הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח
2 בנובמבר 2010
נוהל זבול Xenopus ביציות לפי שיטת העברת המארח.
המטרה הכללית של הליך זה היא להשיג עוברים מתפתחים שנגזרו מאתרי OO שעברו מניפולציה בתרבית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד אתרי oo מתורמת אחת וביצוע מניפולציות בהם בתרבית לפי הצורך. השלב השני של ההליך הוא גירוי של תאים אלו להבשלה באמצעות פרוגסטרון, והזרקה של גונדוטרופין לנקבות המיועדות להיות מאחסנות כדי לעודד הטלת ביצים.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא צביעת התאים התורמים בצבעי חיוניות והכנת נקבה שתשמש כמארחת. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא העברה כירורגית של התאים התורמים לחלל הגוף של המארחת, וכעבור מספר שעות איסוף והפריה של הביציות שהועברו. בסופו של דבר מתקבלים עוברים המתחלקים באופן נורמלי, המהווים נגזרת של התורם שעבר מניפולציה ניסיונית.
ניתן להשיג ולנתח Cytes בדיוק כמו עוברים רגילים. שלום, אני דאג יוסטון מאוניברסיטת איווה. היום אנחנו בקורס Xap ב-Cold Spring Harbor כדי להראות לכם כיצד לבצע את הליך ההעברה למארח.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את תפקידיהם של תוצרי גנים אימהיים ולקבוע את תפקידיהם בהתפתחות מוקדמת של zap. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הניתוח, ודאו שאזור הניתוח חומצה ושהמדיום הטרי והכלים הסטריליים מוכנים.
אחזו במחט תפירה בעזרת מחזיק מחטים בכיוון הרצוי. הניחו צפרדע נקבה שהורדמה על גבה על גבי מגבת נייר כירורגית לחה. באמצעות מספרי איריס קטנים, בצעו חתך של סנטימטר אחד בעור בחלק התחתון של הבטן, לצד קו האמצע.
אין לחתוך אל תוך שריר הבטן. השתמשו בפינצטה כדי להרים את שכבת השריר ואת הפסציה (רקמת חיבור) הלבנה שמסביבה. השתמשו במספרי איריס כדי לבצע חתך בודד ומהיר ישירות מטה דרך השריר.
הרחיבו את החתך לסנטימטר אחד כדי לחשוף את השחלה. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את השחלה ולמשוך החוצה אונה אחת. השתמשו במספריים כדי לגזור את האונה בגובה דופן הגוף.
הניחו את הרקמה בצלחת של 90 מילימטר המכילה תווך גידול לביציות (oocyte culture medium או OCM) והעריכו מיד את איכות השחלה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. ניתן להסיר מספר ביציות בעזרת פינצטה. אם הביציות מוצקות ובעלות גודל וצבע אחידים, הסירו את כמות רקמת השחלה הרצויה מהצפרדע והניחו אותה בצלחת פטרי של 90 מילימטר עם OCM.
סגרו את החתך. הכניסו את המחט מספר מילימטרים לטרלית לחתך, תוך וידוא מעבר דרך השריר והפסציה. השתמשו בפינצטה כדי להניע את המחט, תוך הקפדה לא למשוך את קצה התפר עד הסוף.
סגרו את הפצע בתפרים פשוטים נפרדים (simple interrupted) ובקשרי כירורג (surgeons square knots). הטכניקה מתוארת בפירוט בטקסט המצורף. חזרו על תהליך התפירה בשכבת העור.
שטפו את הנקבה במים דה-יוניים והניחו אותה בדלי התאוששות מלא במים קרירים. מיד עם סיום הניתוח, השתמשו במספריים כדי לחלק את השחלה לתת-חלקים. חתכו את האונות הבודדות, השטיחו אותן וחתכו אותן לחתיכות ריבועיות של שני סנטימטרים.
שטפו במדיום נקי והשתמשו בפינצטה. העבירו חמישה עד שישה חלקים לצלחת נקייה של OCM בקוטר 90 מילימטר כדי לבודד תאים בודדים. התחילו בהעברתה של אחת החתיכות לצלחת קטנה של מדיום והביאו אותה למיקרוסקופ דיסקציה.
השתמשו בפינצטה של שעונים כדי להוציא ידנית בין 3 ל-500 אוציטים. אחזו בשכבת רקמת החיבור המקיפה אוציט בשלב שש בוגר ליד המלאי באמצעות זוג פינצטות שני. אחזו בשחלה הסמוכה לאוציט באמצעות זוג הפינצטות הראשון.
משכו קלות מעל לתבצית כדי לקרוע את שכבת הזקיק. הוציאו בעדינות את התבצית מהרקמה באופן מוצלח. תבציות ללא זקיק (defoliated) אינן בעלות כלי דם נראים והן גמישות יותר מתבציות עם זקיקים שלמים.
השתמשו בפיפט עם פקק כותנה שעבר חיליטה באש להעברת קבוצות של 100 עד 150 ציטות לצלחוני תרבית של 60 מילימטר המכילים שמונה מיליליטר של OCM. אחסנו את האוציטים בצלחוניהם בטמפרטורה של 18 degrees Celsius. כעת ניתן לבצע מיקרו-הזרקה לאוציטים, לפי הרצון, של antisense oligonucleotides או mRNAs על פי מגוון פרוטוקולים, ולאחר מכן לגדלם ב-OCM בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 18 degrees Celsius.
השתמשו בביציות להעברה בתוך 96 שעות מהבידוד, בערב שלפני ביצוע ההעברה. דגרו את הביציות הדרושות עם פרוגסטרון להבשלתן על ידי הוספת 16 µL של פרוגסטרון בריכוז 1 mM למדיום המכיל את הביציות, כדי להגיע לריכוז סופי של 2 µM. דגרו למשך 10 עד 12 שעות בטמפרטורה של 18 °C באותו ערב, והזריקו לשלוש עד חמש נקבות 1000 units של human chorionic gonadotropin לכל צפרדע כדי להשרות הטלת ביצים.
השאירו את הנקבות בטמפרטורת החדר או ב-18 °C למשך לילה בבוקר ההעברה. בדקו תחת מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לוודא שהציטים המגודלים עברו הבשלה. חממו את הצבעים החיוניים וסובבו במהירות של יותר מ-10,000 G למשך חמש דקות.
כדי להפחית את הרקע שנוצר משאריות, הוסף 80 µl של צבע חיוני מתאים לכל קבוצת ניסוי של ציותים. הדגר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על רוקר. העבר את הביצים הצבועות לצלחת של 90 מילימטר עם o cm טרי וסבב קלות כדי לשטוף אותן.
הכינו פיפטה לשימוש בהעברת התאים. השתמשו בעיפרון יהלום כדי לחרוץ את הפיפטה כ-2 cm מתחת לחלק המצר, ושברו אותה באופן נקי. פעולה זו אמורה ליצור פיפטה עם פתח בקוטר 1.5 mm, הגדול מספיק כדי להכיל ביצית אחת.
שייף את הקצה עד שהשוליים יהיו חלקים, מבלי לסגור את פתח הקצה. השתלת אואוציט. יש לבצע את הניתוח במהירות המקסימלית האפשרית.
בצעו חתך כפי שנעשה קודם לכן בנקבה שהורדמה ומטילה ביצים באיכות טובה. חתך זה צריך להיות באורך המינימלי הנדרש כדי להכניס בדיוק את פיית ההעברה. שאבו באמצעות פיפטה פחות מסנטימטר אחד.
סובב את הצלחת עם הביציות הניסיוניות כדי לרכז אותן במרכז הצלחת. השתמש בפיפט פסטור המוכן כדי לשאוב כמה שיותר ביציות. אפשר לביציות לשקוע לקצה הפיפט כדי למזער את כמות הנוזל המועברת לצפרדע.
השתמשו בפינצטה כדי לתפוס ולהרים מקפל אחד של שריר ופסציה. הכניסו את קצה הפיפטה לתוך החתך והנחיתו את ה-oocytes לטפטף לאט אל תוך חלל הגוף. חזרו על התהליך עד להעברת כל ה-oocytes.
אין לשחרר את שכבת השריר כדי למנוע מהאוציטים להישפך החוצה מהחתך. השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את שני צדי החתך ולהקריב אותם זה לזה, כך שהציטים ישקעו אל תוך חלל הגוף. התחילו בתפירת שכבת השריר והפשיה כפי שנעשה קודם לכן, תוך הקפדה על שמירת מתיחה כלפי מעלה עד לקשירת הקשר הראשון.
תפרו את העור. שטפו את הצפרדע במים דה-יוניים ואפשרו לה להתאושש כפי שנעשה קודם לכן. הצפרדע אמורה להתחיל להטיל ביצים באופן רגיל לאחר הניתוח, החל משעתיים עד שלוש שעות לאחר הסיום.
אספו את הביצים באמצעות לחיצה רגילה מדי חצי שעה, עד שהנקבה תפסיק להטיל, אל תוך צלחת של ביצים שנאספו. הוסיפו ארבעה מיליליטרים של תרחיף של זרע שנאסף טרי ב-one XMMR והדגירו בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. הצפו ושטפו את הביצים באופן נרחב בטמפרטורת החדר.
דגש ראשון: יש להדגיר את ה-XMMR בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפעלה ובקיעה. ניתן להשתמש בציסטאין בכל שלב כדי להסיר את מעטפת הג'לי. ניתן לאחר מכן למיין את העוברים שהועברו לצלחונות נפרדים בהתאם לצבעם, ולגדלם כעוברים רגילים.
בדרך כלל, יותר משני שלישים מהביצים שהועברו יופעלו תוך דקות ספורות מההפריה ויפגינו התכווצות קורטיקלית חזקה בקוטב החייתי. ברוב הניסויים, יותר ממחצית מהביצים שהועברו יעברו את השסון הראשון באופן תקין. לעיתים השסון יעקב בכ-20 דקות ביחס לביצי המארח בביצועינו.
30 עד 60% מהעוברים המועברים ממשיכים לגסטוליה באופן תקין וישרדו מעבר לשלב העצבי. העוברים המועברים ישמרו על צבע הצבע החיוני במשך ימים רבים של התפתחות. עוברים שנגזרים מביצי ביקורת שלא הוזרקו ייראו נורמליים כצפוי.
לעומת זאת, לעוברים שהופקו מאוציטות שהוזרקו להן beta catenin ואוליגו-נוגדי-חוש (antisense oligos), למשל, יהיה מראה ריכוזי (centralized). הרגע הצגנו בפניכם כיצד להפיק עוברים מאוציטות שעברו מניפולציה בתרבית.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להתחיל עם אוקיציטים של תורמים בריאים ובוגרים, ולהשתמש בנקבות מאכסנות בעלות ביציים באיכות גבוהה. כמו כן, הצלחת השיטה נוטה להיות תלויה במהירות שבה מבודדים את האוקיציטים ומבצעים את הניתוחים. לכן, ייתכן שיידרש תרגול מסוים עד לקבלת תוצאות עקביות.
זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
נוהל זה מפרט את תהליך ההפריה של ציטות (oocytes) של Xenopus באמצעות שיטת העברה למאכסן. התהליך כולל בידוד ציטות מתורמת, גירוי הבשלתן והעברתן למאכסן לצורך הפריה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירוביולוגיה
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של הרבייה
רקע
- ביצי Xenopus משמשות באופן נפוץ במחקרי התפתחות.
- מניפולציה של תאי ביצית מאפשרת בקרה ניסויית על ההתפתחות העוברית.
- הבנת טכניקות ההפריה חיונית למחקר בביולוגיה התפתחותית.
- שיטת ההעברה למארח מספקת דרך ללימוד של אווציטים שעברו מניפולציה in vivo.
מטרת המחקר
- להשגת עוברים בשלבי התפתחות מביציות שעברו מניפולציה.
- לבחינת ההשפעות של טיפולים ספציפיים על הבשלת הביצית וההפריה.
- לשיפור טכניקות לחקר התפתחות עוברית ב-Xenopus.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ציותים תורמים מנקבת Xenopus.
- מניפולציה של ציותים בתרבית.
- סטימולציה של הבשלה באמצעות פרוגסטרון.
- העברה כירורגית של ציותים לנקבת מאכסנת.
תוצאות עיקריות
- ביציות שהופרו בהצלחה הופקו מהמארחת.
- עוברים התפתחו באופן תקין מביציות התורם שעברו מניפולציה.
- הפרוצדורה הדגימה טכניקות יעילות למחקרים in vivo.
- התוצאות תורמות להבנת תהליכי התפתחות עוברית.
מסקנות
- שיטת ההעברה למארח היא טכניקה יעילה להפריית ציטות של Xenopus.
- גישה זו מאפשרת לחקור ציטות שעברו מניפולציה בסביבה טבעית.
- הממצאים תומכים במחקר נוסף בביולוגיה התפתחותית תוך שימוש במודלים של Xenopus.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
שיטת ההעברה למארח עבור הפריה של ביצי Xenopus מאפשרת מניפולציה וניתוח מדויקים של תפקוד גנים אימהיים בהתפתחות חוליתיים, ובכך היא עוקפת את המגבלות של מודלים גנטיים מסורתיים. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית ובתיקוף מטרות על ידי מתן אפשרות להערכה ישירה של הפרעות גנטיות בשלבי embryogenesis מוקדמים. הגמישות והיעילות שלה הופכות אותה לכלי בעל ערך עבור שלבי גילוי במו"פ ומסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של גנים בעלי השפעה אימהית ומסלולי אותיות בעוברי חולייתנים.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות גניות באמצעות מניפולציה מבוקרת של תאי ביצית וניתוח עוברי עוקב.
- תומך בביטחון חיזוי לגבי מעורבות מסלולים על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה של הפרעות גניות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה להכנת ציותות (oocytes) שעברו תיקוף ומניפולציה לצורך סריקה פנוטיפית בהמשך התהליך.
- מבטיחה הדירות וסטנדרטיזציה על ידי בקרה על איכות הציותות ועל תנאי המניפולציה.
- מאפשרת הערכה כמותית של תוצרי התפתחות בעקבות התערבויות ספציפיות בגנים או במסלולים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את התוצרים הניסויים למסלולי פיתוח הרלוונטיים למחלה, כגון סיגנלינג של Wnt.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מתן אפשרות לביצוע מחקרים מכניסטיים במערכת של חוליתנים.
- מפחית את הסיכון הביולוגי על ידי הבהרת ההשפעה התפקודית של תוצרי גנים אימהיים לפני קידום מועמדים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי התיקוף של המטרה, ומגשרת בין מניפולציות in vitro לבין ניתוח התפתחותי in vivo בעוברים של Xenopus.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי היתמכנות לשיבוש גנים ממוקד בביציות.
- סריקה: מספק ביציות שעברו מניפולציה ומוכנות לבדיקה לצורך הערכה פנוטיפית אמינה.
- אנליטיקה: מספק מדדי פיתוח כמותיים להשוואה בין תנאי ניסוי לתנאי ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמה למסלולים רלוונטיים למחלה ולדרישות של מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע תהליך עבודה ניתן לשימוש חוזר למחקרי תפקוד גנים מגוונים במספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי התפתחות מוקדמים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והניתנות להרחבה (scalability) של בדיקות תפקוד גנים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לוולידציה תפקודית מהירה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום מטרות עם תפקידים התפתחותיים מוכחים.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות במניפולציה של תאי ביצית, מיקרו-הזרקה וטכניקות של העברה כירורגית.
- דורש גישה למכשור ייעודי לתרבית תאי ביצית, מיקרו-הזרקה ואנליזה של עובריו.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדית בין הצוותים לגבי איכות תאי הביצית וקריטריונים לבחירת המארח.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מטרות גניות שונות או מסלולי איתות בהתאם למטרות הניסוי.
- שיעורי ההצלחה תלויים במיומנות הטכנית ובאיכות החומרים הביולוגיים, כפי שצוין בפרוטוקול.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:54
Introduction
1:15
Surgical Removal of Donor Ovary Tissue
3:02
Culturing and Defolliculating the Donor Oocytes
4:31
Pre-transplantation Preparation of Oocytes and Prospective Host Females
5:55
Oocyte Transplantation
7:12
Recovery of Oocytes and in vitro Fertilization
7:51
Representative Results
8:40
Conclusion
