Name: לינאריזציה של assay חלבון ברדפורד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למדו שיטה ללינאריזציה של assay חלבון ברדפורד לשיפור דיוק ורגישות בביוכימיה. הפרוטוקול מפחית הפרעות מדטרגנטים ומאפשר כימות חלבון מדויק בטווח רחב של ריכוזים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מאמר זה מוקדש לזכרו של המנוח ד&quot;ר צבי זלינגר, אשר אירח את המחקר המקורי המתואר כאן.

לינאריזציה של גרף כיול חלבון ברדפורד: Assay החלבון מבריק Coomassie כחול, הידוע בכינויו assay ברדפורד 1, נעשה שימוש נרחב בגלל פרוטוקול מהיר ונוח שלה, כמו גם רגישות היחסי. למרבה הצער, יש מידה רבה של עקמומיות פני טווח רחב של ריכוזי חלבון (איור 1). לכן, רק טווח צר של ריכוז חלבון גבוהה יחסית, 2-10 מ"ג / מ"ל ​​BSA, משמש גרף הכיול, אשר לאחר מכן יותר מתאים רגרסיה ליניארית (איור 1, ירוק). עם זאת, הליניאריות דורש ריכוז חלבון של דגימות ידוע ליפול בטווח מוגבל של הגרף כיול על מנת למנוע טעות גדולה, זה גם מפחית את דיוק בטווח מוגבל. הליניאריות מציגה בעיה חמורה במיוחד כאשר כמויות מיקרוגרם של חלבון אינם זמינים, והוא כרוך לעתים קרובות דילולים מרובים של דגימות ידוע. כפי שצוין במאמר המקורי ברדפורד, "מקור הליניאריות הוא מגיב עצמה מאז קיימת חפיפה בספקטרום של שתי צורות שונות של צבע לצבוע." 1. למעשה, שלוש צורות של צבע כחול מבריק Coomassie נמצאים בשיווי משקל חומצה בסיס ב-pH חומצי הרגיל של assay 2. הצורות אדום, כחול וירוק יש ספיגת מקסימום ב 470, 590, ו 650 ננומטר, בהתאמה (איור 2). כחול הוא טופס שקושר את החלבון, ויצרו מורכבות מאוד סופג אור ב 594 ננומטר 3, 4 (איור 2). ברדפורד גם ציין כי "הערך רקע מגיב ומצטמצם כמו לצבוע יותר הוא קשור לחלבון" 1 (איור 3). לכן, ניסינו לחשב את הפחתת רקע 590 ננומטר כמו הגדלת כמויות חלבון מתווספים, על ידי מדידת השינוי של ספיגת ב 450 ננומטר, שבו מורכבים חלבונים לצבוע לא לספוג. מצאנו כי על רקע ירידה חלקית, אך לא באופן מלא, מהווה הליניאריות (איור 4). החוקרים שיערו אז כי הירידה בריכוז לצבוע חינם מייצר עוד עיוות של התגובה ליניארי, כי כמו חלבון לצבוע מחייב הוא בשיווי משקל 5, היווצרות מורכבות תלויה לא רק ריכוז של חלבון החופשי, אלא גם על זו של צבען החופשי (איור 5). אם ניקח בחשבון גם בנושאים הקשורים הריכוז המשתנה של צבע החופשי, פיתחנו משוואה מתמטית המתארת ​​מערכת יחסים ליניארי בין ריכוז החלבון לבין היחס בין מדידות ספיגת, 590 ננומטר מעל 450 ננומטר (איור 6). תיאור מפורט של המחקר התיאורטי הניסוי ניתן למצוא בפרסום שלנו בשנת 1996 אנליטית ביוכימיה 6. משוואה מתמטית היה לבדוק באופן ניסויי ונמצא תשואה עקומת כיול ליניארית לאורך טווח ריכוזי חלבון שלם (איור 7). יתר על כן, המשוואה היה תוקף גם על ידי קביעה עצמאית של ערך ה-pH תלויי הנכון של ליירט את ציר Y 6. פרוטוקול מפורטות Assay ברדפורד משופר חלבון, באמצעות Reader ספיגת microplate: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות של תקן, אלבומין בסרום שור. בכל קנה מידה אחרים עשויים להיבחר, ​​אך מציינים כי תקן אותו חייב לשמש בניסויים בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את דגימות ידוע במים deionized. השתדל 50-50 מיקרוגרם / מ"ל. עם זאת, ריכוזי חלבון גבוה או נמוך יותר מקובלים, שכן אין גבול ברור לטווח ליניארי של assay. עם זאת, המדידה חייב להיות בטווח הליניארי של הקורא ספיגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ריאגנט ברדפורד (Bio-Rad) פי 2.5 במים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0 ו 10-50 μl של פתרון מניות BSA לבארות בשלושה עותקים (יצירת 0-5 מיקרוגרם BSA עקומת כיול). משלימים עם מים deionized להגיע 100 μl / היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבארות שונים, להוסיף 100 μl של מדגם לא ידוע triplicates. ריכוזים אחדים של המדגם לא ידוע ניתן להשתמש כדי להגדיל את הדיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מגיב ברדפורד מדולל לכל הבארות. נפח סך 200 μl / היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן לפחות 5 דקות, אך לא יותר מ 60 דקות לפיתוח הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריק חייב להיות 200 μl מים deionized (ולא לצבוע חלבון אפס היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת ב 590 ננומטר ב 450 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין גרף כיול על ידי חלוקת ערכי ספיגת נטו 590 ננומטר ב 450 ננומטר. שים לב כי החלבון אפס (צבע בלבד) ערך יש לכלול נקודת נתונים (איור 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הריכוז של המדגם לא ידוע על בסיס המשוואה ליניארית של עקומת הכיול (איור 9). </li></ol> נציג תוצאות: בניגוד ספיגת באורך גל אחד של 590 ננומטר, היחס של ספיגת ערכים, 590 ננומטר מעל 450 ננומטר, הוא ליניארי wריכוז החלבון ith (איור 10). ריכוז החלבון של המדגם לא ידוע ניתן לחשב בפשטות באמצעות משוואה ליניארית של עקומת הכיול (איור 10, המשוואה). עם זאת, הדיוק גדל מתקבל על ידי מדידת מספר דילולים מדגם לא ידוע. לשם כך, להכין שני גרפים. הראשון הוא גרף כיול עבור תקן עם חלבון מיקרוגרם על ציר X (איור 11, ימין). הגרף השני הוא למדגם הלא ידוע, עם μl של המדגם המקורי חי על ציר X (איור 11, משמאל). ערך רק צבע יש לכלול גם גרפים (איור 11). ריכוז החלבון של המדגם לא ידוע נגזר על ידי חלוקת המדרונות של המדגם לא ידוע ורמת (איור 11, המשוואה). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. קונבנציונלי ברדפורד גרף כיול. טווח ליניארי מיוצג על ידי סמלים ירוקים. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2. ספקטרה מורכבים של חלבונים ושל צבע לצבוע לבד. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> איור 3. חלבון לצבוע שיווי משקל. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. הפחתת ברקע מחושב נכון חלקית פוחתת הליניאריות. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5"> איור 5. חלבון לצבוע שיווי משקל. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 6"> איור 6. בסיס מתמטי לינאריזציה של assay חלבון ברדפורד. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 7"> איור 7. לינאריזציה של הגרף כיול ברדפורד. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="איור 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 8"> איור 8. חישוב ערכי יחס ספיגת. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="איור 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 9"> איור 9. ברדפורד גרף כיול ליניארית. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="איור 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 10"> איור 10. לינאריזציה של הגרף כיול ברדפורד. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="איור 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 11"> איור 11. חישוב ידוע מדגם ריכוז.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

Assay חלבון ברדפורד הוא פופולרי בשל קלות הביצוע רגישות יחסית. לינאריזציה על ריכוזי חלבון שלם טווח מתקבל על ידי פרוטוקול המובא כאן עוד מפשט את assay, כמו דגימות ידוע לא צריך ליפול בטווח של גרף הכיול. חשוב לציין, את פרוטוקול שיפור נוסף מספק את היתרונות הבאים על פני המקורי ברדפורד פרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת הדיוק. </li><li style=";text...

<table><tbody><tr><td>ריאגנט בראדפורד (Bradford reagent)</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (Bovine Serum Albumin)</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>קורא בליטות למדידת בליעה (Multiplate absorbance reader)</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

לינאריזציה של assay חלבון ברדפורד

Linearization of the Bradford Protein Assay

קביעת כמויות מיקרוגרם של חלבון ב assay Coomassie ברדפורד כחול מבריק נעשה על ידי מדידת ספיגת ב 590 ננומטר. זה assay הנפוצה ביותר מאפשרת כימות חלבון מהיר פשוט lysates תא, שברים הסלולר, או דגימות חלבון רקומביננטי, לצורך נורמליזציה מדידות ביוכימיות. עם זאת, הליניאריות מהותי פשרות את הרגישות ואת הדיוק של שיטה זו. זה הראו כי בתנאים assay סטנדרטי, יחס של מדידות ספיגת ב 590 ננומטר ו -450 ננומטר הוא ליניארי לחלוטין עם ריכוז חלבון. הליך זה פשוט מגדיל את הדיוק משפר את הרגישות של assay על כימות, של פי 10 המתיר עד 50 ננוגרם של אלבומין בסרום שור. יתר על כן, התערבות הציג כלל על ידי דטרגנטים, כי הם השתמשו כדי ליצור את התא lysates מופחת במידה ניכרת על ידי פרוטוקול חדש. משוואה ליניארית שפותחה על בסיס של פעולה המונית החוק של באר לגמרי תואם את נתוני הניסוי.

הדיוק והרגישות של נחישות חלבון ידי assay ברדפורד מהירה ונוחה נפגעת על ידי הליניאריות מהותי. אנחנו מראים הליך לינאריזציה פשוט מגדיל מאוד את הדיוק, משפרת את הרגישות של assay על פי 10, וכן מפחית באופן משמעותי את ההפרעה באמצעות דטרגנטים.

קביעה של כמויות מיקרוגרמיות של חלבון בבדיקת הבראדפורד (Bradford) באמצעות Coomassie brilliant blue מתבצעת על ידי מדידת בליעה באורך גל של 590 ננומטר. ...

בדיקת חלבון בשיטת בראדפורד (Bradford protein assay) מתחילה בהוספת סטנדרט BSA בכמויות עולות ודילול של דגימה לא ידועה לתוך פלטת 96 בארות; מים דה-יוניים מתווספים כדי להשלים את הנפח המשתנה. לאחר מכן, תמיס reagent בראדפורד מתווספת לכל הבארות למעט הבארה הריקה (blank), שחייבת להכיל מים. לאחר חמישה דקות, נמדדת הבליעה באורך גל של 590 nanometers לזיהוי קומפלקס החלבון-צבע וב-450 nanometers.לצורך לינאריזציה של הגרף, היחס בין ערכי הבליעה ב-590 ננומטרים לבין אלו שב-450 ננומטרים הוא לינארי באופן מוחלט ביחס לכמות החלבון. שלום, אני מהמחלקה לביוכימיה באוניברסיטת תל אביב, ישראל, אני מ- (T) מהמעבדה. היום נראה לכם פרוצדורה לקביעת ריכוז חלבון באמצעות פרוטוקול בראדפורד לינארי משופר.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לנרמל את כמות החלבון ב-SZaS, למשל, לפני טעינת ג'לים. אז בואו נתחיל. במבחן בראדפורד (Bradford Assay), שלוש צורות של צבע ה-Kumasi brilliant blue נמצאות בשיווי משקל מבוסס חומצה ב-pH החומצי הרגיל של המבחן.לצורים האדום, הכחול והירוק יש מקסימומי ספיגה ב-475, 590 ו-650 ננומטרים בהתאמה. הצורה הכחולה היא זו הנקשרת לחלבון ויצורה קומפלקס שסופח אור בעוצמה ב-594 ננומטרים. לבדיקה נפוצה זו יש דרגת קימור גבוהה על פני טווח רחב של ריכוזי חלבון.לפיכך, עבור גרף הכיול נעשה שימוש בטווח צר של ריכוזי חלבון גבו

linearization-of-the-bradford-protein-assay

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסרטון מדגים טכניקת קרישה מערבית מבוססת נורמליזציה כוללת של חלבונים לכימות ביטוי חלבון המטרה בדגימה. על ידי ניצול צביעת החלבון הכוללת של הדגימה, מבוצע ניתוח יחסימטרי כדי לקבוע את רמת הביטוי היחסי של חלבון היעד.

כתם מערבי כמותי להערכת רמות ביטוי חלבונים

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

פרוטוקול זה מתאר גישה ללא כיול עבור לכימות חלבון ההומו-oligomerization במבחנה מבוסס על קרינה פלואורסצנטית תנודות ספקטרוסקופיה באמצעות סריקה מיקרוסקופ אור מסחרי. שיטות ניתוח וההגדרות רכישה נכונה מוצגים.

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

מאמר זה מספק פרוטוקול לכימות חלבונים באמצעות בדיקת ברדפורד וטלפון חכם כמכשיר אנליטי. ניתן לכמת את רמות החלבון בדגימות באמצעות נתוני צבע שחולצו מתמונה של צלחת מיקרו שצולמה באמצעות טלפון חכם.

RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN).  שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).

פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

אנו מתארים שיטה לשימוש בציקלודקסטרין כדי לתווך חילופי שומנים של קרום הפלזמה עם ליפידים אקסוגניים. ניתן לשלב טכניקה זו עם ניסויים החוקרים חלבונים טרנסממברניים, המתנהגים באופן שונה בסביבות דמויות רפסודת שומנים מאשר בסביבות שאינן דמויות רפסודה.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

למדו שיטה ללינאריזציה של assay חלבון ברדפורד לשיפור דיוק ורגישות בביוכימיה. הפרוטוקול מפחית הפרעות מדטרגנטים ומאפשר כימות חלבון מדויק בטווח רחב של ריכוזים.

לינאריזציה של assay חלבון ברדפורד

גלה סרטונים נוספים