Name: השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: למד שיטת השתלה של תאי בלסטומרים מסומני GFP ליצירת עוברים כימריים בדג הזברה. שיטה זו מאפשרת מעקב חי אחר התנהגות תאית והתפתחות מוח ורשתית בעוברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) Core גרנט (5P30EY008098) וקרנות הבאים XW: NIH גרנט R01EY016099 מחקר למניעת עיוורון בפרס פיתוח קריירה. אנו מודים לתרופ קירה לסיוע הדמיה confocal.

ביום 1. הכנה 1. הגדר חוצה דגים הגדר חוצה pairwise של דג הזברה בערב. כדי למנוע הזדווגות אקראית לפני הזמן הרצוי להשתמש חוצצים להפריד את הדג נקבה וזכר את קלטות ההזדווגות. GFP-לבטא דג מהונדס משמשים כמקור בלסטומרים התורם. השורה pt104 מהונדס (Zou et al., 2008), משמש כאן, מבטא GFP בכל מקום בגוף בשליטת היזם EF1. ביטוי של GFP מאפשרת ויזואליזציה של תאים מתורם חי על ידי הדמיה. אחרים הקווים דגים מהונדס המבטאים חלבוני ניאון מתאים ניתן להשתמש לצרכים ספציפיים. 2. הכן בצורת טריז agarose בארות לקיום העובר יוצקים agarose 1% נמס, מוכן במים ביצה E3 (Westerfield, 2007), לתוך צלחת פטרי. Float תבנית פלסטיק כי יש בצורת טריז בליטות על הפתרון agarose ולתת פתרון agarose לחלוטין לחזק. מוציאים את התבנית בזהירות לטבול את המיטה agarose עם מים E3. 3. הכן מחטים השתלה השתמש חולץ מחט אנכי (דוד KOPF מכשירים) בהספק הגדרה 11.5 לעשות מחטים על ידי משיכת pipettes זכוכית נימי (Precision כלי העולמי). טיפים מחט טוב צריך להתחדד עם פירים ארוכה. טוחנים את הטיפים המחט בזווית של 45 מעלות עם מטחנת Micro (Marishige) עד פתחים משופעים של 40-45μm בקוטר פנימי מתקבלים (איור 1A). כדי לנקות את עצות מחט, לצרף צינור בקצה הקהה של המחט, לחבר את הצינור מזרק, ולאחר מכן להתחנף ולשחרר פתרון 10% חומצה הידרופלואורית עד שכל פסולת גלוי מוסר. לאחר מכן, לשטוף עם מים מזוקקים עצות, ואחריו 100% אתנול. אוויר יבש המחטים עד שכל מתאדה אתנול. חשוב להבטיח כי טיפים הינם יבשים לחלוטין: אתנול שיורית יהרוס את המחטים במהלך שלב בטמפרטורה גבוהה ליטוש. כדי לרכך ולהבריק את הקצוות הגסים של מחט טיפים, עצות לאפות את המחט עם החום שנוצר על ידי נימה של זייפן Micro (Marishige). אל תתנו עצות מחט לגעת נימה במהלך ליטוש. כמות החשמל עובר אף נימה ואת המרחק בין החוט לבין עצות מחט יכול להיות מותאם כדי להשיג תנאים החימום הרצוי. הטמפרטורה לא צריך להיות גבוה מדי: זה יהיה להמיס לעוות את הטיפים מחט. אחרי הקצוות הגסים הם והחליק בזהירות לגעת נימה מחומם עם קצה מחט ולאחר מכן משוך בעדינות את החוט מן המחט כדי ליצור הקצה המחודד (איור 1B). מחט חד, חלק, נקי הוא קריטי להשגת בלסטומרים התורם שלם בשביל לא לפגוע בעוברים המארח. 4. הכנת תחקיר העובר, מיצוב משוך פיפטה כוס על אש הגז להשיג בדיקה זכוכית בסדר עם סוף והחליק. בדיקה זו תשמש לתפקיד עוברים בכיוון הנכון לקראת ההשתלה. יום 2. Blastomere השתלה 1. איסוף עוברים dechorionate למחרת, להסיר את המחיצות בין קלטות לחצות לאפשר דגים להזדווג. מניחים את העוברים בצלחת פטרי מלא מים E3. לאחר מכן, עוברים dechorionate באופן ידני על ידי קורעת את chorions מעוברים עם זוג מלקחיים בסדר. השתמש פיפטה זכוכית עם פיר התכופפה בזהירות העברת עוברים dechorionated agarose לתוך בארות. הימנעי מכל מגע של עוברים עם האוויר, הגורמת עוברים להתפוצץ. בואו העוברים להתפתח 28.5 מעלות צלזיוס בארות agarose עד 3 שעות שלאחר ההפריה, או hpf. 2. הגדרת מנגנון השתלה בעוד העוברים לפתח, להקים מנגנון ההשתלה על ידי חיבור מחט השתלה של שמן מינרלי מלא מערכת מיקרו שאיבה. ודא כי המערכת אינה נזילה ואין בועות אוויר לכודות במערכת. חזרה למלא את המחט השתלת שלם עם שמן מינרלי, למעט 0.5-1 μl של שטח בפתיחת קצה. 3. השתלה של בלסטומרים כדי השתלת בלסטומרים, השתמש בדיקה מיצוב זכוכית להתמצא הצד blastomere עוברים 3-4-hpf כלפי מעלה. ואז, בעדינות להכניס את המחט לתוך השתלת העובר תורם לאט להתחנף 5-20 בלסטומרים לתוך המחט. הכנס את המחט blastomere מלא לעובר מארח ולשחרר את בלסטומרים לאט. האתר שבו בלסטומרים משתחררים ישפיע שבו הצאצאים שלהם בתרגום בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר. כדי לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית, התאים לשחרר בקוטב בעלי חיים. במהלך ההשתלה, לוודא כי קצה מחט לא פנה האוויר. כדי למזער נזקים מכניים, עוברים המארח יהיה להשאיר את הבארות agarose ב 28.5 ° C עד למחרת. ואז, לאransfer את העוברים על פסיפס של 24 צלחות היטב מראש מצופה מ"ל 0.5 agarose של 1%, עם עובר אחד טוב כל אחד. 1 מ"ל מים ביצה E3 מתווסף גם כל אחד. כדי למנוע זיהומים חיידקיים, הוסף 10 μl של 100x פניצילין וסטרפטומיצין למים ביצה E3. יום 3. הטבעת הדמיה של עוברים לחיות פסיפס 1. הטבעת עוברים הכן 1.5% נקודת התכה נמוכה agarose (LMP) במים ביצה E3 ולשמור את פתרון אמבט מים 30 מעלות צלזיוס. העברת העובר פסיפס על צלחת תרבות FluoroDish רקמה עם תחתית כוס 0.17mm עובי (מכשירים העולם Precision). הסרה של עודפי מים E3 לעזוב את העובר מכוסה רק על ידי כמות מינימלית של E3. הוסף 30-50 μl LMP 1.5% נמס לעובר. במהירות למצב העין או המוח קרוב לתחתית הכוס ככל האפשר לפני הפתרון agarose מתמצק. לאחר הפתרון מתקרר, להוסיף פתרון נוסף agarose להמשיך לאבטח את העוברים במקום. לאחר מכן, לטבול את הקרושה agarose לחסום עם מים 2-3 ביצים E3 מ"ל. 2. Confocal הדמיה עבור מיקרוסקופיה confocal, מטרה הפוכה טבילה במים (אולימפוס, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, יפן) עם עומק מוקד גדול משמש. טיפת מים נוסף על המטרה ואז במקום רקמת FluoroDish תרבות צלחת על המטרה. כדי פיתוח תמונה, לבצע זמן לשגות הדמיה על ידי לקיחת תמונות של עוברים כל 5 דקות. בהתאם לאופי של ניסויים, מרווחי הזמן בין הזריקות צריך להיות מותאם. נציג תוצאות איור 2 ממחיש נציג 24-hpf דג הזברה פסיפס. ביטוי של GFP מדגיש את התאים התורם בירוק. התאים neuroepithelial רשתית טווח עובי כל קיר הרשתית. הסרט מראה את התנועות של תורם התאים במוח לארח בבית hpf 24. תאים מורפולוגיות שימו לב להשתנות עם הזמן. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. צורות של טיפים מחט ההשתלה. א פתיחת משופעים של קצה מחט היה חופשי של פסולת לאחר שוטף חומצה הידרופלואורית. ב הקצה המחודד נוצר בקצה המחט. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ויזואליזציה של ה-GFP-לבטא בתאי התורם עוברי דג הזברה chimeric ב hpf 24. הלוח השמאלי מציג את אותות ה-GFP במוח הרשתית. הלוח המרכזי הוא תמונה בשדה בהיר של העובר. הפאנל הימני מראה את התמונה הממוזג. סרט 1. הדמיה חיה של תאים GFP תורם חיובי הראו שינויים נרחבים מורפולוגיות של תאים neuroepithelial המוח במהלך ההתפתחות. מסגרות בודדות של הסרט נאספו כל 5 דקות בין 24 לבין 25 hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">לחץ כאן כדי לראות את הסרט</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה blastomere השתלת לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית דג הזברה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים, פשוט על ידי שחרור בלסטומרים התורם למקומות המתאימים את העוברים המארח. תיוג עם מולקולות ה-GFP התשואות רקע נקי יותר עם תיוג פלורסנט צבען מצומדות dextran (הו ו קיין 1990). הסיבה לכך היא פסולת של צבעים dextran מתאי התורם מת נמשך הרבה יותר זמן מאשר ה-GFP, ובכך הסיק עם הדמיה (קטלנו et al. 2007). בנוסף, ה-GFP חיובי התורם תאים...

E3 מים ביצה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 mM NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.17 mM KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.33 mM MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתילן כחול 0.1% </li></ul>

השתלה של ה-gfp-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

תאים לשנות בהרחבה במקומות ורכושם במהלך embryogenesis. שינויים אלה מוסדר על ידי יחסי הגומלין בין התאים לבין סביבתם. עוברים chimeric, אשר מורכב של תאים בעלי רקע גנטי שונה, הם כלי נהדר ללימוד תאים תאים אינטראקציות בתיווך גנים של עניין. השקיפות של דג הזברה העובריים בשלבים התפתחותיים מוקדם היתרי להדמיה ישירה של המורפוגנזה של רקמות ואיברים ברמה התאית. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול ליצור הרשתיות chimeric והמוח עוברי דג הזברה ולבצע הדמיה חיה של תאים התורם. פרוטוקול מכסה את הכנת מחטים ההשתלה, השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים התורמות GFP שלילי המארחים, ועל בחינה של התנהגות תורם התא תחת מיקרוסקופ confocal לחיות. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את ההתפתחות העוברית של רקמות ואיברים אחרים דג הזברה. היתרונות של שימוש GFP לתאי התורם התווית הם דנו גם.

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

תאים עוברים שינויים נרחבים במיקומם ובמאפייניהם במהלך העוברגנזה. שינויים אלו מותמרים על ידי האינטראקציות בין התאים לבין ה...

בלסטרים (Blasts) הם התאים העובריים הנוצרים במהלך שלב הפילוג של ההתפתחות. כאן, בלסטרים המסומנים ב-GFP מועברים מעוברית אחת של דג זברופי לעוברית אחרת באמצעות מחט השתקה. שיטה זו מאפשרת לעקוב באמצעות דימיון מיקרוסקופי חי אחר ההתנהגות וגורלם של בלסטרים עם רקע גנטי שונה בתוך עוברית תקינה, או להיפך.שלום, אני ד"ר זוראן מהמעבדה של ד"ר שאו במחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת פיטסבורג. היום נראה לכם הליך להעברה של חומרים ביולוגיים לעוברים של דג הזברה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התפתחות הרשתית והמוח.אם כן, בואו נתחיל. בשעות הערב, הגדירו הצלבות בזוגות של דגי זברה כדי למנוע הזדווגות אקראית. לפני הזמן הרצוי, השתמשו במחיצות כדי להפריד בין הדגים הזכרים והנקבות. כאן.דגים טרנסגניים המבטאים GFP משמשים כמקור לבלסטומרים תורמים. השבט הטרנסגני PT 1 0 4 מבטא GFP באופן גורף תחת בקרת הפרומוטר EF one. כדי להכין את בארי האגרוז שבהם יונחו העוברים, שפכו לתבנית פטרי תמיסת אגרוז 1% מומסת שהוכנה במי ביצים E three. הציפו על תמיסת האגרוז תבנית פלסטיק עם בליטות בצורת טריז.לאחר מכן הניחו לו להתקרר. כדי להקשיח בזהירות, הסירו את התבנית ושקעו את מצע ה-agros במים בטמפרטורה של E three. לאחר מכן, הכינו את מחטי ההשתלה.השתמשו במכשיר משיכה אנכי למחטים בהגדרת הספק 11.5 כדי למשוך פיפטים מקפילריים מזכוכית. חודי מחטי

transplantation-gfp-expressing-blastomeres-for-live-imaging-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

תאים מתים נמתחים מרקמות אפיתל על ידי התכווצות מתואמת של תאים שכנים מבלי לשבש תפקוד מחסום. בהירות אופטית של דג הזברה מתפתח מספק מערכת מצוינת להמחיש שחול לחיות epithelia. כאן אנו מתארים שיטות לגרום ו שחול התמונה האפידרמיס דג הזברה הזחל ברזולוציה הסלולר.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.

מערכת Tol2 של דג הזברה: גישת טרנסגנזה מודולרית וגמישה מבוססת שער

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

למד שיטת השתלה של תאי בלסטומרים מסומני GFP ליצירת עוברים כימריים בדג הזברה. שיטה זו מאפשרת מעקב חי אחר התנהגות תאית והתפתחות מוח ורשתית בעוברים.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

גלה סרטונים נוספים