פיזור מיקרוסקופיה אופטית על בסיס דו מימדי מסננים גאבור
2 ביוני 2010
אנו להדגים שיטה כהה שדה מיקרוסקופית המבוססת על גאבור כמו סינון למדוד הדינמיקה subcellular בתוך תאים חיים בודד. הטכניקה היא רגישה לשינויים במבנה של האברונים, כגון פיצול המיטוכונדריה.
בסרטון זה, מיקרוסקופ פיזור אופטי משמש לכימות פיצול מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס. למרות שמיקרוסקופ פיזור אופטי אינו דורש בדרך כלל פלואורסצנטיות בפרוטוקול זה, תמונות פלואורסצנטיות יירכשו למטרות אימות. לאחר הגדרת מערכת ההדמיה, התאים מסומנים בירוק גשש MIT ומטופלים בספורין סטור כדי לגרום לאפופטוזיס.
נתונים אופטיים נרכשים כדי לזהות שינויים בכיוון האברונים התאיים תוך שעתיים. ניתן למדוד את תחילת הפיצול המיטוכונדריאלי באמצעות הנתונים המפוזרים האופטיים, המראים ירידה במידת ההתמצאות של חלקיקים תת-תאיים. לאחר מכן הנתונים מאומתים על ידי מתאם הנתונים המפוזרים האופטיים עם האזורים הפלואורסצנטיים המכילים מיטוכונדריה.
היי, אני Nada Bustani מהמעבדה לביו-אופטיקה במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת ראטגרס. אני רוב פאק מהמעבדה לביו-אופטיקה, ואני דין גם ממעבדת ביו. היום נראה לכם הליך לכימות דינמיקה מורפולוגית תת-תאית בשיטה שאינה מסתמכת על צבעים פלואורסצנטיים.
אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים דינמיים במבנה התת-תאי במהלך אפופטוזיס או מוות תאי תוכנית. אז בואו נתחיל. התחל הליך זה על ידי עיקור ידיים עטויות כפפות עם 70% אתנול.
לאחר מכן הניחו תמיסת מלאי מוכנה של 100 ננו טוחנת של מדיום תרבית תאי BAEC ירוק וחם מראש במכסה המנוע כשהאור כבוי ועיקרו את כל המשטחים. לאחר מכן, הניחו צלחת תרבית שש בארות עם תאים מצופים על זכוכית כיסוי מתחת למכסה המנוע. בעזרת פיפטת הדבק המחוברת לקו ואקום.
הסר את מדיום התא מהבארות. לאחר מכן הוסף מיד שני מיליליטר מהמדיום המסומן לכל באר כדי לתייג תאים. המיטוכונדריה. כסו את צלחת תרבית הרקמה כדי למנוע חשיפה לאור ישיר בחדר והחזירו במהירות את התאים לאינקובטור.
דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים דוגרים. הכן את ההגדרה האופטית הפעל תחילה את קשת הכספית clamp. לאחר מכן הפעל את מצלמות המיקרוסקופ של המחשב ותקע לייזר את מכשיר המיקרו מראה הדיגיטלי או DMD במפזר המסתובב.
לאחר מכן, הסתכל דרך עינית המיקרוסקופ כדי לראות אם השיגור האופטי מיושר. שדה הראייה צריך להיות מואר בבהירות על ידי אור לייזר. כדי לטעון את הדגימה, הניחו טיפה אחת עד שתיים קטנות של שמן טבילה על יעד טבילת שמן פי 63 כשהוא כל הדרך למטה.
לאחר מכן, על הבמה, הרכיב שקופית המורכבת מרשת של קווים במרווחים קבועים של 10 מיקרומטר הנקראת גרדי, והרם את המטרה כך שהשמן יתפוס את המיקוד שלה. לאחר מכן, מקד את הקצה המשושה של שדה הקבל. עצור כך שהוא מיושר בתאורה מרכזית של קוהלר.
הקצה המשושה צריך להיות מרוכז בעינית וממוקד בחדות. לאחר מכן באמצעות כפתורי מיקום עצירת שדה המעבה במרכז, שדה הקבל, עצור מעל שדה הראייה. הפעל מעבדת IP והזן את ההגדרות להפעלת המצלמה.
ודא שהמצלמה מוגדרת למצב העברת מסגרות. הפעל את הפקודה רכישת מיקוד כדי להתחיל תצוגה מקדימה חיה. לאחר מכן קבעו את קידומת האינדקס ואת מיקום הקובץ שבו יישמרו התמונות.
לאחר מכן, התחל תמונת RS. ייעד את ההגדרות להפעלת מצלמת הצמד המגניבה. יש להגדיר את מצב השעון למצב רגיל.
הפעל את תוכנת DMD. מקם את קשתית השדה הכהה בתפריט הסקריפט. לאחר מכן לחץ על טען ואפס.
כדי להפעיל את הסקריפט באופן ידני, הגדר את סרגל האופטיב של המיקרוסקופ באזור התצוגה ל-LSM. זה ישלח את התמונה דרך ה-DMD באופטיקה המיושרת. הקרנת תמונת השדה האפל על ה-CCD של מצלמת Cascade five 12.
תמונת השדה הכהה אמורה להופיע בתצוגה המקדימה החיה במעבדת IP. במידת הצורך, מקדו את התמונה בתצוגה המקדימה החיה. הגדר את זמן החשיפה גבוה מספיק כדי להבטיח לפחות 10,000 ספירות של אות בתמונה.
לאחר מכן צלם תמונה של שדה הראייה באמצעות הפקודה היחידה לרכוש לאחר הרכישה. השתמשו בפקודה 'שמור כאינדקס' לשמירת התמונה בתקליטור. התמונה של ה-GTI מודדת את גודל שדה הראייה.
כעת הזיזו את דגימת ה-GTI כך שהיא תהיה מעבר לשדה הראייה ורק הרקע נראה לעין. צלם תמונת רקע של השדה עם זמן חשיפה מספיק כדי לרכוש לפחות 5,000 ספירות. תמונה זו תסייע בהפחתת רקע של התמונות הלא מסוננות.
כעת כדי לרכוש תמונות מסוננות של גאבור של הרקע, טען את סקריפט בנק המסננים של גאבור לתוכנת בקרת DMD. הפעל את קובץ ה- Script כולו כדי לאגור את המסננים לזיכרון המשולב של ה- DMD. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות לאחר אחסון קובץ ה- Script כולו.
השתמש בסמני ההתחלה והעצירה בתוכנת DMD כדי להבטיח שרק קבוצה אחת של מסננים התואמת למסנן Gabor Like אחד נטענת בכל פעם. הפעל את קובץ ה- Script כדי להשיג תמונות מסוננות של הרקע. התצוגה המקדימה של התמונה החיה אמורה להשתנות משדה כהה לתמונה המסוננת.
עבור מסנן זה, פתח את סקריפט הרכישה במעבדת IP מהדיסק. התאם את זמן החשיפה כדי להבטיח שנרכשו לפחות 2000 ספירות. כאשר קובץ ה- Script של DMD פועל, בטל את התצוגה המקדימה החיה במעבדת IP והפעל את קובץ ה- Script של הרכישה.
פעולה זו תרכוש אינדקס באופן אוטומטי ותשמור את התמונה המסוננת בדיסק. ברגע שהתמונה הראשונה נרכשת, עצור את הסקריפט שרץ ב-DMD. מחק את הפקודות שנעשה בהן שימוש מקובץ ה- Script.
לאחר מכן החלף את סמני ההתחלה והעצירה בתחילת ובסוף ערכת המסננים הבאה. חזור על הרכישה במעבדת IP עד שנעשה שימוש בכל בנק המסננים וכל התמונות המסוננות נרכשו ונשמרו. התכוננו לצלחת התאים על ידי חיבור מלחם על שולחן המעבדה וחימום ה-L 15 בינוני עד 37 מעלות צלזיוס.
הכינו עמדת עבודה עם מגבת נייר ומגבון קים כדי לספוג כל מדיום שנשפך ולשמור על ניקיון האזור. הכינו מספר פתילות על ידי קריעה וסיבוב של מגבוני קים. הפתילות ישמשו לשאיבת הנוזל דרך לוחית התא.
לאחר מכן, השתמש במחזיק דגימת המתכת כדי ליצור כריך תא. השתמש במזרק כדי למרוח חרוז דק של שומן ואקום סביב ההיקף העליון של החור בלוחית המתכת המעובדת, המשתרעת בערך באמצע הדרך עד לקצות החריצים מכל צד. העבירו בעדינות החלקה נקייה מספר אחת על השומן.
הופכים את הצלחת ומורחים את השומן סביב החור. כבה את אורות החדר כשהוא לובש כפפות בחינת ניסוי NI מעוקרות אתנול. אחזר את התאים מהחממה.
הסר את תלוש הכיסוי שישמש לניסוי מצלחת שש הבארות. יבש בזהירות את החלקת הכיסוי. לאחר מכן לחץ על צד תא החלקת המכסה כלפי מטה לתוך לוחית המתכת המשומנת מעל viewחור.
סנדוויץ' התאים בתוך הצלחת. ודא שלא יישארו פערי אוויר, ושהשומן יצר אטימה אטומה למים כך שניתן יהיה להעמיס את המדיום. כעת הפוך את הצלחת לאחור על פיפטינג של 200 מיקרוליטר בכל פעם.
מוסיפים L 15 בינוני חם לתוך הכריך דרך החריץ שבין החלקת הכיסוי העליונה לצלחת המתכת עד שהנוזל כמעט מגיע לחריץ בצד השני. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי החזקת פתיל בחריץ הנגדי והחדרת 200 מיקרוליטר נוספים של מדיום לכריך. מדיום יזרום מצד אחד לצד השני כאשר הפתיל מסיר את המדיום הישן.
היזהר למנוע היווצרות בועות בתוך הנוזל במהלך שלב זה. חזור על תהליך זה פעמיים עד שלוש באמצעות פתיל חדש לכל שטיפה. כעת הפוך את הצלחת פעם נוספת ותמך בצלחת מהקצוות כדי ללכוד את הנוזל במאגר התא.
טובלים את הברזל בכוס העציף כדי להמיס במהירות חלק מהעגל, אשר לאחר מכן ייצמד לקצה הברזל. בעזרת קצה הברזל יש למרוח בזהירות את הוויפ המותך סביב שולי החלקת הכיסוי התחתונה. המשך לטבול ולמרוח את כל הדרך סביב היקף החלקת הכיסוי, ואטום אותו על לוחית המתכת.
זה יוצר אטימה מכנית טובה כך שהחלקת הכיסוי לא תתנתק מהצלחת בזמן שהיא נצפית. נקה את כל השאריות מלמטה. כסו את משטח ההחלקה על ידי הרמת מגבון קים וניקוי המכסה.
החלק בתנועת החלקה אחת כדי להבטיח שהחלקת הכיסוי תהיה הנקייה ביותר במרכז שבו היא תצוגה. החזר את שש לוחית הקיר לחממה. קח את התאים המצופים למעבדת האופטיקה ועלה על המטרה.
כמו קודם, מצא שדה של תאים בריאים למראה ורכוש תמונת שדה כהה של שדה הראייה. לאחר מכן יישר את המיקרוסקופ ב-DIC וודא שזמני החשיפה מספיקים. רכוש תמונת DIC עם מצלמת מפל.
במערך זה, תמונות פלורסנט נרכשות באמצעות מצלמת SNAP המגניבה כאשר המיקרוסקופ עדיין מיושר ב-DIC. הגדר את המיקרוסקופ VAR ל-x אחד ואת פתח התצוגה ל-100% דו-עינית והסט את התמונה מהעינית למצלמה. הנח נורית LED כחולה מעל המעבה כדי להאיר את השדה.
לאחר מכן תצוגה מקדימה של שדה הראייה בתמונת RSS והתאם את המיקוד העדין. במידת הצורך, רכוש תמונת DIC ושמור בדיסק. שימו לב כיצד שדה הראייה שונה מזה המתקבל ממצלמת המפל.
תמונות אלה יצטרכו להירשם בשלב הניתוח של הניסוי. לאחר מכן, הזז את קוביית המסנן הפלואורסצנטי למקומה ורכוש תמונת פלואורסצנטיות על ידי הפעלה קצרה של עירור הקרינה באמצעות תריס המיקרוסקופ, ולאחר מכן כבה אותה ברגע שהרכישה הושלמה. כדי למזער את ההלבנה, שמור את תמונת הקרינה בדיסק.
כדי לרכוש תמונות מסוננות, אפס את המיקרוסקופ לשדה ושלח את האור דרך יציאת ה-LSM. כמו קודם, הפעל את כל סקריפט בנק המסננים של גאבור כמו קודם כדי להשלים את רכישת הנתונים לנקודת זמן אחת בזמן שהתאים עדיין על הבמה ומבלי להפריע לשדה הראייה. השתמש בשיטת הפתילה כדי להחליף את מדיום L 15 הרגיל לאותו המכיל תמיסה מיקרומולרית אחת של STS.
במהלך הניסוי יש להוסיף מדיום נוסף למניעת התייבשות על ידי הזרמת מדיום לחריץ של לוחית התא מבלי להוציא אותו מהבמה או להפריע לשדה הראייה. כעת, חזור על שלבים אלה לנקודות זמן עוקבות עד להשלמת הניסוי. הנתונים שנאספו יכללו מספר רב של תמונות מסוננות שיש לעבד כדי לחלץ את הנתונים המבניים התת-תאיים.
כאן מוצגים שני ניסויים לדוגמה. איור זה מציג תמונות עוקבות של דגימת אצות צורניות ימיות. התכונות המכוונות נראות בבירור.
בהדמיית שדה אפל. התמונות המסוננות אופטית המסומנות חמש שוות לאפס מעלות עד חמש שוות ל-160 מעלות מוצגות לצד התמונה הלא מסוננת של הדגימה. לשם השוואה, הקבוצה של תשע תמונות מסוננות של גאבור של הצורנית עובדו פיקסל אחר פיקסל עבור כיוון האובייקט.
בכל פיקסל, האות המקסימלי חולק באות הממוצע כפונקציה של כיוון המסנן כדי לתת ערך יחס גובה-רוחב. כאן, יחס גובה-רוחב קרוב לזה המצוין בכחול קיים באזורים שבהם אין זווית תגובה מועדפת. ערכים גדולים יותר המסומנים באדום מציינים אזורים שבהם קיימת תגובת זווית מועדפת גבוהה יותר.
הבהירות ומשמעות הקוד של תגובת מסנן ה-GABOR הכוללת, כיוון המסנן, נותן את האות המקסימלי בכל פיקסל תואם את הכיוון הניצב לכיוון האובייקט הבסיסי. כיוון חלקיקי התשתית מקודד בתרשים רטט שבו כל קו תואם באופן הדוק את כיוון האובייקט המקומי הבסיסי הנראה בשדה כהה לא מסונן. תרשים הרעד מציג את הכיוון של אובייקטים עם עוצמות תגובה גדולות מ-10% מהמקסימום.
השדה הכהה והתמונות המסוננות אופטית של שדה הכילו תאי אנדותל בקר חיים, תמונות מסוננות נרכשו לאחר מכן כל 20 דקות למשך תקופה של שלוש שעות לאחר הטיפול בגורם האפופטוזיס stor sporin. כאן, מפת יחס הגובה-רוחב בפאנל העליון והדמיית הקרינה של המיטוכונדריה בפאנל התחתון מוצגות כפונקציה של זמן. גוון הצבע מייצג את מידת ההתמצאות, שכן לפני תרשימי הזמן הללו משווים את הירידה במידת ההתמצאות של יחס הגובה-רוחב של החלקיקים בתאי אנדותל שטופלו בספורין, העקבות הבודדים מייצגים תרשימי זמן בתוך תאים בודדים.
אוריינטציית הירידה מוגבלת לאזורי התאים הנרשמים באזורי פלורסנט. כעת, התיקוף נגד הקרינה הושג. זה הופך לארכיון.
כך, בניסויים הבאים, ניתן לבצע את המדידות המיטוכונדריאליות על ידי השמטת שלבי ההדמיה הקרינה ושימוש ישיר בשיטת הפיזור האופטי. זה עתה הראינו לכם כיצד לנטר פיצול מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חתימות פיזור אור המבוססות על מסנני גאבור. בעת ביצוע הליך זה, חשוב שתהיה הכנה טובה לאורח החיים ולוודא שההגדרה האופטית מיושרת ומכוילת היטב.
אז בואו ניקח היגיון לצפייה ו-CoLab עם ניסויים בממשק המשתמש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטת מיקרוסקופיה בשדה חשוך המשתמשת בסינון דמוי גabor להערכת דינמיקה סוב-סלולרית בתאים חיים. הטכניקה רגישה במיוחד לשינויים במבני אבנים, כגון פרגמנטציה של מיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- פירוק מיטוכונדריאלי הוא מדד מרכזי לאפופטוזיס.
- שיטות מיקרוסקופיה מסורתיות דורשות לרוב פלואורסצנציה, דבר המגביל את יישומן.
- מיקרוסקופיית פיזור אופטי מספקת חלופה לא פולשנית.
- הבנת הדינמיקה של אבנים יסודיות של התא (אורגנלות) היא חיונית להשגת תובנות לגבי בריאות התא.
מטרת המחקר
- לכימות של פרגמנטציה מיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופיית פיזור אופטי.
- לתיקוף נתונים אופטיים באמצעות טכניקות של דימוג פלואורסצנטי.
- לשיפור ההבנה של דינמיקה תת-תאית במהלך אפופטוזיס.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תאים המסומנים ב-MIT tracker green.
- טיפול ב-staurosporine להשראת אפופטוזיס.
- רכישת נתונים אופטיים לניטור אוריינטציית האורגנלות.
- הצלבה של נתונים אופטיים עם תמונות פלואורסצנטיות לצורך תיקוף.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיית פיזור אופטי מזהה ביעילות פרגמנטציה של מיטוכונדריה.
- הנתונים מראים ירידה באוריינטציה של חלקיקים תת-תאיים.
- תיקוף פלואורסצנטי מאשר את דיוקם של המדידות האופטיות.
- השיטה מספקת תובנות לגבי הדינמיקה של אבנים תאיות במהלך אפופטוזיס.
מסקנות
- שיטת הסינון מסוג Gabor משפרת את הרגישות של מיקרוסקופיית שדה חשוך.
- ניתן להחיל טכניקה זו לחקר תהליכים תאיים שונים.
- הבנת הדינמיקה המיטוכונדריאלית חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית פיזור אופטי המשתמשת במסנני Gabor דו-ממדיים מאפשרת כימות ללא סימון של דינמיקה מבנית תת-תאית, כגון פרגמנטציה של מיטוכונדריה במהלך אפופטוזה, ובכך מספקת שיטה לא פולשנית להערכת המורפולוגיה והתפקוד של אברונים בתאים חיים. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי אספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של שינויים תת-תאיים המתואמים עם תוצאות תפקודיות, ללא הסתמכות על סימונים פלואורסצנטיים או מודלים מורכבים של פיזור הפוך. התאימות של הטכניקה לפלטפורמות מיקרוסקופיות קיימות ויכולת הסריקה המהירה שלה מקלות על הרציפות התרגומית משלב הגילוי למחקרים פרה-קליניים, ובכך מגבירות את הביטחון החזוי בוויסות מסלולים ובמאמצי סריקה של תרכובות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות שינויים באוריינטציה של אברונים כמדד תפקודי למסלולי מוות או סטרס סוב-צלולריים.
- ערך תפעולי: מספק מדידות ללא סימון (label-free) התואמות לתאים חיים, המפחיתות את השונות הניסויית ותומכות בהערכות הדירות של מעורבות המטרה (target engagement).
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור שינויים מורפולוגיים המושרים על ידי תרכובות להתקדמות אפופטוזה באמצעות חתימות אופטיות הניתנות לההצלבה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת מפות יחס גובה-רוחב כמותיות מתמונות שעברו סינון גבור (Gabor-filtered), המשמשות כפרמטרים מורפולוגיים אובייקטיביים בעלי תוכן גבוה לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר רכישה מהירה של תמונות מסוננות על פני מאות תאים ללא צורך בשיעורי דגימה גבוהים, דבר התומך בפורמטים של בדיקות הניתנות להרחבה (scalable).
- מוכנות הבדיקה: התוצאים נגזרים ישירות מהטרנספורמציה של שדה האובייקט, ובכך נמנעים ארטיפקטים של בדיקרטיזציה (discretization artifacts) ומאפשרים פרופילינג מורפולוגי עקבי ללא סימון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר נתוני פיזור אופטי עם תיקוף פלואורסצנטי כדי לבסס סמן ביולוגי תרגומני של דינמיקת אבניקים, הישים במערכות מודלים שונות.
- תועלת פרה-קלינית: תומכת בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת אינדיקטורים מוקדמים ומדידים של ארגון מחדש תת-תאי המושרה על ידי תרכובות.
- תובנה מכניסטית: מספקת פרמטרים מורפומטריים ייחודיים המשקפים את גודל, צורתו וכיוונו של האבניק, ללא צורך במודלים תיאורטיים של פיזור למבנים שאינם כדוריים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי ה enabling של הערכה נטולת-סמנים של דינמיקה תת-תאית, החל מבדיקת השערות מוקדמת ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), כאשר שינויים מורפולוגיים משמשים כמסמנים תפקודיים למודולציה של מסלולים ולבריאות התא.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות שינויים באוריינטציה של אברונים הקשורים לאפופטוזיס ולבידול.
- סריקה: מספקת פלט כמותי הניתן לשחזור (למשל, יחס היבט, מפות אוריינטציה) המאפשר השוואה של השפעות תרכובות בין אוכלוסיות.
- אנליטיקה: מספקת התפלויות סטטיסטיות של פרמטרים מורפולוגיים המסייעות לצוותים להשוות תנאים ולזהות שינויים משמעותיים בארגון התת-תאי.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתיקוף פרה-קליני באמצעות אותות אופטיים ופלואורסצנטיים הניתנים למתאם, ובכך תומכת בסנכרון ביומרקרים לתגובות דחק של אברונים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר במיקרוסקופים קיימים, ומפחיתה את התלות בתשתיות פלואורסצנציה ייעודיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות מדידה ישירה, ללא סימון (label-free), של דינמיקת האורגנלה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות יישום שאינו תלוי בפלטפורמה והכנה מינימלית של הדגימה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של שינויים סוב-צלולריים הקודמים לתוצאות תפקודיות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מסייע לתיעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים מורפולוגיים כמותיים ואובייקטיביים להכוונת החלטות קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביישור מערך אופטי, כולל הארה בלייזר, תכנות DMD וכיוון קולר (Kohler) לרכישת אות אופטימלית.
- תלוי במיכשור המסוגל למודולציה מרחבית של אור (למשל, DMD) ובמערכות רכישת תמונה מסונכרנות לצילום רצפי מבוסס מסננים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי רכישת תמונות, זמני חשיפה ורצפי בנק מסננים כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- התאמה למערכות מודלים שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של עוצמת ההארה ופרמטרי המסננים, בהתאם למקדם השבירה ומאפייני הפיזור התת-תאיים.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לאור מחוץ למיקוד (out-of-focus) והצורך בבקרת סביבה יציבה במהלך דימות תאים חיים לטווח ארוך.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:26
Protocol
2:18
Preparing the Optical Setup
6:57
Plating the Cells
5:26
Loading the Filterbank and Using the Setup to Acquire Filtered-Background Images
9:44
Performing Optical Scatter Microscopy
11:53
Representative Images
14:28
Conclusion
