הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס
14 ביולי 2010
תכונה אחת של מחלת אלצהיימר היא העלאת Aβ 1-42 פפטיד. כאן אנו מספקים פרוטוקול להכנת Aβ סינתטי 1-42 Oligomers, אשר פוגע בהיפוקמפוס potentiation לטווח ארוך, הסלולר לתאם של זיכרון. הליך זה שימושי לחקר מנגנוני סינון פתולוגיה התרופה Aβ-Induced.
beta amyloid 1 42 סינתטי מומס מחדש ב-HFIP כדי למודרנז את הפפטיד תחילה, ולאחר מכן מרוכז עד לקבלת שכבה דקה לצורך ליגנטיזציה. השכבה מומסת מחדש ב-DMSO, מדוללת בבופר פוספט ומודגרה למשך לילה. לבסוף, הפפטיד האוליגומרי מדולל עם בופר רישום ומוזרם על פרוסות היפוקמפוס חדות, שבהן מוערכת השפעת החשיפה ל-beta amyloid על הפלסטיות הסינפטית.
ברוכים הבאים למעבדה של Avio Orio באוניברסיטת קולומביה בניו יורק. שלום, היום נדגים לכם הליך שביצענו לו אופטימיזציה להכנת amyloid beta אוליגומרים, המבוסס על פרוטוקול שהוצע במקור על ידי Stein ועמיתיו בשנת 2003. במעבדה זו, השתמשנו בהליך זה כדי לחקור תפקוד סינפטי לקוי המושרה על ידי amyloid beta.
אם כן, נתחיל. הרגישו את בקבוקון אבקת ה-beta amyloid הליופיליזציה להגיע לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, כדי למנוע התעבות בעת פתיחתו תחת מ 빠르게 מנדף (fume hood). פתחו את הבקבוקון והוסיפו HFIP קר מאוד כדי להגיע לריכוז סופי של beta amyloid של 1 mM.
סגרו את הבקבוק וערבבו באמצעות וורטקס; בעזרת מזרק Hamilton חלקו במהירות את התמיסה באופן שווה בין שלושה מבחני מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן בעלי קישור נמוך (low binding). סגרו את המבחנות והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לפפטיד להתערבב. פתחו את המבחנות והניחו אותן ב-speed vac כדי לרכז את התמיסה. סובבו ב-800 Gs תחת ואקום למשך כ-15 דקות.
ודאו שהטמפרטורה אינה עולה על 25 °C כדי למנוע דגרדציה של החלבון. הסבוב מסתיים כאשר נראה סרט פפטיד יבש וצלול בתחתית המבחנה. ייתכן שהסרט יהיה קשה לראייה; אטמו את המבחנות ואחסנו מנות (aliquots) שלא נעשה בהן שימוש בטמפרטורה של 80- °C למשך עד שישה חודשים במנדף; השתמשו ב-DMSO כדי להמיס מחדש את סרט הפפטיד לריכוז סופי של 5 mM, ובצעו סוניקציה באמבט מים למשך 10 דקות.
כדי להבטיח השעיה מלאה של הפפטיד, אחסנו מנות של 1.6 µL של תמיסת beta amyloid בריכוז 5 mM בטמפרטורה של 20-°C. יש להפשיר כל מנה פעם אחת בלבד; ביום שלפני הניסוי, הפשירו מנה אחת של תמיסת beta amyloid בריכוז 5 mM והוסיפו 98.4 µL של באפר פוספט סטרילי לנפח סופי של 100 µL. ערבבו במכשיר vortex למשך 30 שניות והדגרו בטמפרטורה של 4°C למשך 12 שעות. כדי לאפשר לתחילת האגרגציה, הדגרו ליזיס היפוקמפלי טרי למשך 90 דקות.
בבuffer הקלטה סטנדרטי, אלקטרודת הגירוי ממוקמת על ה-shafer's collaterals ואלקטרודת ההקלטה ממוקמת על ה-stratum radium. לאחר שנמצאה תגובה והקו הבסיסי יציב במשך 10 דקות, יש לדלל את ה-all liga beta amyloid ל-200 nM. ב-buffer הקלטה, beta amyloid נקשר באופן לא ספציפי לזכוכית, לכן יש להשתמש בפלסטיק ככל האפשר.
בצעו פרפוזיה של תמיסת הבטא-עמילואיד על הפרוסות למשך 20 דקות. הגש את גירוי ה-toan X המועדף עליך. לדוגמה, theta burst מיד לאחר ה-tetanus, ולאחר מכן חזרו לפרפוזיה עם תמיסת רישום רגילה.
יש לעקוב אחר ההקלטה למשך שעתיים לפחות לאחר הטיטנוס כדי לאשש את השראת ה-LTP ולראות את השפעות הטיפול בבטא-עמילואיד. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין בטא-עמילואיד אוליגומרי 1 עד 42 לצורך השראת פגיעה בפלסטיות סינפטית בחתכי היפוקמפוס. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שייבוש יתר של סרט הפפטיד עלול להוביל לאוליגומריזציה חלקית.
חשוב גם להשתמש בכלי פלסטיק עבור תמיסות בטא-עמילואיד כדי למנוע קישור לא ספציפי של הפפטיד. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת אוליגומרים סינתטיים של Aβ 1-42, הידועים כפוגעים ב-Long-Term Potentiation של ההיפוקמפוס, מנגנון מרכזי הקשור לזיכרון. ההליך חיוני למחקר של פתולוגיה המושרית על ידי Aβ ולמטרות של סריקת תרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- מחקר על מחלת האלצהיימר
רקע
- מחלת אלצהיימר מאופיינת ברמות מוגברות של פפטיד Aβ 1-42.
- אוליגומרים של Aβ 1-42 מעורבים בתפקוד סינפטי לקוי.
- פוטנציאציה לטווח ארוך (LTP) היא מקבילה תאית של זיכרון.
- הבנת השפעות ה-Aβ יכולה לסייע בפיתוח תרופות.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט לסנתזה של אוליגומרים של Aβ 1-42.
- בחינת המנגנונים של פגיעה סינפטית המושרית על ידי Aβ.
- סיוע בסריקת תרופות עבור טיפולים פוטנציאליים במחלת האלצהיימר.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ריסוספנזיה של בטא-עמילואיד סינתטי ב-HFIP.
- ריכוז הפפטיד לשכבה דקה (film) לצורך ליגמנטיזציה.
- ריסוספנזיה ב-DMSO ואינקובציה בבופר פוספט.
- הערכת החשיפה לבטא-עמילואיד בחתכים אקוטיים של ההיפוקמפוס.
תוצאים עיקריים
- אוליגומרי Aβ 1-42 שהוכנו פוגעים ביעילות בפלסטיות סינפטית.
- הפרוטוקול מאפשר קבלת תוצאות הניתנות לשחזור בחקר של תפקוד סינפטי לקוי.
- הממצאים תורמים להבנת תפקידו של Aβ בפתולוגיה של מחלת אלצהיימר.
- יישומים פוטנציאליים בסריקת תרופות לטיפולים במחלת אלצהיימר.
מסקנות
- הפרוטוקול להסנתזה של אוליגומרים של Aβ 1-42 הוא יעיל ואמין.
- מחקר זה מעמיק את ההבנה לגבי השפעת Aβ על תהליכים הקשורים לזיכרון.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלו כדי לבחון אפשרויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פגיעה בפלסטיות סינפטית של ההיפוקמפוס המושרה על ידי β-amyloid1-42 אוליגומרי מספקת מודל חסון ורלוונטי למחלה למחקר שלבים מוקדמים של מחלת האלצהיימר. פרדיגמה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מנגנונית וביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובסריקת תרכובות לתפקוד סינפטי לקוי. הגישה תומכת במיון תיקי פיתוח על ידי הבהרת הרלוונטיות התרגומית של התערבויות מועמדות המכוונות לפתולוגיה המונעת על ידי עמילואיד.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של תפקוד סינפטי לקוי המונע על ידי עמילואיד במערכת ex vivo מבוקרת.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרה על ידי כימות הליקוי ב-LTP בעקבות חשיפה ל-β-amyloid אוליגומרי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור היפותזות של מחלת אלצהיימר ברמה הסינפטית.
- מספק פלטפורמה לביטחון ניבוי בהערכה של תרכובות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכונן בדיקה ניתנת לשחזור לכימות פגיעה בפלסטיות סינפטית בפרוסות היפוקמפוס.
- מבצע סטנדרטיזציה להכנה וליישום של β-amyloid אוליגומרי להשגת תוצאות בדיקה עקביות.
- מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות מועמדות לגבי יכולתן להפחית את השיבוש ב-LTP.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור יוזמות של סריקה בסביבה בעלת תפוקה גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- עולה בקנה אחד עם מנגנונים רלוונטיים למחלה המעורבים בפתולוגיה מוקדמת של אלצהיימר.
- מספק רצף מהמעורבות של המטרה המולקולרית ועד לתוצאות סינפטיות תפקודיות.
- מנחה החלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור השפעות התרכובת לסמנים ביולוגיים תרגומיים של בריאות סינפטית.
- תומך בבחירה ובתיקוף של מודלים פרה-קליניים למחקרים המשכיים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לבין תיקוף פרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת בדיקת היפותזות, הפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות והערכה כמותית של תפקוד סינפטי בתגובה לחשיפה לאמילואיד.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערת אפס לגבי פגיעה סינפטית המושרית על ידי עמילואיד והבהרת מסלולים.
- סריקה: מספקת בדיקה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת תרכובות נגד שיבוש LTP.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות של פלסטיות סינפטית להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים ex vivo לסמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה ולנקודות קצה פרה-קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תזרים עבודה ניתן לשימוש חוזר לאישור מטרות מתמשך ומסעות סריקה בתיקי עבודות של ניוון עצבי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות טיפוליות במחלת אלצהיימר.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של בדיקות לפגיעה סינפטית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנושאי המשך פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי התמקדות בתוצאות תפקודיות הרלוונטיות למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של נכסי פיתוח למחלות ניוון עצבי בהתאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בפפטידים, בהכנת פרוסות היפוקמפוס ובהקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- נדרשת גישה למכשור ייעודי למדידת LTP ומערכות פרפוזיה מבוקרות.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת הפפטידים ולפרוטוקולי הבדיקה.
- עשוי להידרש התאמה למערכות מודל שונות או למחלקות תרכובות שונות, בהתבסס על תכונות המסיסות והקישור.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות באגרגציה של פפטידים ורגישות לתנאי הניסוי.
