פיזור מיקרוסקופיה אופטית על בסיס דו מימדי מסננים גאבור
2 ביוני 2010
אנו להדגים שיטה כהה שדה מיקרוסקופית המבוססת על גאבור כמו סינון למדוד הדינמיקה subcellular בתוך תאים חיים בודד. הטכניקה היא רגישה לשינויים במבנה של האברונים, כגון פיצול המיטוכונדריה.
בסרטון זה, מיקרוסקופ פיזור אופטי משמש לכימות פיצול מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס. למרות שמיקרוסקופ פיזור אופטי אינו דורש בדרך כלל פלואורסצנטיות בפרוטוקול זה, תמונות פלואורסצנטיות יירכשו למטרות אימות. לאחר הגדרת מערכת ההדמיה, התאים מסומנים בירוק גשש MIT ומטופלים בספורין סטור כדי לגרום לאפופטוזיס.
נתונים אופטיים נרכשים כדי לזהות שינויים בכיוון האברונים התאיים תוך שעתיים. ניתן למדוד את תחילת הפיצול המיטוכונדריאלי באמצעות הנתונים המפוזרים האופטיים, המראים ירידה במידת ההתמצאות של חלקיקים תת-תאיים. לאחר מכן הנתונים מאומתים על ידי מתאם הנתונים המפוזרים האופטיים עם האזורים הפלואורסצנטיים המכילים מיטוכונדריה.
היי, אני Nada Bustani מהמעבדה לביו-אופטיקה במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת ראטגרס. אני רוב פאק מהמעבדה לביו-אופטיקה, ואני דין גם ממעבדת ביו. היום נראה לכם הליך לכימות דינמיקה מורפולוגית תת-תאית בשיטה שאינה מסתמכת על צבעים פלואורסצנטיים.
אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים דינמיים במבנה התת-תאי במהלך אפופטוזיס או מוות תאי תוכנית. אז בואו נתחיל. התחל הליך זה על ידי עיקור ידיים עטויות כפפות עם 70% אתנול.
לאחר מכן הניחו תמיסת מלאי מוכנה של 100 ננו טוחנת של מדיום תרבית תאי BAEC ירוק וחם מראש במכסה המנוע כשהאור כבוי ועיקרו את כל המשטחים. לאחר מכן, הניחו צלחת תרבית שש בארות עם תאים מצופים על זכוכית כיסוי מתחת למכסה המנוע. בעזרת פיפטת הדבק המחוברת לקו ואקום.
הסר את מדיום התא מהבארות. לאחר מכן הוסף מיד שני מיליליטר מהמדיום המסומן לכל באר כדי לתייג תאים. המיטוכונדריה. כסו את צלחת תרבית הרקמה כדי למנוע חשיפה לאור ישיר בחדר והחזירו במהירות את התאים לאינקובטור.
דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים דוגרים. הכן את ההגדרה האופטית הפעל תחילה את קשת הכספית clamp. לאחר מכן הפעל את מצלמות המיקרוסקופ של המחשב ותקע לייזר את מכשיר המיקרו מראה הדיגיטלי או DMD במפזר המסתובב.
לאחר מכן, הסתכל דרך עינית המיקרוסקופ כדי לראות אם השיגור האופטי מיושר. שדה הראייה צריך להיות מואר בבהירות על ידי אור לייזר. כדי לטעון את הדגימה, הניחו טיפה אחת עד שתיים קטנות של שמן טבילה על יעד טבילת שמן פי 63 כשהוא כל הדרך למטה.
לאחר מכן, על הבמה, הרכיב שקופית המורכבת מרשת של קווים במרווחים קבועים של 10 מיקרומטר הנקראת גרדי, והרם את המטרה כך שהשמן יתפוס את המיקוד שלה. לאחר מכן, מקד את הקצה המשושה של שדה הקבל. עצור כך שהוא מיושר בתאורה מרכזית של קוהלר.
הקצה המשושה צריך להיות מרוכז בעינית וממוקד בחדות. לאחר מכן באמצעות כפתורי מיקום עצירת שדה המעבה במרכז, שדה הקבל, עצור מעל שדה הראייה. הפעל מעבדת IP והזן את ההגדרות להפעלת המצלמה.
ודא שהמצלמה מוגדרת למצב העברת מסגרות. הפעל את הפקודה רכישת מיקוד כדי להתחיל תצוגה מקדימה חיה. לאחר מכן קבעו את קידומת האינדקס ואת מיקום הקובץ שבו יישמרו התמונות.
לאחר מכן, התחל תמונת RS. ייעד את ההגדרות להפעלת מצלמת הצמד המגניבה. יש להגדיר את מצב השעון למצב רגיל.
הפעל את תוכנת DMD. מקם את קשתית השדה הכהה בתפריט הסקריפט. לאחר מכן לחץ על טען ואפס.
כדי להפעיל את הסקריפט באופן ידני, הגדר את סרגל האופטיב של המיקרוסקופ באזור התצוגה ל-LSM. זה ישלח את התמונה דרך ה-DMD באופטיקה המיושרת. הקרנת תמונת השדה האפל על ה-CCD של מצלמת Cascade five 12.
תמונת השדה הכהה אמורה להופיע בתצוגה המקדימה החיה במעבדת IP. במידת הצורך, מקדו את התמונה בתצוגה המקדימה החיה. הגדר את זמן החשיפה גבוה מספיק כדי להבטיח לפחות 10,000 ספירות של אות בתמונה.
לאחר מכן צלם תמונה של שדה הראייה באמצעות הפקודה היחידה לרכוש לאחר הרכישה. השתמשו בפקודה 'שמור כאינדקס' לשמירת התמונה בתקליטור. התמונה של ה-GTI מודדת את גודל שדה הראייה.
כעת הזיזו את דגימת ה-GTI כך שהיא תהיה מעבר לשדה הראייה ורק הרקע נראה לעין. צלם תמונת רקע של השדה עם זמן חשיפה מספיק כדי לרכוש לפחות 5,000 ספירות. תמונה זו תסייע בהפחתת רקע של התמונות הלא מסוננות.
כעת כדי לרכוש תמונות מסוננות של גאבור של הרקע, טען את סקריפט בנק המסננים של גאבור לתוכנת בקרת DMD. הפעל את קובץ ה- Script כולו כדי לאגור את המסננים לזיכרון המשולב של ה- DMD. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות לאחר אחסון קובץ ה- Script כולו.
השתמש בסמני ההתחלה והעצירה בתוכנת DMD כדי להבטיח שרק קבוצה אחת של מסננים התואמת למסנן Gabor Like אחד נטענת בכל פעם. הפעל את קובץ ה- Script כדי להשיג תמונות מסוננות של הרקע. התצוגה המקדימה של התמונה החיה אמורה להשתנות משדה כהה לתמונה המסוננת.
עבור מסנן זה, פתח את סקריפט הרכישה במעבדת IP מהדיסק. התאם את זמן החשיפה כדי להבטיח שנרכשו לפחות 2000 ספירות. כאשר קובץ ה- Script של DMD פועל, בטל את התצוגה המקדימה החיה במעבדת IP והפעל את קובץ ה- Script של הרכישה.
פעולה זו תרכוש אינדקס באופן אוטומטי ותשמור את התמונה המסוננת בדיסק. ברגע שהתמונה הראשונה נרכשת, עצור את הסקריפט שרץ ב-DMD. מחק את הפקודות שנעשה בהן שימוש מקובץ ה- Script.
לאחר מכן החלף את סמני ההתחלה והעצירה בתחילת ובסוף ערכת המסננים הבאה. חזור על הרכישה במעבדת IP עד שנעשה שימוש בכל בנק המסננים וכל התמונות המסוננות נרכשו ונשמרו. התכוננו לצלחת התאים על ידי חיבור מלחם על שולחן המעבדה וחימום ה-L 15 בינוני עד 37 מעלות צלזיוס.
הכינו עמדת עבודה עם מגבת נייר ומגבון קים כדי לספוג כל מדיום שנשפך ולשמור על ניקיון האזור. הכינו מספר פתילות על ידי קריעה וסיבוב של מגבוני קים. הפתילות ישמשו לשאיבת הנוזל דרך לוחית התא.
לאחר מכן, השתמש במחזיק דגימת המתכת כדי ליצור כריך תא. השתמש במזרק כדי למרוח חרוז דק של שומן ואקום סביב ההיקף העליון של החור בלוחית המתכת המעובדת, המשתרעת בערך באמצע הדרך עד לקצות החריצים מכל צד. העבירו בעדינות החלקה נקייה מספר אחת על השומן.
הופכים את הצלחת ומורחים את השומן סביב החור. כבה את אורות החדר כשהוא לובש כפפות בחינת ניסוי NI מעוקרות אתנול. אחזר את התאים מהחממה.
הסר את תלוש הכיסוי שישמש לניסוי מצלחת שש הבארות. יבש בזהירות את החלקת הכיסוי. לאחר מכן לחץ על צד תא החלקת המכסה כלפי מטה לתוך לוחית המתכת המשומנת מעל viewחור.
סנדוויץ' התאים בתוך הצלחת. ודא שלא יישארו פערי אוויר, ושהשומן יצר אטימה אטומה למים כך שניתן יהיה להעמיס את המדיום. כעת הפוך את הצלחת לאחור על פיפטינג של 200 מיקרוליטר בכל פעם.
מוסיפים L 15 בינוני חם לתוך הכריך דרך החריץ שבין החלקת הכיסוי העליונה לצלחת המתכת עד שהנוזל כמעט מגיע לחריץ בצד השני. לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי החזקת פתיל בחריץ הנגדי והחדרת 200 מיקרוליטר נוספים של מדיום לכריך. מדיום יזרום מצד אחד לצד השני כאשר הפתיל מסיר את המדיום הישן.
היזהר למנוע היווצרות בועות בתוך הנוזל במהלך שלב זה. חזור על תהליך זה פעמיים עד שלוש באמצעות פתיל חדש לכל שטיפה. כעת הפוך את הצלחת פעם נוספת ותמך בצלחת מהקצוות כדי ללכוד את הנוזל במאגר התא.
טובלים את הברזל בכוס העציף כדי להמיס במהירות חלק מהעגל, אשר לאחר מכן ייצמד לקצה הברזל. בעזרת קצה הברזל יש למרוח בזהירות את הוויפ המותך סביב שולי החלקת הכיסוי התחתונה. המשך לטבול ולמרוח את כל הדרך סביב היקף החלקת הכיסוי, ואטום אותו על לוחית המתכת.
זה יוצר אטימה מכנית טובה כך שהחלקת הכיסוי לא תתנתק מהצלחת בזמן שהיא נצפית. נקה את כל השאריות מלמטה. כסו את משטח ההחלקה על ידי הרמת מגבון קים וניקוי המכסה.
החלק בתנועת החלקה אחת כדי להבטיח שהחלקת הכיסוי תהיה הנקייה ביותר במרכז שבו היא תצוגה. החזר את שש לוחית הקיר לחממה. קח את התאים המצופים למעבדת האופטיקה ועלה על המטרה.
כמו קודם, מצא שדה של תאים בריאים למראה ורכוש תמונת שדה כהה של שדה הראייה. לאחר מכן יישר את המיקרוסקופ ב-DIC וודא שזמני החשיפה מספיקים. רכוש תמונת DIC עם מצלמת מפל.
במערך זה, תמונות פלורסנט נרכשות באמצעות מצלמת SNAP המגניבה כאשר המיקרוסקופ עדיין מיושר ב-DIC. הגדר את המיקרוסקופ VAR ל-x אחד ואת פתח התצוגה ל-100% דו-עינית והסט את התמונה מהעינית למצלמה. הנח נורית LED כחולה מעל המעבה כדי להאיר את השדה.
לאחר מכן תצוגה מקדימה של שדה הראייה בתמונת RSS והתאם את המיקוד העדין. במידת הצורך, רכוש תמונת DIC ושמור בדיסק. שימו לב כיצד שדה הראייה שונה מזה המתקבל ממצלמת המפל.
תמונות אלה יצטרכו להירשם בשלב הניתוח של הניסוי. לאחר מכן, הזז את קוביית המסנן הפלואורסצנטי למקומה ורכוש תמונת פלואורסצנטיות על ידי הפעלה קצרה של עירור הקרינה באמצעות תריס המיקרוסקופ, ולאחר מכן כבה אותה ברגע שהרכישה הושלמה. כדי למזער את ההלבנה, שמור את תמונת הקרינה בדיסק.
כדי לרכוש תמונות מסוננות, אפס את המיקרוסקופ לשדה ושלח את האור דרך יציאת ה-LSM. כמו קודם, הפעל את כל סקריפט בנק המסננים של גאבור כמו קודם כדי להשלים את רכישת הנתונים לנקודת זמן אחת בזמן שהתאים עדיין על הבמה ומבלי להפריע לשדה הראייה. השתמש בשיטת הפתילה כדי להחליף את מדיום L 15 הרגיל לאותו המכיל תמיסה מיקרומולרית אחת של STS.
במהלך הניסוי יש להוסיף מדיום נוסף למניעת התייבשות על ידי הזרמת מדיום לחריץ של לוחית התא מבלי להוציא אותו מהבמה או להפריע לשדה הראייה. כעת, חזור על שלבים אלה לנקודות זמן עוקבות עד להשלמת הניסוי. הנתונים שנאספו יכללו מספר רב של תמונות מסוננות שיש לעבד כדי לחלץ את הנתונים המבניים התת-תאיים.
כאן מוצגים שני ניסויים לדוגמה. איור זה מציג תמונות עוקבות של דגימת אצות צורניות ימיות. התכונות המכוונות נראות בבירור.
בהדמיית שדה אפל. התמונות המסוננות אופטית המסומנות חמש שוות לאפס מעלות עד חמש שוות ל-160 מעלות מוצגות לצד התמונה הלא מסוננת של הדגימה. לשם השוואה, הקבוצה של תשע תמונות מסוננות של גאבור של הצורנית עובדו פיקסל אחר פיקסל עבור כיוון האובייקט.
בכל פיקסל, האות המקסימלי חולק באות הממוצע כפונקציה של כיוון המסנן כדי לתת ערך יחס גובה-רוחב. כאן, יחס גובה-רוחב קרוב לזה המצוין בכחול קיים באזורים שבהם אין זווית תגובה מועדפת. ערכים גדולים יותר המסומנים באדום מציינים אזורים שבהם קיימת תגובת זווית מועדפת גבוהה יותר.
הבהירות ומשמעות הקוד של תגובת מסנן ה-GABOR הכוללת, כיוון המסנן, נותן את האות המקסימלי בכל פיקסל תואם את הכיוון הניצב לכיוון האובייקט הבסיסי. כיוון חלקיקי התשתית מקודד בתרשים רטט שבו כל קו תואם באופן הדוק את כיוון האובייקט המקומי הבסיסי הנראה בשדה כהה לא מסונן. תרשים הרעד מציג את הכיוון של אובייקטים עם עוצמות תגובה גדולות מ-10% מהמקסימום.
השדה הכהה והתמונות המסוננות אופטית של שדה הכילו תאי אנדותל בקר חיים, תמונות מסוננות נרכשו לאחר מכן כל 20 דקות למשך תקופה של שלוש שעות לאחר הטיפול בגורם האפופטוזיס stor sporin. כאן, מפת יחס הגובה-רוחב בפאנל העליון והדמיית הקרינה של המיטוכונדריה בפאנל התחתון מוצגות כפונקציה של זמן. גוון הצבע מייצג את מידת ההתמצאות, שכן לפני תרשימי הזמן הללו משווים את הירידה במידת ההתמצאות של יחס הגובה-רוחב של החלקיקים בתאי אנדותל שטופלו בספורין, העקבות הבודדים מייצגים תרשימי זמן בתוך תאים בודדים.
אוריינטציית הירידה מוגבלת לאזורי התאים הנרשמים באזורי פלורסנט. כעת, התיקוף נגד הקרינה הושג. זה הופך לארכיון.
כך, בניסויים הבאים, ניתן לבצע את המדידות המיטוכונדריאליות על ידי השמטת שלבי ההדמיה הקרינה ושימוש ישיר בשיטת הפיזור האופטי. זה עתה הראינו לכם כיצד לנטר פיצול מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חתימות פיזור אור המבוססות על מסנני גאבור. בעת ביצוע הליך זה, חשוב שתהיה הכנה טובה לאורח החיים ולוודא שההגדרה האופטית מיושרת ומכוילת היטב.
אז בואו ניקח היגיון לצפייה ו-CoLab עם ניסויים בממשק המשתמש.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטת מיקרוסקופיה בשדה כהה המשתמשת בסינון דמוי גאבור להערכת דינמיקה תת-תאית בתאים חיים. הטכניקה רגישה במיוחד לשינויים במבני האורגנלים, כגון פיצול המיטוכונדריה במהלך אפופטוזה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- פיצול מיטוכונדריה הוא אינדיקטור מרכזי לאפופטוזה.
- שיטות מיקרוסקופיה מסורתיות דורשות לעתים קרובות פלואורסצנציה, מה שמגביל את היישום שלהן.
- מיקרוסקופיית פיזור אופטי מספקת חלופה לא-פולשנית.
- הבנת הדינמיקה של האורגנלים חיונית לתובנות על בריאות התא.
מטרת המחקר
- להעריך כמותית את פיצול המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופיית פיזור אופטי.
- לאמת נתונים אופטיים עם טכניקות הדמיה פלואורסצנטית.
- להעמיק את ההבנה של הדינמיקה התת-תאית במהלך אפופטוזה.
שיטות ששימשו
- תאים מסומנים עם MIT tracker ירוק.
- טיפול ב-stor sporin כדי לגרום לאפופטוזה.
- איסוף נתונים אופטיים לניטור כיוון האורגנלים.
- קורלציה של נתונים אופטיים עם תמונות פלואורסצנטיות לצורך אימות.
תוצאות עיקריות
- מיקרוסקופיית פיזור אופטי מזהה ביעילות פיצול מיטוכונדריה.
- הנתונים מראים ירידה בכיוון החלקיקים התת-תאיים.
- אימות פלואורסצנטי מאשר את דיוק המדידות האופטיות.
- השיטה מספקת תובנות לגבי הדינמיקה של האורגנלים במהלך אפופטוזה.
מסקנות
- שיטת הסינון דמוי גאבור משפרת את הרגישות של מיקרוסקופיית השדה הכהה.
- טכניקה זו יכולה לשמש לחקר תהליכים תאיים שונים.
- הבנת הדינמיקה המיטוכונדריאלית חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Optical scatter microscopy using two-dimensional Gabor filters enables label-free quantification of subcellular structural dynamics, such as mitochondrial fragmentation during apoptosis, providing a non-invasive method to assess organelle morphology and function in living cells. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by offering quantitative, reproducible readouts of subcellular changes that correlate with functional outcomes, without reliance on fluorescent labels or complex inverse scattering models. The technique’s compatibility with existing microscopy platforms and rapid screening capability facilitate translational continuity from discovery to preclinical studies, enhancing predictive confidence in pathway modulation and compound screening efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying organelle orientation changes as a functional readout of subcellular stress or death pathways.
- Operational Value: Provides label-free, live-cell compatible measurements that reduce experimental variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking compound-induced morphological changes to apoptotic progression through correlatable optical signatures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative aspect ratio maps from Gabor-filtered images that serve as objective, high-content morphological parameters for compound screening.
- Operational Value: Enables rapid acquisition of filtered images across hundreds of cells without high sampling rates, supporting scalable assay formats.
- Assay Readiness: Outputs are derived directly from the object's field transform, avoiding discretization artifacts and enabling consistent, label-free morphological profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Correlates optical scatter data with fluorescent validation to establish a translatable biomarker of organelle dynamics applicable across model systems.
- Preclinical Utility: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, measurable indicators of compound-induced subcellular reorganization.
- Mechanistic Insight: Offers distinctive morphometric parameters that reflect organelle size, shape, and orientation without requiring theoretical scatter models for non-spherical structures.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling label-free assessment of subcellular dynamics from early hypothesis testing through lead optimization, where morphological changes serve as functional proxies for pathway modulation and cellular health.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying organelle orientation shifts linked to apoptosis and differentiation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., aspect ratio, orientation maps) that enable comparison of compound effects across populations.
- Analytics: Provides statistical distributions of morphological parameters that help teams compare conditions and identify significant shifts in subcellular organization.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through correlatable optical and fluorescent signals, supporting biomarker alignment for organelle stress responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability on existing microscopes, reducing dependency on specialized fluorescence infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, label-free measurement of organelle dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via platform-agnostic implementation and minimal sample preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early detection of subcellular changes that precede functional outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing objective, quantitative morphological data to inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical setup alignment, including laser illumination, DMD programming, and Kohler adjustment for optimal signal acquisition.
- Dependent on instrumentation capable of spatial light modulation (e.g., DMD) and synchronized image acquisition systems for sequential filter-based imaging.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition protocols, exposure times, and filter bank sequencing to ensure data comparability.
- Adaptation across model systems may require optimization of illumination intensity and filter parameters based on subcellular refractive index and scattering properties.
- Practical limitations include sensitivity to out-of-focus light and the need for stable environmental control during long-term live-cell imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:50
Introduction
1:26
Protocol
2:18
Preparing the Optical Setup
6:57
Plating the Cells
5:26
Loading the Filterbank and Using the Setup to Acquire Filtered-Background Images
9:44
Performing Optical Scatter Microscopy
11:53
Representative Images
14:28
Conclusion
