מדידת משלים Haemolytic 50% (CH ₅₀) פעילות של סרום

מדידת פעילות המשלב ההמוליטית של 50% (CH 50) בסרום. יהיה דרוש פיפט המסוגל להעביר 200 µL ופיפט המסוגל להעביר 1000 µL של סרום בדיקה, שנשמר על קרח, תאי דם אדומים של כבשים רגישים, תמיסת סליין עם בופר Varone ומים מזוקקים, מבחנות לבדיקת הסרום, ומבחנות לבסיס (baseline) ולהמוליזה מלאה (total lysis), מערבב וורטקס ופלטה בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה. סמנו את המבחנות באופן פרטני עם הבקרות והדילול הסופי. במקרה זה, נתחיל בדילול של 1 ל-8.

המשיכו בדילול דו-מכפלה ליצירת דילולים של 1:16, 1:32, 1:64 ו-1:128, וסמנו את שאר המבחנות כביקורת (blank) וליזיס מלא (total lysis). לאחר שכל המבחנות סומנו, ניתן להתחיל בדילול הסרום לבדיקה. התחילו בהעברה של 300 µL של R buffer saline למבחנה נקייה.

כעת העבירו 100 µL של סרום אל 300 µL של R buffer saline. פעולה זו תניב דילול התחלה של 1:4. ודאו שדגימת הסרום מעורבבת היטב.

כעת העבירו 200 µL של roal buffer saline למבחנות שסומנו קודם לכן. כמו כן, הוסיפו 200 µL של roal buffer saline לשתי המבחנות הריקות בתוך מבחנות הליזיס הכוללות. הוסיפו 200 µL של מים מזוקקים, ולא Verona buffet saline.

כעת העבירו 200 µL מהסרום המדולל ביחס של 1:4 למבחנה המסומנת כ-1:8. העברנו בעבר 200 µL של תמיסת סליין PBS לסדרת המבחנות מ-1:8 ועד 1:128. פעולה זו תיצור כעת דילול של 1:8.

ערבבו היטב את הדגימה ולאחר מכן העבירו 200 µL למבחנה המסומנת כ-1:16. המשיכו כך עד שכל סדרת המבחנות ידוהלו. השליכו 200 µL מהמבחנה בדילול 1:28 כך שהנפח הסופי יהיה 200 µL.

ייתכן שתאי דם אדומים של כבשים שעברו סנסיטיזציה שקעו עם הזמן. יש להחזירם לתליה על ידי הפיכה עדינה של המבחנה מספר פעמים. לאחר תליה מלאה, העבירו 200 µL של תאי דם אדומים של כבשים שעברו סנסיטיזציה לכל אחת מהמבחנות שהוכנו.

ודאו שהסרום מעורב היטב עם תאי הדם האדומים. תאי דם אדומים של כבשים רגישים שנוספו למבחנה הריקה (blank) יאפשרו לכם לקבוע את הליזיס הספונטני, בעוד שדם שנוסף למבחנת הליזיס total יאפשר לכם לקבוע את ערך ה-100%. בעזרת שייקר vortex המוגדר על עוצמה נמוכה, ערבבו בעדינות כל אחת מהמבחנות. כעת, הניחו את המבחנות באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C והדגירו במשך 30 דקות.

לאחר 15 דקות של דגירה, ערבבו את המבחנות בעזרת וורטקס בעדינות פעם נוספת ודגרו למשך 15 דקות נוספות. לאחר הדגירה, העבירו את המבחנות לצנטריפוגה המכוונת לארבע מעלות צלזיוס וסבבו במהירות של 1500 G למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, הוציאו את המבחנות בזהירות והניחו אותן במעמד מתאים. כאן תראו את משקע תאי הדם האדומים, בעוד שה-SNA מופיע בצבע אדום.

בשל שחרור ההמוגלובין, העבירו 100 µL של מים מזוקקים למספר הבארות הדרוש בלוחית בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. תוך הקפדה להימנע מהעברת המשקע, העבירו 100 µL מהנוזל העליון (supernatant) לבאר מתאימה בלוחית של 96 בארות. לאחר שכל הדגימות הועמסו על הלוחית, מדדו את הבליעה באמצעות ספקטרופוטומטר ללוחיות המכוון ל-540 nm.

כאן מוצגים נתוני הבליעה הגולמיים עבור שתי החזרות, A1 ו-B1. יש להתייחס לדילול של 1:8.

לאחר מכן יש לנו את הנתונים עבור הדילולים 1:16, 1:32, 1:64 ו-1:128. A6 ו-B6 הם הבקרות הריקות. בעוד ש-A7 ו-B7 הם הליזיס הכולל.

לאחר איסוף הנתונים, יש לחשב את ממוצע הבליעה עבור כל דגימה כפולה. לאחר מכן, הפחיתו את בליעת הבקרה (blank), המייצגת את הליזה הספונטנית, מכל הדגימות. לאחר איסוף כל הנתונים, ניתן כעת לחשב את אחוז הליזה עבור כל מהילה באמצעות הנוסחה הבאה.

לאחר שכל הנתונים חושבו, שרטטו את אחוז הליזיס על הציר האנכי מול דילול הסרום על הציר האופקי. ניתן להשתמש בגרף שיתקבל כדי לחשב את דילול הסרום הנדרש כדי לגרום לליזיס של 50% מתאי הדם הרגישים. גרף זה מציג את אחוז הליזיס המשרטט מול פי הדילול של הסרום.

ניתן להמשיך ולשרטט קו מנקודת ה-50% lysis עד להצטלבותו עם העקומה. בנקודת ההצטלבות עם העקומה, נשרטט קו אנכי למטה אל הציר האופקי. ערך זה מייצג את פי הדילול לו יש לדלל את הסרום כדי להבטיח 50% lysis. כאשר משווים בין שתי דגימות סרום כדי לקבוע אם קיים הבדל ב-CH 50, ניתן להשתמש בדילול המספק 50% lysis כמדד.