השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

בלייר הם התאים העובריים הנוצרים בשלב המחשוף של ההתפתחות. כאן GFP המסומן בבלייר מועבר מעובר דג זברה אחד למשנהו באמצעות מחט השתלה. שיטה זו מאפשרת לעקוב אחר התנהגותם וגורלם של מגדפים עם רקע גנטי שונה בעובר רגיל אחרת או להיפך על ידי הדמיה מיקרוסקופית חיה.

היי, אני ד"ר צורן, המעבדה של ד"ר שו במחלקה לרפואת עיניים באוניברסיטת פיטסבורג. היום נראה לך נוהל להובלת חזה בדג הזברה. אנו משתמשים בהליך הזה במעבדה שלנו כדי לחקור את הרשתית ואת התפתחות המוח.

אז בואו נתחיל. בערב, הגדר הכלאות זוגיות של דג זברה כדי למנוע הזדווגות אקראית. לפני הזמן הרצוי, השתמש במפרידים כדי להפריד בין הדג הנקבה לזכר. הנה.

דגים טרנסגניים המבטאים GFP משמשים כמקור לבלסטומרים תורמים. הקו הטרנסגני PT 1 0 4 מבטא GFP בכל מקום בשליטת מקדם EF one להכנת בארות האגרוס שיחזיקו את העוברים לשפוך 1% אגרוס מומס שהוכן במי ביצים E שלוש לתוך צלחת פטרי. צף תבנית פלסטיק עם בליטות בצורת טריז על תמיסת האגרוס.

ואז תן לזה להתקרר. כדי להתמצק בזהירות, הסר את התבנית וטבל את מצע האגרוס במים E שלוש. לאחר מכן, הכינו את מחטי ההשתלה.

השתמש במושך מחט אנכי בהגדרת הספק 11.5 כדי למשוך פיפטות נימיות מזכוכית. קצות מחט טובים צריכים להתחדד עם פירים ארוכים. טוחנים את קצות המחט בזווית של 45 מעלות בעזרת מטחנת מיקרו עד לקבלת פתחים משופעים בקוטר פנימי של 30 עד 40 מיקרומטר

כדי לנקות את קצות המחט, חבר צינור לקצה הבוטה, חבר את הצינור למזרק ואז למצוץ ולשחרר תמיסת חומצה הידרופלואורית של 10%. עד להסרת כל הפסולת הנראית לעין. שוטפים את הקצוות במים מזוקקים.

לאחר מכן עם 100% אתנול, יבש את המחטים באוויר עד שכל האתנול מתאדה. חשוב לוודא שהטיפים יבשים לחלוטין. שאריות אתנול יהרסו את המחטים במהלך הליטוש בטמפרטורה גבוהה.

שלב שני, כדי לרכך וללטש את הקצוות המחוספסים של קצות המחט, אופים אותם בחום שנוצר על ידי נימה של מיקרו זייפן. אל תתנו לקצות המחט לגעת בחוט תוך כדי ליטוש כמות החשמל העוברת דרך החוט והמרחק בין החוט למחט. ניתן לכוונן טיפים כדי להשיג תנאי חימום רצויים.

הטמפרטורה לא צריכה להיות גבוהה מדי. זה ימיס ויעוות את קצות המחט לאחר החלקת הקצוות המחוספסים. גע בזהירות בחוט המחומם עם קצה המחט ולאחר מכן משוך בעדינות את החוט כדי ליצור קצה מחודד.

מחט חדה, חלקה ונקייה היא קריטית להשגת פיצוצים שלמים מתורם מבלי לפגוע בעוברים המארחים. משוך פיפטה מזכוכית מעל להבת גז כדי ליצור בדיקת זכוכית עדינה עם קצה מוחלק. בדיקה זו תשמש למיקום העוברים בכיוון הנכון לפני ההשתלה.

ביום הניסוי, הסירו את המחיצות בקלטות הצולבות כדי לאפשר לדגים להזדווג. שמונה. לאחר 30 דקות, אספו 100 עד 200 עוברים על ידי שפיכתם לרשת. מניחים את העוברים בצלחת פטרי מלאה ב-E שלושה מים.

לאחר מכן באמצעות מלקחיים עדינים, דק את העוברים על ידי תלישה ידנית של ה-CORs. לאחר מכן השתמש בפיפטה מזכוכית עם פיר כפוף כדי להעביר בזהירות את העוברים המצופים לבארות ארוס. אל תתנו לעוברים לבוא במגע עם אוויר, מה שיגרום להם להתפוצץ.

אפשר לעוברים להתפתח ב-28.5 מעלות צלזיוס בבארות הארוס עד שלוש שעות לאחר ההפריה או HPF בזמן שהעוברים מתפתחים. הקים מנגנון השתלה על ידי חיבור מחט ההשתלה למערכת שאיבה מיקרו מלאה בשמן מינרלי. ודא שהמערכת אינה דולפת ואין בה בועות אוויר כלואות.

מלאו מחדש את כל מחט ההשתלה בשמן מינרלי למעט 0.5 עד מיקרוליטר אחד של חלל בפתח הקצה. הוציאו את העוברים מהחממה והניחו אותם על במת מיקרוסקופ להשתלת חילול הקודש. השתמש בבדיקת מיקום זכוכית כדי לכוון את צד חילול הקודש של שלושה עד ארבעה עוברי HPF כלפי מעלה.

לאחר מכן הכנס בעדינות את מחט ההשתלה לעובר תורם ומצוץ לאט חמישה עד 20 חילול הקודש לתוך המחט, וודא שקצה המחט אינו נוגע באוויר במהלך ההשתלה. הכנס את המחט המלאה בחילול הקודש לעובר מארח ושחרר את חילול הקודש לאט. האתר בו משוחררים המגדפים ישפיע על המקום שבו צאצאיהם מתמקמים בשלבי התפתחות מאוחרים יותר כדי לנתח תאי שחרור רשתית ומוח בקוטב החיה.

אם יש לנתח את התפתחותם של רקמות ואיברים אחרים, יישקלו מיקומי שחרור שונים בהתאם. כדי למזער את הנזק המכני במהלך ההשתלה, העוברים המארחים נותרים בבארות האגרוס בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד למחרת. לאחר מכן העבירו את עוברי הפסיפס ל-24 צלחות באר מצופות מראש ב-0.5 מיליליטר של 1% וממולאות במיליליטר אחד של מי ביצים E שלוש.

יש להוסיף עובר אחד לכל באר כדי למנוע זיהומים חיידקיים ב-10 מיקרוליטר של 100 x פניצילין וסטרפטומיצין. לכל אחד מהם, שקלו היטב והכינו נקודת התכה נמוכה או LMP aros ושמרו את התמיסה באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס. העבירו עובר פסיפס לצלחת צמחייה עם תחתית זכוכית בעובי 0.17 מילימטר.

הסר את עודפי המים של E 3 כדי להשאיר את העובר מכוסה בלבד. לאחר מכן ב-30 עד 50 מיקרוליטר של 1.5% LMP מומס לעובר במהירות לפני שתמיסת ה-ARO מתמצקת. מקם את העין או המוח קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית.

לאחר שהתמיסה מתקררת, הוסף תמיסת אגרוס נוספת כדי לאבטח עוד יותר את העוברים במקומם. טבלו את גוש האגרוס המוצק בשניים עד שלושה מיליליטר של מי ביצים E שלוש למיקרוסקופיה קונפוקלית. נעשה שימוש במטרה הפוכה של טבילה במים פי 40 עם עומק מיקוד גדול.

הוסף טיפת מים על המטרה והניח צלחת תרבית רקמות פלורה על הבמה והתמקד בפיתוח תמונה. בצע הדמיה בהילוך מהיר על ידי צילום תמונות של העוברים כל חמש דקות. בהתאם לאופי הניסויים, ניתן להתאים את מרווחי הזמן בין הזריקות.

כאן מוצגת תמונה מייצגת של דג סבר 24 HPF. ביטוי GFP מדגיש את התאים התורמים בירוק. תאי האפיתל העצביים של הרשתית משתרעים על פני כל עובי דופן הרשתית.

סרטון זה מראה את תנועות התאים התורמים במוח המארח ב-24 HPF. שימו לב שמורפולוגיה של התאים משתנה עם הזמן. פשוט הראה לך כיצד לבצע הובלת מראה חזה בדג הזברה.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להכין מחט טובה על אזור השד המושתל בעדינות. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.