יישום הופסק זרימה שיטות קינטיקס לחקור את מנגנון הפעולה של חלבון תיקון DNA

זוהי הצגה של שתי שיטות זרימה מופסקת (stopped flow) למדידת קינטיקת התגובה של MutS2-MutS6, חלבון לתיקון אי-התאמה של DNA. MutS2-MutS6 מזהה אי-התאמות בזוגות בסיסים ב-DNA ומסמן לתיקון בתגובה המונעת על ידי ATP. השיטה הראשונה מודדת את קישור ה-MutS2-MutS6 ל-DNA באמצעות העלייה בפלואורסצנציה של בסיס 2-aminopurine הממוקם סמוך לזוג אי-התאמה GT ב-DNA. המגיבים מעורבבים במכשיר stopped flow וננטרים לאורך זמן כדי לקבוע את קבועי הקצב.

השיטה השנייה מודדת את פעילות ה-TPA של mush two mush six באמצעות חלבון דיווח פלואורסצנטי הקושר פוספט. המגיבים מעורבבים בשיטת זרימה עצורה (stopped flow) וננטרים לאורך זמן. קביעת קבועי הקצב עבור הידרוליזה של a TP ושחרור פוספט, מהנתונים הקינטיים המתקבלים, שופכת אור על מנגנון הפעולה של mush two mush six בתיקון אי-התאמה ב-DNA.

שלום, אני נואה בירו מהמעבדה של MONI במחלקה לביולוגיה מולקולרית וביוכימיה באוניברסיטת וזליאן. היי, אני DJ J, גם אני מהמעבדה של Man באוניברסיטת וזליאן. ואני כריס דסט, גם אני מהמעבדה של JI.

היום נדגים לכם שתי מערכות בדיקה מבוססות פלואורסצנציה לניטור קינטיקה של תגובה בלוח זמנים של מילי-שניות. אנו משתמשים בשיטות אלו במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד חלבון תיקון ה-DNA שנקרא MutS$\alpha$ נקשר לזוגות בסיסים לא תואמים ב-DNA ומניע את תהליך התיקון. אז בואו נתחיל.

לפני תחילת הטיפול, יש להכין את ריאגנטי החלבון וה-DNA הדרושים. השג את החלבון s visier mush two mush six שהיה בביטוי יתר מוקדם ב-coli וטוהר באמצעות כרומטוגרפיית חילוף יונים וכרומטוגרפיית זיקה. כדי להכין את ריאגנטי ה-DNA, רכוש DNA גדיל יחיד, ששונה באמצעות האנלוג הנוקלאוטידי הפלואורסצנטי 2-aminopurine, טוהר את הגדילים באמצעות אלקטרופורזה בגל פוליאקרילאמיד דנטורטיבי (denaturing polyacrylamide gel electrophoresis) והשחל אותם כדי ליצור DNA דופלקס עם אי-התאמה (mismatched duplex DNA), כאשר 2-aminopurine סמוך לאי-התאמה מסוג GT.

באופן דומה, הכין DNA לא מסומן מ-DNA חד גדילי שאינו שעבר מודיפיקציה. את רצפי ה-DNA שנעשה בהם שימוש כאן ניתן למצוא בחלק הכתוב של פרוטוקול זה. לאורך הליך זה, הקפד על יושרה ניסיונית גבוהה על ידי שימוש בכימיקלים באיכות גבוהה כדי לצמצם זיהומים פלואורסצנטיים.

בנוסף, סננו את כל תמיסות המלאי דרך ממברנה של 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים שעלולים לסתום את מכשיר ה-stopped flow. להכנה לניסויי קישור ה-DNA, הכינו דגימות לנפח סופי של 400 מיקרוליטר לדגימה, כמות המספיקה לכ-10 עקבות קינטיות. שמרו את הדגימות על קרח.

כדי לשמור על פעילות החלבון, הכינו את דגימת ה-DNA בריכוז 0.12 micromolar ואת דגימת ה-mush two mush six בריכוז 0.8 micromolar בבופר קישור ל-DNA. פעולה זו תביא לריכוזים סופיים של 0.06 micromolar DNA ו-0.4 micromolar mush Two M six לאחר ערבוב ביחס של אחד-לאחד ב-stopped flow.

מכשיר stopped flow משתמש במנוע הנעה כדי לדחוף בו-זמנית ובמהירות את תמיסות המגיבים ממזרקי ההנעה אל תוך התקן ערבוב. התמיסה המעורבבת זורמת לאחר מכן אל תא תצפית לצורך איסוף נתונים. כדי להכין את המכשיר, ודא תחילה שהמחשב והבקר כבויים.

לאחר מכן, הפעילו את אמבט המים הצירקולטורי לקירור המנורה והדליקו את המנורה. כווננו את המونوכרומטור לאורך גל העירור הרצוי, שהוא 315 nanometers. עבור 2-aminopurine, כווננו את רוחב ה-SL לערך הרצוי.

הכנס מסנן עם סף חיתוך של 350 nanometer בשפופרת הכפלת הפוטונים או ה-PMT כדי לאסוף את אות הפלואורסצנציה של שני האמינו-פורינים. הפעל את הבקר ואת המחשב. לאחר מכן, הפעל את אמבט המים הצירקולרי.

פעולה זו ממלאת את מעטפת המים סביב מזרקי ההנעה כדי לשמור על הטמפרטורה הרצויה במהלך הניסוי. לבסוף, הפעל את תוכנית ה-stop flow תחת התפריט לבקרת P-M-T-H-V. הגדר את מתח ה-PMT, שניתן לשנות בתחילה כדי להתאים את רגישות ה-PMT, אך חייב להישאר קבוע.

במהלך הניסוי, מדדו את זרם החשיכה (dark current) כדי לתקן את רעשי הרקע החשמליים. לאחר מכן, שטפו את מזרקי ההנעה של מערכת ה-stopped flow ואת תא התצפית. כוונו את שסתום טעינת הדגימה למצב טעינה (load).

מלאו מזרק של 1 mL במים מזוקקים מסוננים. חברו את המזרק לפתח הטעינה הממוקם מתחת למזרק ההנעה ודחפו מים בין שני המזרקים. חזרו על התהליך פעמיים עבור כל אחד.

מזרק דחיפה לשימוש בניסוי. לאחר מכן, מלאו את מזרקי הדחיפה במים כדי לשטוף את תא התצפית. העבירו את שסתומי טעינת הדגימה למצב ירי (fire).

השתמש בפקודת כיוון מניע המזרק (adjust syringe drive) כדי להוריד את לוח המניע ולדחוף מים דרך תא התצפית ואל תוך קו היציאה. הקפד לא לדחוף את הבוכנה עד לסופה של מזרק המניע. לבסוף, הרם את לוח המניע והעבר את השסתום למצב טעינה (load).

שטפו פעם אחת עם בופר תגובה ורוקנו את המזרקים. כדי להתחיל את ניסויי קישור ה-DNA, העבירו כל דגימה מהמבחנה למזרק נקי של מיליליטר אחד. חברו כל מזרק לישיר הטענה ודחפו את התמיסה אל מזרק ההנעה.

הסר בועות אוויר על ידי דחיפה ידנית של התמיסה בין שתי המזרקים עם הפסקות לסירוגין. לאחר מכן, הורד את לוח ההנעה עד שייגע בחלק העליון של מזרקי ההנעה. לאיסוף נתונים, פתח את חלון ערוצי הזמן המוגדרים.

בחר את מצב ערוץ איסוף הנתונים של ניתוח הנתונים, ואת מספר העקבות (traces) שייאספו. הזן את זמן איסוף הנתונים שבמהלכו ייאספו 1000 נקודות נתונים. לאחר מכן, כוון את השסתום למצב הפתיחה (fire position) ולחץ על כפתור איסוף הנתונים.

פעולה זו מתחילה את הערבוב של mush two, mush six ו-DNA, ולאחריה כניסת התגובה לתצפית. פליטה פלואורסצנטית של תאים מ-two amino purine מנוטרת לאורך הזמן. אסוף לפחות חמישה עקומות קינטיקה כדי להשיג סט נתונים באיכות גבוהה ושמור את הקובץ עם השלמת הניסוי.

פתחו כל קובץ נתונים והוציאו ממוצע של מספר עקומות קינטיקה. לאחר מכן שמרו את קובץ הנתונים הממוצע וייצאו אותו לתוכנת גרפים לצורך ניתוח. לבסוף, כבו את המנורה ושטפו היטב את המזרקים ואת תא התצפית במים.

לאחר מכן כבו את שאר הציוד למעט אמבט המים המסתובב. זה נשאר דולק למשך 15 דקות נוספות כדי לקרר את המנורה. הנתונים הקינטיים של קישור mush two mush six ל-DNA שגוי (mismatched DNA) מתאימים בצורה מיטבית לפונקציה מעריכית אחת, המניבה קצב אסוציאציה מהיר בסדר גודל של 10⁷ per molar per second. ניסויי stopped flow אנלוגיים מניבים את קצב הדיסוציאציה של קומפלקס ה-mush two mush six mismatched DNA, המתרחש באיטיות רבה בקצב של 0.01 עד 0.02 per second.

תוצאות אלה מספקות מדד ישיר למהירות ולאפיניות שבהן MutS2-MutS6 נקשר לזוג בסיסים לא תואם במהלך תגובת תיקון ה-DNA. בשלב הבא, יבוצע ניסוי stopped flow כדי למדוד את פעילות ה-ATPase של MutS2-MutS6.

בתנאי מצב טרום-מדידה עבור בדיקה זו, חיוני לחלוטין להימנע משימוש בזכוכית בכל שלבי הכנת הרכיבים, כולל טיהור חלבונים ו-DNA, וזאת כדי למזער את רמות הפוספט ברקע. חלבון קושר פוספט או PBP, שטוהר מ-e coli וסומן עם הפלואורופור MDCC, משמש כחומר דיווח למדידת שחרור פוספט בעקבות הידרוליזה של TP. MDCC-PBP הוא חומר דיווח חסון לקינטיקה של הידרוליזה של ATP ושחרור פוספט במצב טרום-מדידה. הוא נקשר לפוספט במהירות ובזיקה גבוהה, מה שמוביל לעלייה משמעותית בפלואורסצנציית ה-MDCC.

הכינו דגימה עם 4 µM mush ו-2 mush six protein עם או בלי 6 µM של DNA לא תואם (mismatched DNA). הכינו דגימה נוספת עם 1 mM של HEP שהומס לאחרונה ו-20 µM של M-D-C-C-P-V-P כדי לסלק פוספט מזהם. הוסיפו לתוך הדגימות purine, nucleoside, phosphorylase ו-seven methyl guine, והדגירו על קרח למשך 20 דקות לפחות.

הכינו את מכשיר ה-stopped flow כפי שתואר קודם לכן. בנוסף, נקו שאריות של זיהומי פוספט ממזרקי ההנעה באמצעות פורין, נוקלאוזיד, פוספוריל ושבעה-מתיל-גואנין. דגרו למשך 20 דקות. הגדירו את אורך גל העירור ל-425 nanometers והשתמשו במסנן cutoff של 450 nanometer עם ה-PMT לצורך גילוי פלואורסצנציה של M-D-C-C-P-B-P.

טען את מזרקי ההנעה עם הדגימות כפי שתואר קודם לכן. הגדר את פרמטרי איסוף הנתונים ולחץ על "collect data" כדי לערבב את mush two mush six עם TP ו-M-D-C-C-P-B-P; נטר את שחרור הפוספט על ידי mush two mush six ואת העלייה הנלווית בפלואורסצנציה של M-D-C-C-P-P-P לאורך זמן. אסוף לפחות חמישה עקומות קינטיקה כדי להשיג סט נתונים באיכות גבוהה ושמור את הקובץ; בצע ממוצע למספר עקומות קינטיקה וייצא את קובץ הנתונים לניתוח כפי שתואר קודם לכן. הכן עקומת כיול כדי לקבוע את הקשר הליניארי בין ריכוז הפוספט לבין פלואורסצנציה של M-D-C-C-P-P-P; ראשית, ערבב M-D-C-C-P-P-P עם ריכוזי פוספט שונים תחת אותם תנאי ניסוי במכשיר ה-stopped flow.

לאחר מכן, שרטטו את פלואורסצנציית ה-M-D-C-C-P-P-P המקסימלית מול כל ריכוז פוספט עבור עקומת הכיול, והשתמשו בשיפוע כדי לקבוע את ריכוז הפוספט בתגובות של Mush2-Mush6. שרטטו את ריכוז הפוספט מול הזמן והתאימו את הנתונים לפונקציה אקספוננציאלית וליניארית. פונקציה זו מתארת פרץ של הידרוליזת ATP ושחרור פוספט לפני מצב היציבות (pre-steady state), ולאחריו השלב הליניארי של מצב היציבות (steady state) של התגובה. הנתונים הקינטיים מראים כי Mush2-Mush6 ממיס ATP ומשחרר פוספט במהירות של 1.4 לשנייה במחזור הקטליטי הראשון.

לאחר מכן מתרחש שלב איטי בתגובה המגביל את מחזורי התגובה העוקבים לקבוע קטליטי במצב יציב איטי פי שבעה, של 0.2 לשנייה. עם זאת, כאשר mush to mush six קשור ל-DNA עם זיווג שגוי, פרץ ההידרוליזה של ATP ושחרור הפוספט מדוכאים. תוצאות אלו מראות באופן ישיר כי בעת קישור לזיווג בסיסים שגוי ול-DNA, ה-mush too mush six עובר למצב קשור ל-ATP.

מעבר זה הוא שלב קריטי בתגובת תיקון ה-DNA. הרגע הדגמנו כיצד להשתמש במכשיר stop flow כדי למדוד את קצבי התגובה בזמן אמת. מדידות אלו קידמו את הבנתנו לגבי מנגנון הפעולה של MASH two, MASH six ותיקון התאמה שגויה של DNA.

בעת ביצוע סוגים אלו של ניסויים, חשוב לזכור להשתמש בחומרים באיכות גבוהה, כולל DNA וחלבונים בדרגת טהרה גבוהה מאוד, ולהקפיד במיוחד על מניעת זיהום של פוספט בבדיקת ה-ATP. זהו כל הסיפור. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.