמלי, המהווים נגזרת של התורם שעבר מניפולציה ניסיונית.ניתן להשיג ולנתח Cytes בדיוק כמו עוברים רגילים. שלום, אני דאג יוסטון מאוניברסיטת איווה. היום אנחנו בקורס Xap ב-Cold Spring Harbor כדי להראות לכם כיצד לבצע את הליך ההעברה למארח.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את תפקידיהם של תוצרי גנים אימהיים ולקבוע את תפקידיהם בהתפתחות מוקדמת של zap. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הניתוח, ודאו שאזור הניתוח חומצה ושהמדיום הטרי והכלים הסטריליים מוכנים.אחזו במחט תפירה בעזרת מחזיק מחטים בכיוון הרצוי. הניחו צפרדע נקבה שהורדמה על גבה על גבי מגבת נייר כירורגית לחה. באמצעות מספרי איריס קטנים, בצעו חתך של סנטימטר אחד בעור בחלק התחתון של הבטן, לצד קו האמצע.אין לחתוך אל תוך שריר הבטן. השתמשו בפינצטה כדי להרים את שכבת השריר ואת הפסציה (רקמת חיבור) הלבנה שמסביבה. השתמשו במספרי איריס כדי לבצע חתך בודד ומהיר ישירות מטה דרך השריר.הרחיבו את החתך לסנטימטר אחד כדי לחשוף את השחלה. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את השחלה ולמשוך החוצה אונה אחת. השתמשו במספריים כדי לגזור את האונה בגובה דופן הגוף.הניחו את הרקמה בצלחת של 90 מילימטר המכילה תווך גידול לביציות (oocyte culture medium או OCM) והעריכו מיד את איכות השחלה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. ניתן להסיר מספר ביציות בעזרת פינצטה. אם הביציות מוצקות ובעלות גודל וצבע אחידים, הסירו את כמות רקמת השחלה הרצויה מהצפרדע והניחו אותה בצלחת פטרי של 90 מילימטר עם OCM.סגרו את החתך. הכניסו את המחט מספר מילימטרים לטרלית לחתך, תוך וידוא מעבר דרך השריר והפסציה. השתמשו בפינצטה כדי להניע את המחט, תוך הקפדה לא למשוך את קצה התפר עד הסוף.סגרו את הפצע בתפרים פשוטים נפרדים (simple interrupted) ובקשרי כירורג (surgeons square knots). הטכניקה מתוארת בפירוט בטקסט המצורף. חזרו על תהליך התפירה בשכבת העור.שטפו את הנקבה במים דה-יוניים והניחו אותה בדלי התאוששות מלא במים קרירים. מיד עם סיום הניתוח, השתמשו במספריים כדי לחלק את השחלה לתת-חלקים. חתכו את האונות הבודדות, השטיחו אותן וחתכו אותן לחתיכות ריבועיות של שני סנטימטרים.שטפו במדיום נקי והשתמשו בפינצטה. העבירו חמישה עד שישה חלקים לצלחת נקייה של OCM בקוטר 90 מילימטר כדי לבודד תאים בודדים. התחילו בהעברתה של אחת החתיכות לצלחת קטנה של מדיום והביאו אותה למיקרוסקופ דיסקציה.השתמשו בפינצטה של שעונים כדי להוציא ידנית בין 3 ל-500 אוציטים. אחזו בשכבת רקמת החיבור המקיפה אוציט בשלב שש בוגר ליד המלאי באמצעות זוג פינצטות שני. אחזו בשחלה הסמוכה לאוציט באמצעות זוג הפינצטות הראשון.משכו קלות מעל לתבצית כדי לקרוע את שכבת הזקיק. הוציאו בעדינות את התבצית מהרקמה באופן מוצלח. תבציות ללא זקיק (defoliated) אינן בעלות כלי דם נראים והן גמישות יותר מתבציות עם זקיקים שלמים.השתמשו בפיפט עם פקק כותנה שעבר חיליטה באש להעברת קבוצות של 100 עד 150 ציטות לצלחוני תרבית של 60 מילימטר המכילים שמונה מיליליטר של OCM. אחסנו את האוציטים בצלחוניהם בטמפרטורה של 18 degrees Celsius. כעת ניתן לבצע מיקרו-הזרקה לאוציטים, לפי הרצון, של antisense oligonucleotides או mRNAs על פי מגוון פרוטוקולים, ולאחר מכן לגדלם ב-OCM בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 18 degrees Celsius.השתמשו בביציות להעברה בתוך 96 שעות מהבידוד, בערב שלפני ביצוע ההעברה. דגרו את הביציות הדרושות עם פרוגסטרון להבשלתן על ידי הוספת 16 µL של פרוגסטרון בריכוז 1 mM למדיום המכיל את הביציות, כדי להגיע לריכוז סופי של 2 µM. דגרו למשך 10 עד 12 שעות בטמפרטורה של 18 °C באותו ערב, והזריקו לשלוש עד חמש נקבות 1000 units של human chorionic gonadotropin לכל צפרדע כדי להשרות הטלת ביצים.השאירו את הנקבות בטמפרטורת החדר או ב-18 °C למשך לילה בבוקר ההעברה. בדקו תחת מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לוודא שהציטים המגודלים עברו הבשלה. חממו את הצבעים החיוניים וסובבו במהירות של יותר מ-10,000 G למשך חמש דקות.כדי להפחית את הרקע שנוצר משאריות, הוסף 80 µl של צבע חיוני מתאים לכל קבוצת ניסוי של ציותים. הדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על רוקר. העבר את הביצים הצבועות לצלחת של 90 מילימטר עם o cm טרי וסבב קלות כדי לשטוף אותן.הכינו פיפטה לשימוש בהעברת התאים. השתמשו בעיפרון יהלום כדי לחרוץ את הפיפטה כ-2 cm מתחת לחלק המצר, ושברו אותה באופן נקי. פעולה זו אמורה ליצור פיפטה עם פתח בקוטר 1.5 mm, הגדול מספיק כדי להכיל ביצית אחת.שייף את הקצה עד שהשוליים יהיו חלקים, מבלי לסגור את פתח הקצה. השתלת אואוציט. יש לבצע את הניתוח במהירות המקסימלית האפשרית.בצעו חתך כפי שנעשה קודם לכן בנקבה שהורדמה ומטילה ביצים באיכות טובה. חתך זה צריך להיות באורך המינימלי הנדרש כדי להכניס בדיוק את פיית ההעברה. שאבו באמצעות פיפטה פחות מסנטימטר אחד.סובב את הצלחת עם הביציות הניסיוניות כדי לרכז אותן במרכז הצלחת. השתמש בפיפט פסטור המוכן כדי לשאוב כמה שיותר ביציות. אפשר לביציות לשקוע לקצה הפיפט כדי למזער את כמות הנוזל המועברת לצפרדע.השתמשו בפינצטה כדי לתפוס ולהרים מקפל אחד של שריר ופסציה. הכניסו את קצה הפיפטה לתוך החתך והנחיתו את ה-oocytes לטפטף לאט אל תוך חלל הגוף. חזרו על התהליך עד להעברת כל ה-oocytes.אין לשחרר את שכבת השריר כדי למנוע מהאוציטים להישפך החוצה מהחתך. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את שני צדי החתך ולהקריב אותם זה לזה, כך שהציטים ישקעו אל תוך חלל הגוף. התחילו בתפירת שכבת השריר והפשיה כפי שנעשה קודם לכן, תוך הקפדה על שמירת מתיחה כלפי מעלה עד לקשירת הקשר הראשון.תפרו את העור. שטפו את הצפרדע במים דה-יוניים ואפשרו לה להתאושש כפי שנעשה קודם לכן. הצפרדע אמורה להתחיל להטיל ביצים באופן רגיל לאחר הניתוח, החל משעתיים עד שלוש שעות לאחר הסיום.אספו את הביצים באמצעות לחיצה רגילה מדי חצי שעה, עד שהנקבה תפסיק להטיל, אל תוך צלחת של ביצים שנאספו. הוסיפו ארבעה מיליליטרים של תרחיף של זרע שנאסף טרי ב-one XMMR והדגירו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. הצפו ושטפו את הביצים באופן נרחב בטמפרטורת החדר.דגש ראשון: יש להדגיר את ה-XMMR בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפעלה ובקיעה. ניתן להשתמש בציסטאין בכל שלב כדי להסיר את מעטפת הג'לי. ניתן לאחר מכן למיין את העוברים שהועברו לצלחונות נפרדים בהתאם לצבעם, ולגדלם כעוברים רגילים.בדרך כלל, יותר משני שלישים מהביצים שהועברו יופעלו תוך דקות ספורות מההפריה ויפגינו התכווצות קורטיקלית חזקה בקוטב החייתי. ברוב הניסויים, יותר ממחצית מהביצים שהועברו יעברו את השסון הראשון באופן תקין. לעיתים השסון יעקב בכ-20 דקות ביחס לביצי המארח בביצועינו.30 עד 60% מהעוברים המועברים ממשיכים לגסטוליה באופן תקין וישרדו מעבר לשלב העצבי. העוברים המועברים ישמרו על צבע הצבע החיוני במשך ימים רבים של התפתחות. עוברים שנגזרים מביצי ביקורת שלא הוזרקו ייראו נורמליים כצפוי.לעומת זאת, לעוברים שהופקו מאוציטות שהוזרקו להן beta catenin ואוליגו-נוגדי-חוש (antisense oligos), למשל, יהיה מראה ריכוזי (centralized). הרגע הצגנו בפניכם כיצד להפיק עוברים מאוציטות שעברו מניפולציה בתרבית.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להתחיל עם אוקיציטים של תורמים בריאים ובוגרים, ולהשתמש בנקבות מאכסנות בעלות ביציים באיכות גבוהה. כמו כן, הצלחת השיטה נוטה להיות תלויה במהירות שבה מבודדים את האוקיציטים ומבצעים את הניתוחים. לכן, ייתכן שיידרש תרגול מסוים עד לקבלת תוצאות עקביות.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הביצים של Xenopus laevis שלם, lysed, ו / או מופרדים שימושיים עבור מגוון רחב של ניסויים. פרוטוקול זה מראה כיצד לגרום הנחת ביצה, לאסוף את הביצים dejelly, ולמיין את הביצים כדי להסיר ביצים פגומות.

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה להפקת...

הפקה של טראנסגנטי Xenopus laevis על ידי שילוב אנזימים מתווכת הגבלת והשתלות גרעיני

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

טכניקה להשתלה "אקסטרים Anterior דומיין" רקמות פנים בין Xenopus laevis עובר כבר מפותחת. רקמה ניתן להעביר מהרקע ביטוי גנים אחת לאחרת, ומאפשרת הלימוד של דרישות מקומיות לפיתוח craniofacial ולאיתות אינטראקציות בין אזורי פנים.

השתלת פנים ב<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; עוברים

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

למדו את שיטת העברת המארח להפריית ביציות Xenopus לחקר ביולוגיה התפתחותית. השיטה מאפשרת לחקור השפעות ניסויות על התפתחות עוברית בסביבה טבעית.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

גלה סרטונים נוספים